Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH

La leche materna humana (BM) se compone de células maternas que son >90% viables¹. La composición celular se ve fuertemente afectada por la etapa de la lactancia, el estado de salud de la madre y el bebé, y la variación individual, que sigue siendo mal entendido^1,2,3,4. Dado que BM contiene 10³x 10⁵ leucocitos/ml, se puede estimar que los lactantes amamantados ingien de 10⁵a 10⁸ leucocitos maternos diariamente⁵. Varios estudios in vivo han demostrado que los leucocitosmaternos proporcionan inmunidad crítica al bebé y son funcionales mucho más allá de estos sitios de ingestión inicial^{5,6,7 ,9,10,11}. Todas las células de origen materno ingeridas por el bebé tienen el potencial de realizar funciones inmunitarias junto a los leucocitos 12 o para compensar los propios leucocitos del bebé^12.

La transmisión de madre a hijo (MTCT) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sigue siendo una crisis en los países con recursos limitados. Dado que las enfermedades diarreicas y respiratorias son responsables de tasas sustanciales de mortalidad entre los lactantes en los países con recursos limitados, y estas enfermedades se reducen significativamente mediante la lactancia materna exclusiva, los beneficios para las madres infectadas por el VIH la lactancia materna supera con creces los riesgos^13,14,15. A menos que el acceso al agua potable y a la leche adecuada para lactantes sea fiable, la OMS no recomienda el cese de la lactancia materna para las madres infectadas por el VIH¹⁶. Aproximadamente 100.000 MTCTs a través de BM ocurren anualmente; sin embargo, sólo el 15 % de los lactantes amamantados por sus madres infectadas por el VIH se infectan, lo que sugiere un fuerte efecto protector de BM^{17,18,19,20,21}. Numerosos factores probablemente funcionan en conjunto para prevenir la transmisión. Es importante destacar que los anticuerpos específicos del VIH (Abs) en BM se han correlacionado con la reducción de la MTCT y/o la reducción de la muerte infantil por infección por VIH^22,23. Lo que queda en gran medida poco claro es la contribución de la fracción celular de BM a sus cualidades antivirales.

Muchos Abs facilitan una variedad de actividades antivirales mediadas por la región "constante" de la molécula de inmunoglobulina, el fragmento cristalable (Fc), a través de la interacción con los receptores Fc (FCR) que se encuentran en prácticamente todas las células inmunitarias, prácticamente todas las cuales se encuentran en bm²⁴humano. La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) se ha demostrado como necesaria para el aclaramiento de infecciones virales y se ha estudiado en el caso de la prevención del MTCT del VIH^{25,26,27, 28 , 29}. Dada la escasez de conocimientos sobre la posible contribución de la actividad de ADCP por parte de los fagocitos BM a la prevención del MTCT del VIH, nuestro objetivo era desarrollar un método riguroso para aislar las células de la BM humana con el fin de llevar a cabo un estudio de ADCP mediado por células de BM obtenido en varias etapas de la lactancia.

Cada participante en este estudio fue reclutado y entrevistado de acuerdo con la aprobación de la junta de revisión ética e institucional (IRB) con la orientación y autorización del Programa para la Protección de Los Sujetos Humanos (PPHS) del Monte Sinaí utilizando un protocolo para la obtención de muestras de leche materna.

1. Preparación de la microesfera objetivo

1. Seleccione un antígeno objetivo relevante.
   NOTA: En este ejemplo, se utilizó la proteína recombinante V1V2-2F5K, que fue diseñada para imitar el ápice trimé de la envolvente nativa del VIH³⁰.
2. Realizar biotinylación utilizando un kit comercial (Tabla de Materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   1. Calcular el mmol del reactivo de biotina para añadir a la reacción por un exceso molar de 5 veces utilizando la fórmula: biotina mmol x (proteína mg/ml) x (proteína mmol biotina/proteína mg) x (5 mmol biotina/proteína mmol)^30,31. A continuación, calcule el l del reactivo de biotina para agregar utilizando la fórmula: biotina de L a biotina mmol x (1.000.000 de L/L) x (L/10 mmol).
   2. Equilibrar la biotina a temperatura ambiente antes de abrir. Disolver la proteína en 0,5 x 2,0 ml de solución salina con fosfato (PBS) según el cálculo realizado anteriormente.
   3. Preparar una solución de 10 mM de reactivo de biotina en dimetilsulfóxido (DMSO) y añadir el volumen adecuado de reactivo de biotina de 10 mM a la solución proteica, e incubar la reacción en hielo durante 2 h o a temperatura ambiente durante 30 min.
3. Eliminar el exceso de biotina utilizando concentradores de proteínas (membranas de poliétersulfone [PES], corte de peso molecular de 3 kDa [MWCO], 0,5 ml; Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Deposite la muestra en la cámara superior de la columna de centrifugado y agregue PBS hasta 400 l. Tapa, luego inserte esta cámara de muestra en un tubo de recolección. Centrífuga a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 30 min.
   2. Deseche el flujo y agregue PBS a 400 l. Repita la centrifugación. Deseche el flujo y agregue PBS a 100 ol. Mida la concentración de proteínas por un espectrofotómetro.
      NOTA: La proteína se puede alícite y congelar a -80 oC hasta que se utilice.

