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Artículo de método

Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH

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DOI:

10.3791/60149

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6 de septiembre de 2019

 , 
1Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

En este artículo

Resumen

La leche materna transmite el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), aunque sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque estas células están poco estudiadas. Aquí describimos el aislamiento de los leucocitos de la leche materna y un análisis de su capacidad fagocítica.

Resumen

Incluso en ausencia de medicamentos antirretrovirales, sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan, lo que sugiere un fuerte efecto protector de la leche materna (BM). A menos que el acceso al agua potable y a la leche maternizada adecuada para lactantes sea fiable, la OMS no recomienda el cese de la lactancia materna de las madres infectadas por el VIH. Numerosos factores probablemente funcionan en tándem para reducir la transmisión de BM. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque lo que queda en gran medida poco claro es la contribución de estas células a las cualidades antivirales de BM. Actualmente teníamos como objetivo aislar las células de BM humano con el fin de medir fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), una de las respuestas inmunitarias innatas más esenciales y generalizadas, por los fagocitos BM contra los objetivos del VIH. Las células se aislaron a partir de 5 muestras de BM humanas obtenidas en varias etapas de la lactancia. El aislamiento se llevó a cabo a través de una centrifugación suave seguida de una cuidadosa eliminación de la grasa de la leche y el lavado repetido del pellet celular. Las perlas fluorescentes recubiertas con sobre vih (Env) se utilizaron como dianas para el análisis de ADCP. Las células se teñían con el marcador de superficie CD45 para identificar leucocitos. Se encontró que la actividad del ADCP era significativa por encima de los experimentos de control y reproducible utilizando un anticuerpo 830A específico para el VIH.

Introducción

La leche materna humana (BM) se compone de células maternas que son >90% viables1. La composición celular se ve fuertemente afectada por la etapa de la lactancia, el estado de salud de la madre y el bebé, y la variación individual, que sigue siendo mal entendido1,2,3,4. Dado que BM contiene 103x 105 leucocitos/ml, se puede estimar que los lactantes amamantados ingien de 105a 108 leucocitos maternos diariamente5. Varios estudios in vivo han demostrado que los leucocitosmaternos proporcionan inmunidad crítica al bebé y son funcionales mucho más allá de estos sitios de ingestión inicial5,6,7 ,9,10,11. Todas las células de origen materno ingeridas por el bebé tienen el potencial de realizar funciones inmunitarias junto a los leucocitos 12 o para compensar los propios leucocitos del bebé12.

La transmisión de madre a hijo (MTCT) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sigue siendo una crisis en los países con recursos limitados. Dado que las enfermedades diarreicas y respiratorias son responsables de tasas sustanciales de mortalidad entre los lactantes en los países con recursos limitados, y estas enfermedades se reducen significativamente mediante la lactancia materna exclusiva, los beneficios para las madres infectadas por el VIH la lactancia materna supera con creces los riesgos13,14,15. A menos que el acceso al agua potable y a la leche adecuada para lactantes sea fiable, la OMS no recomienda el cese de la lactancia materna para las madres infectadas por el VIH16. Aproximadamente 100.000 MTCTs a través de BM ocurren anualmente; sin embargo, sólo el 15 % de los lactantes amamantados por sus madres infectadas por el VIH se infectan, lo que sugiere un fuerte efecto protector de BM17,18,19,20,21. Numerosos factores probablemente funcionan en conjunto para prevenir la transmisión. Es importante destacar que los anticuerpos específicos del VIH (Abs) en BM se han correlacionado con la reducción de la MTCT y/o la reducción de la muerte infantil por infección por VIH22,23. Lo que queda en gran medida poco claro es la contribución de la fracción celular de BM a sus cualidades antivirales.

