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Artículo de método

Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario

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DOI:

10.3791/60156

⸱

29 de enero de 2020

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

En este artículo

Resumen

Este objetivo de este protocolo es producir axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides derivadas del tejido donante mutado Cas9 utilizando técnicas de injerto de tejido embrionario.

Resumen

Un creciente conjunto de técnicas y recursos genéticos permite a los investigadores sondear los orígenes moleculares de la capacidad de algunas especies de salamandras, como los axolotls, para regenerar extremidades enteras como adultos. Aquí, delineamos las técnicas utilizadas para generar axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides mutagenizadas cas9 que se pueden utilizar para explorar la función génica y la fidelidad de la regeneración de las extremidades. Combinamos varias técnicas embrionarias y genéticas, incluyendo la generación de haploides a través de activación in vitro, mutagénesis CRISPR/Cas9 e injerto de tejido en un solo protocolo para producir un sistema único para el cribado genético haploide en un organismo modelo de regeneración. Esta estrategia reduce el número de animales, el espacio y el tiempo necesario para el análisis funcional de genes en la regeneración de extremidades. Esto también permite la investigación de funciones específicas de regeneración de genes que pueden ser necesarias para otros procesos esenciales, como la organogénesis, la morfogénesis tisular y otros procesos embrionarios esenciales. El método descrito aquí es una plataforma única para llevar a cabo análisis genéticos haploides en un sistema modelo de vertebrados.

Introducción

Históricamente, el injerto de tejido embrionario en anfibios ha sido una técnica importante para explorar los mecanismos fundamentales de la biología del desarrollo y la regeneración. El axolotl, una especie de salamandra, posee una impresionante capacidad para regenerar tejidos y estructuras complejas como extremidades y órganos después de una lesión o amputación. Del mismo modo, pueden recibir, sin rechazo, injertos de tejido de otros individuos en etapas embrionarias, juveniles y adultas1,2,3. Las regiones de embriones que producen estructuras enteras como extremidades, colas, ojos y cabezas, y tejidos más específicos, como neuroectoderm y somitas, pueden ser injertadas entre embriones para producir animales quiméricos1,2,4,5,6. Durante casi un siglo, los estudios de estos animales quiméricos han proporcionado información crucial sobre la regeneración, diferenciación de tejidos, control de tamaño, y el patrón1,7,8.

En la última década, numerosos estudios transcripcionales de tejidos regeneradores han producido información sobre los programas genéticos subyacentes a la regeneración de salamandras9,10,11,12,13. Estos estudios se han sumado a una lista en expansión de genes candidatos que, hasta la fecha, no se caracterizan en gran medida en el contexto de la regeneración. Las técnicas de mutagénesis dirigidas, como CRISPR/Cas, ahora permiten la investigación de estos genes, y tales enfoques genéticosse ven muy facilitados por la reciente secuenciación y montaje del gran genoma del axololo1,15,16.

Buscamos desarrollar técnicas que combinaran la biología clásica del desarrollo con la nueva tecnología genética con el propósito de disuadar los mecanismos de regeneración. Durante décadas17se han establecido métodos para generar embriones haploides de axolotls y otras salamandras. Si bien estas técnicas se han observado durante mucho tiempo como ventajas de las salamandras como organismos modelo genéticos18, pocos estudios genéticos posteriores han incorporado animales haploides. Utilizamos la activación in vitro en el axolotl para producir embriones haploides que sirven como donantes de tejido para el injerto19. Utilizando embriones portadores de marcadores genéticos fluorescentes, hemos ideado métodos fiables para generar extremidades derivadas casi en su totalidad de tejidos de donantes(Figura 1A). Mediante la combinación de estas dos técnicas, hemos evitado la letalidad embrionaria tardía asociada con la haploidy, permitiendo la producción de extremidades haploides completamente desarrolladas e injertadas(Figura 1B, Figura 1B'y Figura 2).