2. Preparación de la placa de ensayo de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP)

1. Conjugar proteína biotinilada a 1 m de microesferas ('perlas'; Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Por placa de perlas conjugadas, incubar 6 g de proteína con 12 ml de perlas de stock en 200 ml de albúmina sérica bovina (BSA) albúmina bovina (BSA)-PBS a temperatura ambiente durante 1 h, vórtice suavemente cada 20 minutos.
   2. Centrifugar a 13.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, el vórtice suavemente y resuspende en 1200 s de 0,1% de BSA-PBS. Repita el giro y lave el paso 2x. Resuspender en 1200 l de 0,1% de BSA-PBS.
2. Aliquot 10 l de solución de perlas por pozo en una placa redonda inferior de 96 pocillos. Preparar diluciones de anticuerpos o sueros inmunes de interés en 12 ml de 2% de HBSS HSA al 2%, normalmente a partir de 50 g/ml de anticuerpo o una dilución sérica de 1/100.
   NOTA: En los datos de la muestra, se utilizó el anticuerpo monoclonal (mAb) 830A.
3. Añadir 10 l de anticuerpo/sera valorado a la placa de cuentas e incubar durante 2 h a 37 oC. Añadir 200 s de 2% HSA HBSS a cada pozo y placa centrífuga a 2.000 x g durante 10 min.
4. Retire con cuidado el sobrenadante mediante un rápido vuelco y decantación de líquido de los pozos de la placa en un fregadero para evitar perturbar el pellet de perlas invisible.

3. Aislamiento de células de leche materna

1. Obtener leche materna humana de mujeres lactantes saludables, expresada mediante bombas electrónicas o manuales dobles. Aísle las células dentro de los 4 h de expresión, manteniendo la leche a temperatura ambiente.
2. Usando tubos de 50 ml, centrifugar 50 ml de leche a 800 x g durante 15 minutos. Verter cuidadosamente la leche desnatada y la grasa sin alterar el pellet celular. Limpie el interior del tubo con una toallita sin pelusas para eliminar toda la grasa de la pared del tubo.
3. Añadir 10 ml de albúmina sérica humana al 2% en la solución salina equilibrada de Hank (2% HbSS HSA [sin Ca²⁺ o Mg⁺]). Resuspenda el pellet pipeteando suavemente para evitar la activación celular y la apoptosis. Pasar a un tubo de 15 ml y centrífuga a 450 x g durante 10 min.
4. Vierta el sobrenadante y repita el paso 1.3. Luego, resuspenda suavemente las células en 1 x 2 ml de 2% de HBSS HSA del 2% dependiendo del número de celda esperado, y cuente las células por un hemocitómetro o un contador de células automatizado, observando también la viabilidad celular.

4. Ensayo ADCP

NOTA: Los métodos descritos aquí están adaptados de Ackerman et al.³².