Muchos Abs facilitan una variedad de actividades antivirales mediadas por la región "constante" de la molécula de inmunoglobulina, el fragmento cristalable (Fc), a través de la interacción con los receptores Fc (FCR) que se encuentran en prácticamente todas las células inmunitarias, prácticamente todas las cuales se encuentran en bm24humano. La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) se ha demostrado como necesaria para el aclaramiento de infecciones virales y se ha estudiado en el caso de la prevención del MTCT del VIH25,26,27, 28 , 29. Dada la escasez de conocimientos sobre la posible contribución de la actividad de ADCP por parte de los fagocitos BM a la prevención del MTCT del VIH, nuestro objetivo era desarrollar un método riguroso para aislar las células de la BM humana con el fin de llevar a cabo un estudio de ADCP mediado por células de BM obtenido en varias etapas de la lactancia.

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Protocolo

Cada participante en este estudio fue reclutado y entrevistado de acuerdo con la aprobación de la junta de revisión ética e institucional (IRB) con la orientación y autorización del Programa para la Protección de Los Sujetos Humanos (PPHS) del Monte Sinaí utilizando un protocolo para la obtención de muestras de leche materna.

1. Preparación de la microesfera objetivo

  1. Seleccione un antígeno objetivo relevante.
    NOTA: En este ejemplo, se utilizó la proteína recombinante V1V2-2F5K, que fue diseñada para imitar el ápice trimé de la envolvente nativa del VIH30.
  2. Realizar biotinylación utilizando un kit comercial (Tabla de Materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    1. Calcular el mmol del reactivo de biotina para añadir a la reacción por un exceso molar de 5 veces utilizando la fórmula: biotina mmol x (proteína mg/ml) x (proteína mmol biotina/proteína mg) x (5 mmol biotina/proteína mmol)30,31. A continuación, calcule el l del reactivo de biotina para agregar utilizando la fórmula: biotina de L a biotina mmol x (1.000.000 de L/L) x (L/10 mmol).
    2. Equilibrar la biotina a temperatura ambiente antes de abrir. Disolver la proteína en 0,5 x 2,0 ml de solución salina con fosfato (PBS) según el cálculo realizado anteriormente.
    3. Preparar una solución de 10 mM de reactivo de biotina en dimetilsulfóxido (DMSO) y añadir el volumen adecuado de reactivo de biotina de 10 mM a la solución proteica, e incubar la reacción en hielo durante 2 h o a temperatura ambiente durante 30 min.
  3. Eliminar el exceso de biotina utilizando concentradores de proteínas (membranas de poliétersulfone [PES], corte de peso molecular de 3 kDa [MWCO], 0,5 ml; Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    1. Deposite la muestra en la cámara superior de la columna de centrifugado y agregue PBS hasta 400 l. Tapa, luego inserte esta cámara de muestra en un tubo de recolección. Centrífuga a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Deseche el flujo y agregue PBS a 400 l. Repita la centrifugación. Deseche el flujo y agregue PBS a 100 ol. Mida la concentración de proteínas por un espectrofotómetro.
      NOTA: La proteína se puede alícite y congelar a -80 oC hasta que se utilice.

2. Preparación de la placa de ensayo de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP)

  1. Conjugar proteína biotinilada a 1 m de microesferas ('perlas'; Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    1. Por placa de perlas conjugadas, incubar 6 g de proteína con 12 ml de perlas de stock en 200 ml de albúmina sérica bovina (BSA) albúmina bovina (BSA)-PBS a temperatura ambiente durante 1 h, vórtice suavemente cada 20 minutos.
    2. Centrifugar a 13.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, el vórtice suavemente y resuspende en 1200 s de 0,1% de BSA-PBS. Repita el giro y lave el paso 2x. Resuspender en 1200 l de 0,1% de BSA-PBS.
  2. Aliquot 10 l de solución de perlas por pozo en una placa redonda inferior de 96 pocillos. Preparar diluciones de anticuerpos o sueros inmunes de interés en 12 ml de 2% de HBSS HSA al 2%, normalmente a partir de 50 g/ml de anticuerpo o una dilución sérica de 1/100.
    NOTA: En los datos de la muestra, se utilizó el anticuerpo monoclonal (mAb) 830A.
  3. Añadir 10 l de anticuerpo/sera valorado a la placa de cuentas e incubar durante 2 h a 37 oC. Añadir 200 s de 2% HSA HBSS a cada pozo y placa centrífuga a 2.000 x g durante 10 min.
  4. Retire con cuidado el sobrenadante mediante un rápido vuelco y decantación de líquido de los pozos de la placa en un fregadero para evitar perturbar el pellet de perlas invisible.