Mediante la realización de mutagénesis mediada por CRISPR/Cas en embriones haploides antes del injerto para crear axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes, podemos investigar la función génica específicamente en el contexto del desarrollo y la regeneración de las extremidades. Esto permite el rescate de las extremidades de fenotipos mutantes potencialmente embrionarios-letales. Mientras que la microinyección CRISPR/Cas puede generar animales altamente mutantes, estos animales son típicamente altamente mosaicos, con cierto grado de retención de alelos de tipo salvaje y una variedad de mutaciones distintas en los sitios objetivo14,20. La mutagénesis basada en CRISPR en células haploides aumenta la penetración de mutaciones de pérdida de función de alelos únicos, ya que no pueden enmascararse con alelos de tipo salvaje retenidos. Por esta razón, el cribado basado en CRISPR en líneas celulares haploides se utiliza cada vez más para investigar la base genética de muchos procesos celulares21,22,23. Mediante la combinación de trazas de linaje basadas en CRISPR con nuestros protocolos de injerto de cogollos de extremidades haploides, el enfoque descrito aquí puede servir como una plataforma para pantallas genéticas haploides en animales vivos20.

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Protocolo

Los procedimientos experimentales utilizados en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC, 2017-10557) y estaban de acuerdo con todas las políticas y directrices federales que rigen el uso de animales vertebrados. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en Ambystoma mexicanum (axolotls) en instalaciones de la Universidad de Yale.

1. Generación de embriones diploides

  1. Obtener embriones diploides GFP+ para servir como huéspedes de injerto a través del apareamiento natural utilizando uno o dos padres gfp 24.
  2. Recoger los huevos diploides recién puestos y colocarlos en un tamiz de metal.
  3. Enjuagar bien los huevos con 40% de solución de Holtfreter (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4,pH a 7,4).
  4. Colocar los huevos en la solución fresca 40% de Holtfreter y almacenar a 12 oC.
    NOTA: Los embriones diploides siempre deben obtenerse antes de pasar a la generación de embriones haploides.