1. Agregue 50.000 células BM recién aisladas a cada placa de ensayo ADCP bien en 200 s de 2% de HSA-HBSS al 2%. Incubar durante 2 h a 37oC.
   1. Para los experimentos de control, preincubar células a 37 oC con inhibidor de la actina de 10 g/ml (citochalasina-D), agente de bloqueo fcR de 50 g/ml (FcBlock) o una combinación de ambas antes de su adición a las placas.
2. Placa de centrífuga a 930 x g durante 10 min. Añadir 200 ml de 2% HbSS HSA y centrifugación repetida. Retire con cuidado el sobrenadante como en el paso 2.7 y repita el lavado.
3. Retire cuidadosamente las células de sobrenadant y mancha para su viabilidad utilizando una mancha de viabilidad fijable de 0,5 g/ml (concentración final) 450 por pocal en 50 ml de 2% de HBSS de HSA al 2%. Incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Placa centrífuga a 930 x g durante 10 min y retire el sobrenadante como en el paso 2.7. Añadir 200 l de 2% de HBSS HSA 2% y placa centrífuga de nuevo seguido de la eliminación del sobrenadante como en el paso 2.7.
4. Después de la mancha de viabilidad, las células de mancha para los marcadores de leucocitos de interés, incluyendo mínimamente una mancha específica de CD45 como CD45 antihumano de ratón PE (clon HI30) a una concentración optimizada (1 g/L en 50 éL de 1% BSA HBSS en los datos de ejemplo).
   NOTA: Se pueden incluir marcadores de interés específicos del linaje.
5. Incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Placa centrífuga a 930 x g durante 10 min y retire el sobrenadante como en el paso 2.7. Añadir 200 s de 1% de HBSS BSA y centrifugación repetida. Retire el sobrenadante. Fijar las células en 200 l de formaldehído al 0,5% en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4 oC. Refrigere en la oscuridad hasta el análisis.

5. Análisis por citometría de flujo

1. Realice el gating inicial para eliminar los dobletes en una gráfica y los desechos de dispersión hacia delante (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) (material más pequeño que FSC 5000) (véase la figura 1). Utilice una gráfica de mancha de Viabilidad (V450 en este caso) para eliminar las células muertas (aquellas que son positivas para la mancha de viabilidad).
2. Utilice una gráfica SSC frente a CD45 para diferenciar las principales clases de leucocitos (granulocitos, monocitos, linfocitos) como se describe ampliamente^33,34.
   NOTA: Esta clasificación solo es sugerente y se necesitan marcadores específicos de linaje para confirmar el tipo de celda.
3. Para todas las células CD45+, o para cada subconjunto de leucocitos de interés, mida la actividad de ADCP haciendo un marcador en las células positivas en un histograma del canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC), donde se detectan los granos fluorescentes.
   NOTA: Los pozos de control negativos en los que no se agregaron cuentas indicarán dónde las celdas positivas de cordón son evidentes en el histograma y, por lo tanto, dónde colocar el marcador de gating.
4. Calcular las puntuaciones adCP como (intensidad media de fluorescencia [MFI] de células positivas de perlas) x (% del total de CD45 + células en la población positiva). Utilice el software de gráficos para trazar puntuaciones en cada concentración de Ab/suero y para realizar un análisis de área bajo la curva (AUC).
   NOTA: El ADCP se considera positivo si el AUC es mayor que 3 veces la desviación estándar del AUC de puntuación ADCP de un mAb de control negativo no específico (en este caso, 3865).

La leche se puede mantener a temperatura ambiente o más fría (aunque no congelada); sin embargo, dado que hemos observado una menor viabilidad cuando la leche se ha mantenido muy fría (los datos no se muestran), y que es más sencillo recoger, almacenar brevemente y transportar a temperatura ambiente, se recomienda que las muestras no se refrigeran para reducir variabilidad de muestra a muestra. En la leche obtenida 7-183 días después del parto, la concentración celular determinada por el contador celular automatizado osciló entre 16.083 y 222.857 células/ml. La Figura 1 ilustra la estrategia de gating eliminando dobletes, escombros y células muertas. La viabilidad fue del 90 al 99 %. Aproximadamente 1,6-12,3% del total de células vivas fueron CD45+ leucocitos (Tabla 1). La mayoría de los supuestos monocitos parecían ser precursores/células inmaduras como se describió anteriormente, basado en el sugerente SSC vs. CD45 gating34. Los supuestos monocitos se definieron como SSCbajo intermedio/CD45bajo,aunque pocos mostraron los niveles más altos de tinción CD45 distintos de la población de linfocitos supuestamente (SSCbajo/ CD45bajo) más típicamente asociados con monocitos sanguíneos(Figura 1),similar a los estudios anteriores33,34. Los supuestas granulocitos se definieron como SSChigh/CD45intermedio33,34 ( Tabla1). Tenga en cuenta que esta clasificación solo es sugerente y que se necesitarían marcadores específicos del linaje para confirmar el tipo de celda.