3. Aislamiento de células de leche materna

  1. Obtener leche materna humana de mujeres lactantes saludables, expresada mediante bombas electrónicas o manuales dobles. Aísle las células dentro de los 4 h de expresión, manteniendo la leche a temperatura ambiente.
  2. Usando tubos de 50 ml, centrifugar 50 ml de leche a 800 x g durante 15 minutos. Verter cuidadosamente la leche desnatada y la grasa sin alterar el pellet celular. Limpie el interior del tubo con una toallita sin pelusas para eliminar toda la grasa de la pared del tubo.
  3. Añadir 10 ml de albúmina sérica humana al 2% en la solución salina equilibrada de Hank (2% HbSS HSA [sin Ca2+ o Mg+]). Resuspenda el pellet pipeteando suavemente para evitar la activación celular y la apoptosis. Pasar a un tubo de 15 ml y centrífuga a 450 x g durante 10 min.
  4. Vierta el sobrenadante y repita el paso 1.3. Luego, resuspenda suavemente las células en 1 x 2 ml de 2% de HBSS HSA del 2% dependiendo del número de celda esperado, y cuente las células por un hemocitómetro o un contador de células automatizado, observando también la viabilidad celular.

4. Ensayo ADCP

NOTA: Los métodos descritos aquí están adaptados de Ackerman et al.32.

  1. Agregue 50.000 células BM recién aisladas a cada placa de ensayo ADCP bien en 200 s de 2% de HSA-HBSS al 2%. Incubar durante 2 h a 37oC.
    1. Para los experimentos de control, preincubar células a 37 oC con inhibidor de la actina de 10 g/ml (citochalasina-D), agente de bloqueo fcR de 50 g/ml (FcBlock) o una combinación de ambas antes de su adición a las placas.
  2. Placa de centrífuga a 930 x g durante 10 min. Añadir 200 ml de 2% HbSS HSA y centrifugación repetida. Retire con cuidado el sobrenadante como en el paso 2.7 y repita el lavado.
  3. Retire cuidadosamente las células de sobrenadant y mancha para su viabilidad utilizando una mancha de viabilidad fijable de 0,5 g/ml (concentración final) 450 por pocal en 50 ml de 2% de HBSS de HSA al 2%. Incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Placa centrífuga a 930 x g durante 10 min y retire el sobrenadante como en el paso 2.7. Añadir 200 l de 2% de HBSS HSA 2% y placa centrífuga de nuevo seguido de la eliminación del sobrenadante como en el paso 2.7.
  4. Después de la mancha de viabilidad, las células de mancha para los marcadores de leucocitos de interés, incluyendo mínimamente una mancha específica de CD45 como CD45 antihumano de ratón PE (clon HI30) a una concentración optimizada (1 g/L en 50 éL de 1% BSA HBSS en los datos de ejemplo).
    NOTA: Se pueden incluir marcadores de interés específicos del linaje.
  5. Incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Placa centrífuga a 930 x g durante 10 min y retire el sobrenadante como en el paso 2.7. Añadir 200 s de 1% de HBSS BSA y centrifugación repetida. Retire el sobrenadante. Fijar las células en 200 l de formaldehído al 0,5% en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4 oC. Refrigere en la oscuridad hasta el análisis.

