Artículo de método

Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario

DOI:

10.3791/60156

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29 de enero de 2020

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1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

En este artículo

Resumen

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Este objetivo de este protocolo es producir axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides derivadas del tejido donante mutado Cas9 utilizando técnicas de injerto de tejido embrionario.

Resumen

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Un creciente conjunto de técnicas y recursos genéticos permite a los investigadores sondear los orígenes moleculares de la capacidad de algunas especies de salamandras, como los axolotls, para regenerar extremidades enteras como adultos. Aquí, delineamos las técnicas utilizadas para generar axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides mutagenizadas cas9 que se pueden utilizar para explorar la función génica y la fidelidad de la regeneración de las extremidades. Combinamos varias técnicas embrionarias y genéticas, incluyendo la generación de haploides a través de activación in vitro, mutagénesis CRISPR/Cas9 e injerto de tejido en un solo protocolo para producir un sistema único para el cribado genético haploide en un organismo modelo de regeneración. Esta estrategia reduce el número de animales, el espacio y el tiempo necesario para el análisis funcional de genes en la regeneración de extremidades. Esto también permite la investigación de funciones específicas de regeneración de genes que pueden ser necesarias para otros procesos esenciales, como la organogénesis, la morfogénesis tisular y otros procesos embrionarios esenciales. El método descrito aquí es una plataforma única para llevar a cabo análisis genéticos haploides en un sistema modelo de vertebrados.

Introducción

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Históricamente, el injerto de tejido embrionario en anfibios ha sido una técnica importante para explorar los mecanismos fundamentales de la biología del desarrollo y la regeneración. El axolotl, una especie de salamandra, posee una impresionante capacidad para regenerar tejidos y estructuras complejas como extremidades y órganos después de una lesión o amputación. Del mismo modo, pueden recibir, sin rechazo, injertos de tejido de otros individuos en etapas embrionarias, juveniles y adultas1,2,3. Las regiones de embriones que producen estructuras enteras como extremidades, co....

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Protocolo

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Los procedimientos experimentales utilizados en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC, 2017-10557) y estaban de acuerdo con todas las políticas y directrices federales que rigen el uso de animales vertebrados. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en Ambystoma mexicanum (axolotls) en instalaciones de la Universidad de Yale.

1. Generación de embriones diploides

  1. Obtener embriones diploides GFP+ para servir como huéspedes de injerto a través del apareamiento natural utilizando uno o dos padres gfp 2....

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Resultados

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El desarrollo de embriones haploides puede distinguirse de los embriones diploides por su fenotipo29del "síndrome haploide". En la etapa del injerto, los embriones haploides presentan una curvatura reducida a lo largo del eje anterior-posterior y un encieimiento incompleto del tapón de la yema(Figura 3A). Se puede utilizar un microscopio fluorescente para garantizar que los embriones haploides estén libres de expresion.......

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Discusión

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Hay algunos pasos críticos en nuestro protocolo para generar quimeras haploide-diploides que el técnico operativo debe considerar para obtener resultados consistentes de injerto.

La razón más probable para que la generación de haploides falle es debido a las malas condiciones de activación in vitro. Se deben utilizar las cantidades adecuadas de espermatozoides móviles para activar los óvulos. Para prolongar la motilidad, las muestras de espermatozoides deben mantenerse siempre a 4 oC. Antes de.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer a Katherine Roberts por su cuidado de la colonia de axolotl. La financiación de este trabajo fue proporcionada por el Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 y 15-RMB-YALE-01) y el Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Beca F32HD086942).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#55 Pinzas DumontFine Science Tools11295-1Utilice únicamente material Dumostar (se puede esterilizar en autoclave)
Anfotericina BSigma AldrichA2942-20ML20 mL
Antibiótico-Antimicótico 100xThermo Fisher15240062
CiprofloxacinaSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (polisacarosa 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamicinaSigma AldrichG1914-250MG
Incubadora de Calefacción/RefrigeraciónRevSciRS-IF-233
Gonadotropina coriónica humanaMerkChorulon
Megascript T7 Kit de transcripciónThermo FisherAM133440 reacciones
Miroscopio Etapa de enfriamientoBrook IndustriesPersonalizadoPersonalizado
NLS Cas9 ProteínaPNAbioCP01-2004 viales de 50 µ g de proteína cada
PlasmocinaInvivogenant-mpt-1Nivel de tratamiento
Recetas
1.0x Solución de Ringer modificada de Marc (MMR)0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Solución20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7.4
de Holtfreter:

Referencias

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  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. <....

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Etiquetas

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