2. Generación de embriones haploides

  1. Preparación de donantes de gameto femeninos
    1. 48 h antes de realizar la activación in vitro, anestesiar un axolotl hembra blanca o blanca/RFP sexualmente madura por inmersión en 1 g/L MS-222 con búfer HEPES en la solución del 40% de Holtfreter25.
    2. Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado después de aproximadamente 30 minutos de inmersión pellizcando firmemente su cola entre el pulgar y el dedo índice. Los animales completamente anestesiados no responderán físicamente a ningún pellizco.
    3. Preparar una solución de gonadotropina coriónica humana (HCG) que contiene 10.000 U/ml en solución salina estéril.
    4. Con una jeringa de insulina de 30 G, inyectar 0,15 CC de HCG (1.500 unidades) en la musculatura dorsal hasta la extremidad posterior de la hembra anestesiada en un ángulo de 45o con respecto a la línea media para evitar el contacto con la médula espinal.
    5. Devuelva a la hembra a la solución fresca de Holtfreter al 40% y colóquela en un refrigerador de 8 x 12 oC.
    6. Después de 48 h, vuelva a la hembra a temperatura ambiente. Coloque algunas piedras o plantas de plástico en su recipiente como superficies para la puesta de huevos.
      NOTA: Las hembras inyectadas con HCG a menudo depositarán cajas vacías de jalea durante varias horas antes de poner huevos.
    7. Retire las piedras o plantas de plástico después de que la hembra haya comenzado a poner huevos constantemente.
    8. Deje que la hembra se sente en el tanque vacío durante 30 minutos a 1 h.
      NOTA: Los materiales de retención para que el animal laa los huevos permitirán un control más estricto de la recolección de ovocitos.
  2. Colección de gametos masculinos
    1. Mientras que la puesta de óvulos de la hembra está estancada, anestesia rinde un axolotl masculino GFP+ sexualmente maduro para servir como donante de esperma, como en el paso 2.1.1.
    2. Coloque el macho completamente anestesiado boca abajo sobre toallas de papel húmedas bajo un microscopio de disección.
    3. Si el experimentador es diestro, coloque la punta de una pipeta P1000 en la base de la cloaca con la mano derecha.
    4. Coloque el dedo índice izquierdo y el pulgar de la mano izquierda 2 x 3 cm rostral a la pelvis. Apriete suavemente al animal mientras mueve los dedos hacia las patas traseras para eliminar las muestras de orina espermática.
    5. Recoger cada uno que se expulsa de la cloaca en un tubo de microcentrífuga individual. Repita este proceso para recoger de 6 a 10 muestras.
    6. Pipetear 5,0 l de cada muestra en una placa de petri para inspeccionar la calidad de los espermatozoides utilizando un microscopio invertido.
      NOTA: Las muestras de espermatozoides concentrados son de un color blanco lechoso, por lo general oscilan entre 5 y 20 l, y generalmente se recuperan después de extraer varias muestras de orina espermática de mayor volumen. Los espermatozoides se acumularán en la parte inferior de los tubos en muestras de mayor volumen cuando se dejen sin perturbar. Las muestras concentradas de espermatozoides sanos son altamente móviles y pierden actividad a medida que disminuye su concentración. Los machos sanos pueden producir hasta 50 ml de espermatozoides concentrados.
  3. Colección de gametos femeninos
    1. Después de obtener y confirmar una muestra de espermatozoides sana, anestesiael axolotl femenino inyectado por HCG como en el paso 2.1.1.
    2. Coloque a la hembra completamente anestesiada sobre toallas de papel húmedas en la espalda.
    3. Extraiga los óvulos no fecundados de la hembra utilizando un movimiento de mano similar al del paso 2.2.4.
    4. Recoger los huevos usando fórceps húmedos y transferirlos a un plato de petri de 10 cm. Tratar los óvulos con espermatozoides irradiados dentro de los 15 minutos de recolección.
  4. Preparación de gametos masculinos y activación in vitro
    1. Utilice una pipeta P10 o P20 para pipetear los espermatozoides hacia arriba y hacia abajo, rompiendo los grumos para formar una suspensión homogénea.
    2. Aproximadamente el porcentaje de espermatozoides móviles colocando una gota de 0,5 l de suspensión de espermatozoides sin diluir en una tapa de la placa de petri o un portaobjetos de vidrio y examinando con un microscopio invertido.
    3. Añadir 9,5 ml de la solución de Timbre modificada de 0,1x Marc (MMR; Tabla de Materiales) a esta muestra para hacer una dilución de espermatozoides 20x. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    4. Con un microscopio invertido, cuente el esperma en tres gotas de 1,0 l de la alícuota diluida de 20x en una cubierta de plato de petri o hemocitómetro para estimar la concentración de espermatozoides de la suspensión sin diluir.
    5. Preparar los espermatozoides para la irradiación diluyendo una alícuota de la muestra de espermatozoides original a aproximadamente 80.000 células móviles/ml en MMR estéril es 0.1x.
    6. Cuente el número de óvulos obtenidos en los últimos 15 min. Añadir 0,5 l de los espermatozoides recién diluidos del paso 2.4.5 por óvulo a una placa de petri. Utilice la punta de la pipeta para esparcir esta suspensión en una capa de 1 mm de espesor.
    7. Con un elevador de plástico, coloque la muestra a 4 cm de las bombillas de un reticolador de 254 nm. Inactivar genéticamente los espermatozoides irradiando la muestra con 800.000 uJ/mm2.
    8. Con una pipeta P10, pipetee la suspensión sobre los óvulos no fecundados, cubriendo cada óvulo con 0,25 x 0,5 l de espermatozoides irradiados. Deje que los huevos se senten a temperatura ambiente durante 30 min.
    9. Después de 30 min, inundar los huevos con 0,1x MMR. Colocar inmediatamente los huevos en una incubadora de 8o10 oC para preparaciones inyectables al día siguiente o a 18 oC para preparaciones inyectables dentro de las 7 horas posteriores a la activación (hpa).
    10. Dejelly haploids usando fórceps afilados 30 min después de la hidratación. Colocar inmediatamente los huevos en una incubadora de 8oC para preparaciones inyectables al día siguiente o a 18 oC para preparaciones inyectables el mismo día.

3. Mutagénesis haploide y mantenimiento

  1. Microinyecciones CRISPR/Cas9
    1. Diseñe sgRNA utilizando CRISPRscan y sintete26,27.
    2. Para la mutagénesis múltiplex, prepare un stock de 5 sgRNA (10 ng/L para cada sgRNA) y proteína Cas9 (1 g/L). Preparar una dilución de 100 veces de este material (0,1 ng/L por sgRNA, 10 ng/L Cas9) para inyección. Para un solo gen, mutagénesis de alta frecuencia de mutación, siga el protocolo descrito anteriormente28.
    3. Inyectar embriones haploides en la etapa de una sola célula 7 hpa si se almacenan a 18 oC o inyectar embriones al día siguiente en la etapa de 2 a 8 células si se almacenan a 8 o10 oC.
    4. Transfiera los embriones a 1,0x MMR con 20% de polisurosa 400.
    5. Si es una sola célula, inyecte cada embrión con una gota de 5 nL de la solución inyectable (aproximadamente 1/4 de radio del óvulo) que contenga una masa total de 0,5 pg/sgRNA y 50 pg de proteína Cas9. Si es multicelular, distribuya esta masa inyectando volúmenes más pequeños en varias celdas.
    6. Dejar que los embriones sanen en la polisurosa 400 durante un mínimo de 4 h y un máximo de 18 h a 18oC.
  2. Vivienda de embriones haploides
    1. Transfiera los embriones a 0,1x MMR con antibiótico-antimicótico.
    2. Casar cada embrión en un pozo individual de una placa de 24 pocillos, ya que algunos morirán o se desarrollarán anormalmente. Mantener a 16 o 18 oC. Las temperaturas más bajas se pueden utilizar para prolongar el desarrollo, si es necesario.
    3. Sustituya el soporte por 0,1x MMR fresco por antibióticos antimicóticos cada dos días.