5. Análisis por citometría de flujo

  1. Realice el gating inicial para eliminar los dobletes en una gráfica y los desechos de dispersión hacia delante (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) (material más pequeño que FSC 5000) (véase la figura 1). Utilice una gráfica de mancha de Viabilidad (V450 en este caso) para eliminar las células muertas (aquellas que son positivas para la mancha de viabilidad).
  2. Utilice una gráfica SSC frente a CD45 para diferenciar las principales clases de leucocitos (granulocitos, monocitos, linfocitos) como se describe ampliamente33,34.
    NOTA: Esta clasificación solo es sugerente y se necesitan marcadores específicos de linaje para confirmar el tipo de celda.
  3. Para todas las células CD45+, o para cada subconjunto de leucocitos de interés, mida la actividad de ADCP haciendo un marcador en las células positivas en un histograma del canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC), donde se detectan los granos fluorescentes.
    NOTA: Los pozos de control negativos en los que no se agregaron cuentas indicarán dónde las celdas positivas de cordón son evidentes en el histograma y, por lo tanto, dónde colocar el marcador de gating.
  4. Calcular las puntuaciones adCP como (intensidad media de fluorescencia [MFI] de células positivas de perlas) x (% del total de CD45 + células en la población positiva). Utilice el software de gráficos para trazar puntuaciones en cada concentración de Ab/suero y para realizar un análisis de área bajo la curva (AUC).
    NOTA: El ADCP se considera positivo si el AUC es mayor que 3 veces la desviación estándar del AUC de puntuación ADCP de un mAb de control negativo no específico (en este caso, 3865).

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Resultados

La leche se puede mantener a temperatura ambiente o más fría (aunque no congelada); sin embargo, dado que hemos observado una menor viabilidad cuando la leche se ha mantenido muy fría (los datos no se muestran), y que es más sencillo recoger, almacenar brevemente y transportar a temperatura ambiente, se recomienda que las muestras no se refrigeran para reducir variabilidad de muestra a muestra. En la leche obtenida 7-183 días después del parto, la concentración celular determinada por el ...

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Discusión

La técnica basada en citometría de flujo para medir la actividad de ADCP descrita en este documento se describió por primera vez en 201130 y desde entonces se ha demostrado robusta y citada en más de 80 estudios. El protocolo descrito aquí adapta esta técnica para su uso con células BM primarias por primera vez. Estudios previos de funcionalidad mediada por Fc por células BM se han limitado en gran medida a la medición de ráfagas oxidativas o ensayos de fagocitosis basados en histología utilizando...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Dra. Susan Zolla-Pazner en el Departamento de Medicina y departamento de microbiología de la Escuela de Medicina de Icahn en Mount Sinai por su revisión manuscrita. El NIH/NICHD proporcionó financiación para este proyecto con el número de subvención R21 HD095772-01A1. Además, R. Powell fue apoyado por fondos del Departamento de Medicina, División de Enfermedades Infecciosas, Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 y micro; m Microesferas marcadas con FluoSpheres NeutrAvidin Thermo FisherF8776
BD Pharmingen PE Ratón Anti-Humano CD45BD560975
Albúmina de suero bovino MPBiomedicals8810025
Corning Placa de poliestireno de fondo en V de 96 pocillos Corning 3894
Citochalasina DSigma22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de biotina Thermo Fisher21338
Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos Corning 
Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicosCorning 352070
Mancha de viabilidad reparable 450 BD562247
Solución de formaldehídoSigma 252549 
HBSS sin calcio, magnesio o fenol RedLife Technologies14175-095
Humano BD Fc BlockBD564219
Albúmina sérica humanaMP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadasKimberly-Clark Professional 34120
PBS 1x pH 7.4Thermo Fisher10010023
Pipetas serológicas de poliestireno 10 mL Corning 4488
Concentradores de Proteínas PES, 3K MWCO, 0.5 mLPierce88512
352196

Referencias

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