La actividad ADCP de las células BM recién aisladas se midió utilizando el mAb 830A humano específico del VIH, que es específico para la región V2 del sobre del VIH y se une al antígeno V1V2-2F5K probado aquí. La actividad del ADCP se midió para el ejemplo aquí utilizando leche obtenida a 1 mes después del parto(Figura 2A). Los datos de ejemplo muestran los histogramas FITC esperados (cuentas+) que se ven al realizar el paso en las celdas CD45+ (se muestran los datos generados con 1 mAb de g/mL). Los marcadores negros indican las poblaciones utilizadas para calcular las puntuaciones ADCP. En la muestra se muestran los datos 830A (primer panel de la Figura 2A),se muestran el porcentaje de células CD45+ y la fluorescencia media de esa población, que se utilizaron para calcular la puntuación del ADCP utilizando la ecuación del paso 3.4. Las células preincubadas con las perlas inhibidoras de la actina de citoclasina-D (citod) y/o Abs de bloqueo de FcR (FcBlock) antes de su incubación con las perlas acopladas con Ab/antígeno mostraron actividad ADCP a nivel del control mAb 3865 o inferior, lo que indica que ADCP era FcR y dependiente de la actina(Figura 2). La puntuación adCP determinada para el total de CD45+ células fue de 25 a 35 veces por encima de los niveles de fondo definidos mediante el control negativo anti-ántrax mAb 3865. Cada subconjunto principal también se analizó por separado. Los supuestas granulocitos mostraron una actividad de ADCP de 12 a 29 veces más que el fondo. El supuesto monocitos ADCP fue de 2 a 3 veces por encima del fondo(Figura 2). Los supuestos linfocitos como se esperaba no mostraron ninguna actividad MENsurable de ADCP (menos de 3 x desviación estándar de la puntuación ADCP AUC del control negativo no específico mAb 3865; datos no mostrados).

Figura 1: Datos de citometría de flujo de muestra de células aisladas de la leche materna. Las celdas se procesaron y se tiñieron como se describe en el protocolo. (A) Las células individuales fueron cerradas para eliminar los dobletes en una gráfica FSC-H vs FSC-A como se muestra, también atravesando los pequeños desechos <5,000 en FSC-A. (B) Esta población se utilizó para gatear en células vivas (que no manchan con el tinte de viabilidad) en una gráfica SSC vs. (C) Estas células vivas se utilizaron en una gráfica FSC frente a SSC. Se destaca la posición esperada de los no leucocitos, que probablemente son predominantemente células epiteliales mamarias, ("E"). (D) La misma gráfica FSC frente a SSC solo se muestra con celdas CD45+. Los principales subconjuntos de leucocitos observados son sólo identidades supuestas basadas en parámetros sSC bien establecidos y esperados (G - granulocitos; M - monocitos; L - linfocitos). (E) Se utilizaron células viables para una gráfica SSC frente a CD45 con los principales subconjuntos de leucocitos observados. El back-gating de esta gráfica produjo los datos mostrados en el panel D. Tenga en cuenta que esta clasificación sólo es sugerente y que se necesitan marcadores específicos del linaje para confirmar el tipo de celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Muestra datos de ADCP utilizando células aisladas de la leche materna. El ensayo ADCP realizado se basa en el ensayo adaptado de Ackerman et al.30. El ensayo se realizó como se describe en el protocolo anterior. (A) Muestra histogramas FITC a 1 g/mL mAb, con marcadores que indican las poblaciones de cordón/FITC+ utilizadas para determinar la puntuación ADCP. Las puntuaciones se calcularon como (MFI de células positivas de perlas) x (% del total de CD45+ células en la población positiva de cordón/FITC+). El primer panel que utiliza mAb 830A por sí solo también indica el porcentaje del total de células CD45+ y el valor medio de intensidad de fluorescencia utilizado para calcular la puntuación ADCP en ese ejemplo. (B) las puntuaciones ADCP en cada ensayo de dilución mAb se utilizaron para calcular valores de área bajo la curva (AUC) en software gráfico. Para los experimentos de control, la citochalasina-D del inhibidor de la actina (citod), el agente de bloqueo de FcR (FcBlock) o una combinación de ambos se preincubaron con células antes de su adición a los complejos inmunitarios (ver leyendas). Tenga en cuenta que esta clasificación de celda solo es sugerente y que se necesitan marcadores específicos del linaje para confirmar el tipo de celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Ejemplos de recuentos y características típicas de las células de leche materna.

Los autores no tienen nada que revelar.