4. Preparación de embriones de host diploide

  1. Mantener los embriones en el recubrimiento de jalea a 12 a 16 oC hasta que lleguen a la etapa 22 a 26.
  2. Recoger los embriones que están listos para el injerto, colocarlos dentro de un tamiz (tamaño de malla de 4 mm), y enjuagar suavemente con 40% la solución de Holtfreter.
  3. Transfiera los embriones a 0,1x MMR esterilizados por filtro que contengan 1,5% de lejía durante un máximo de 2 min. Sumerjan completamente los embriones en la solución de lejía y arremolinarlos suavemente para asegurarse de que el recubrimiento de jalea entre en contacto con la solución de lejía para matar el microbios presentes en los embriones.
  4. Después de 2 min, diluir la solución de lejía que contiene los embriones con un volumen igual de 0,1x MMR esterilizado por filtro.
  5. Vierta suavemente los embriones en un tamiz de sinvida de lejía (tamaño de malla de 4 mm) y enjuague los embriones cinco veces con 0,1x MMR esterilizado por filtro.
  6. Colocar los embriones en platos estériles de petri de 10 cm con 0,1x MMR con antibióticos para dejellying (penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 g/L, 0,25 g/ml, gentamicina 25 g/ml).
  7. Bajo un estereomicroscopio fluorescente, retire las capas de gelatina y las membranas vitelinas de los embriones GFP+ utilizando fórceps afilados (dimensiones de punta 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Transfiera los embriones GFP+ a una nueva placa de petri. Minimizar la cantidad de líquido transferido de la placa de petri donde fueron dejellied.
  9. Enjuague los embriones huésped de GFP+ con 0,1 x MMR estéril con antibióticos de cuatro a seis veces para eliminar los contaminantes.
  10. Colocar los embriones limpios a 4oC durante la noche antes del injerto.
    NOTA: El enfriamiento de los embriones hace que sean más rígidos y limpios de separación del mesodermo del endodermo factible.

