La leche materna transmite el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), aunque sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque estas células están poco estudiadas. Aquí describimos el aislamiento de los leucocitos de la leche materna y un análisis de su capacidad fagocítica.
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Artículo de método
Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH
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Resumen
Resumen
Incluso en ausencia de medicamentos antirretrovirales, sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan, lo que sugiere un fuerte efecto protector de la leche materna (BM). A menos que el acceso al agua potable y a la leche maternizada adecuada para lactantes sea fiable, la OMS no recomienda el cese de la lactancia materna de las madres infectadas por el VIH. Numerosos factores probablemente funcionan en tándem para reducir la transmisión de BM. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque lo que queda en gran medida poco claro es la contribución de estas células a las cualidades antivirales de BM. Actualmente teníamos como objetivo aislar las células de BM humano con el fin de medir fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), una de las respuestas inmunitarias innatas más esenciales y generalizadas, por los fagocitos BM contra los objetivos del VIH. Las células se aislaron a partir de 5 muestras de BM humanas obtenidas en varias etapas de la lactancia. El aislamiento se llevó a cabo a través de una centrifugación suave seguida de una cuidadosa eliminación de la grasa de la leche y el lavado repetido del pellet celular. Las perlas fluorescentes recubiertas con sobre vih (Env) se utilizaron como dianas para el análisis de ADCP. Las células se teñían con el marcador de superficie CD45 para identificar leucocitos. Se encontró que la actividad del ADCP era significativa por encima de los experimentos de control y reproducible utilizando un anticuerpo 830A específico para el VIH.
Introducción
La leche materna humana (BM) se compone de células maternas que son >90% viables1. La composición celular se ve fuertemente afectada por la etapa de la lactancia, el estado de salud de la madre y el bebé, y la variación individual, que sigue siendo mal entendido1,2,3,4. Dado que BM contiene 103x 105 leucocitos/ml, se puede estimar que los lactantes amamantados ingien de 105a 108 leucocitos maternos diariamente5. Varios estudios in vivo han demostrado ....
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Protocolo
Cada participante en este estudio fue reclutado y entrevistado de acuerdo con la aprobación de la junta de revisión ética e institucional (IRB) con la orientación y autorización del Programa para la Protección de Los Sujetos Humanos (PPHS) del Monte Sinaí utilizando un protocolo para la obtención de muestras de leche materna.
1. Preparación de la microesfera objetivo
- Seleccione un antígeno objetivo relevante.
NOTA: En este ejemplo, se utilizó la proteína recombinante V1V2-2F5K, que fue diseñada para imitar el ápice trimé de la envolvente nativa del VIH30. - Reali....
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Resultados
La leche se puede mantener a temperatura ambiente o más fría (aunque no congelada); sin embargo, dado que hemos observado una menor viabilidad cuando la leche se ha mantenido muy fría (los datos no se muestran), y que es más sencillo recoger, almacenar brevemente y transportar a temperatura ambiente, se recomienda que las muestras no se refrigeran para reducir variabilidad de muestra a muestra. En la leche obtenida 7-183 días después del parto, la concentración celular determinada por el .......
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Discusión
La técnica basada en citometría de flujo para medir la actividad de ADCP descrita en este documento se describió por primera vez en 201130 y desde entonces se ha demostrado robusta y citada en más de 80 estudios. El protocolo descrito aquí adapta esta técnica para su uso con células BM primarias por primera vez. Estudios previos de funcionalidad mediada por Fc por células BM se han limitado en gran medida a la medición de ráfagas oxidativas o ensayos de fagocitosis basados en histología utilizando.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Dra. Susan Zolla-Pazner en el Departamento de Medicina y departamento de microbiología de la Escuela de Medicina de Icahn en Mount Sinai por su revisión manuscrita. El NIH/NICHD proporcionó financiación para este proyecto con el número de subvención R21 HD095772-01A1. Además, R. Powell fue apoyado por fondos del Departamento de Medicina, División de Enfermedades Infecciosas, Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 y micro; m Microesferas marcadas con FluoSpheres NeutrAvidin | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Ratón Anti-Humano CD45 | BD | 560975 | |
| Albúmina de suero bovino MP | Biomedicals | 8810025 | |
| Corning Placa de poliestireno de fondo en V de 96 pocillos | Corning | 3894 | |
| Citochalasina D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de biotina | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos Corning | |||
| Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos | Corning | 352070 | |
| Mancha de viabilidad reparable 450 | BD | 562247 | |
| Solución de formaldehído | Sigma 252549 | ||
| HBSS sin calcio, magnesio o fenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Humano BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Albúmina sérica humana | MP Biomedicals 2191349 | ||
| Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Pipetas serológicas de poliestireno 10 mL | Corning | 4488 | |
| Concentradores de Proteínas PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
Referencias
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrit....
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Reimpresiones y permisos