5. Generación quimera haploide-diploide

  1. Preparación quirúrgica de platos y medios
    1. Preparar platos de operación quirúrgica estériles vertiendo autoclaved 2% agarosa en 0.1x MMR en platos estériles de 35 mm petri fáciles de agarrar. Llene los platos de petri a mitad de camino con agarosa.
    2. Después de que la agarosa se enfríe, utilice un bisturí estéril para cortar una vaguada de 25 mm de largo y eslanada en la agarosa para mantener los embriones en su lugar.
    3. Llene el plato con medios quirúrgicos estériles (0,1x MMR con antimicoplasma 2,5 g/ml, anfotericina B 0,25 g/ml y ciprofloxacino 10,0 g/ml) y refrigerar a 4 oC.
  2. Procedimiento de injerto de embriones
    1. Coloque un donante haploide sano con uno o dos embriones huésped diploide GFP+ emparejados dentro de la cubeta del plato de operación pretallado que contiene medios quirúrgicos(Figura 3).
      NOTA: Realice el procedimiento en una etapa de enfriamiento (10 oC o inferior) si es posible.
    2. Utilice dos fórceps autoclave ultrafinos (punta recta, dimensiones de la punta 0,05 x 0,02 mm2) para eliminar las capas de ectodermo y mesodermo del huésped con el cogollo cerca del centro(Figura 4).
      NOTA: La región del injerto de tejido rectangular abarca el cogollo de la extremidad y se extiende desde la novena somita hasta la mitad posterior de la protuberancia de la branquia, de unos 2 mm, a lo largo del eje posterior anterior. A lo largo del eje dorsoventral, la región injertada abarca aproximadamente 1,5 mm, incluyendo las somitas hasta justo más allá del borde ventral de la protuberancia de la branquia. La región injertado incluye todos los mesodermos de placa lateral y las mitades laterales de las somitas, sin perturbar el endoderm subyacente. Consulte la Figura 4 y el vídeo adjunto para obtener más información.
    3. Deje a un lado el tejido huésped y retire una lámina de tejido de tamaño equivalente del donante haploide utilizando los mismos métodos.
    4. Coloque la lámina de tejido del donante haploide en la región correspondiente del embrión del donante.
    5. Asegure el tejido cubriéndolo con un fragmento de vidrio rectangular autoclave de un vidrio de cubierta de microscopio triturado y presionando suavemente en el cuerpo del embrión huésped.
    6. Voltee el embrión del donante haploide hacia el otro lado para cosechar el brote de la extremidad para el segundo embrión huésped. Repita los pasos 5.2.2 a 5.2.5.
    7. Retire cuidadosamente el exceso restante de los tejidos huésped y el embrión del donante del plato.
    8. Deje los injertos con los anclajes de la partición de vidrio en su lugar durante 60 x 75 minutos, comprobando cada 20 minutos para asegurarse de que el vidrio no se ha deslizado.
    9. Después de que los injertos de tejido se adhieran completamente, usa los fórceps para pelar lentamente los anclajes de fragmentos de vidrio.
  3. Mantenimiento de quimeras
    1. Transfiera los embriones injertados a medios quirúrgicos frescos y manténgalos a 8 o 12 oC durante la noche para sanar. Casa individual embriones injertados en placas de 12 o 24 pocillos.
    2. Después de 36 a 48 h, transfiera los embriones injertados a antibiótico-antimicótico estéril de 0,1 x MMR. Los antibióticos fuertes en los medios quirúrgicos causan toxicidad en embriones injertados después de 3 días.
    3. Sustituya los medios por 0,1x MMR frescos y antibióticos cada 2 o 3 días.
    4. Mantener los embriones injertados a 18oC hasta que puedan alimentar28.
    5. Después de 1 a 2 meses de desarrollo y cuidado, las extremidades haploides se pueden puntuar para la pureza del injerto utilizando un microscopio de disección fluorescente.
      NOTA: La presencia de tejido GFP no neural o no derivado de la sangre en las extremidades es un indicador de injerto impuro y a menudo se asocia con el desarrollo anormal de las extremidades. Estos animales deben excluirse de un análisis posterior.

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Resultados

El desarrollo de embriones haploides puede distinguirse de los embriones diploides por su fenotipo29del "síndrome haploide". En la etapa del injerto, los embriones haploides presentan una curvatura reducida a lo largo del eje anterior-posterior y un encieimiento incompleto del tapón de la yema(Figura 3A). Se puede utilizar un microscopio fluorescente para garantizar que los embriones haploides estén libres de expresion...

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Discusión

Hay algunos pasos críticos en nuestro protocolo para generar quimeras haploide-diploides que el técnico operativo debe considerar para obtener resultados consistentes de injerto.

La razón más probable para que la generación de haploides falle es debido a las malas condiciones de activación in vitro. Se deben utilizar las cantidades adecuadas de espermatozoides móviles para activar los óvulos. Para prolongar la motilidad, las muestras de espermatozoides deben mantenerse siempre a 4 oC. Antes de...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Katherine Roberts por su cuidado de la colonia de axolotl. La financiación de este trabajo fue proporcionada por el Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 y 15-RMB-YALE-01) y el Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Beca F32HD086942).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#55 Pinzas DumontFine Science Tools11295-1Utilice únicamente material Dumostar (se puede esterilizar en autoclave)
Anfotericina BSigma AldrichA2942-20ML20 mL
Antibiótico-Antimicótico 100xThermo Fisher15240062
CiprofloxacinaSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (polisacarosa 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamicinaSigma AldrichG1914-250MG
Incubadora de Calefacción/RefrigeraciónRevSciRS-IF-233
Gonadotropina coriónica humanaMerkChorulon
Megascript T7 Kit de transcripciónThermo FisherAM133440 reacciones
Miroscopio Etapa de enfriamientoBrook IndustriesPersonalizadoPersonalizado
NLS Cas9 ProteínaPNAbioCP01-2004 viales de 50 µ g de proteína cada
PlasmocinaInvivogenant-mpt-1Nivel de tratamiento
Recetas
1.0x Solución de Ringer modificada de Marc (MMR)0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Solución20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7.4
de Holtfreter:

Referencias

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