Aquí se presenta un protocolo para el uso del alginato como polímero en la microencapsulación de células inmortalizadas para la entrega a largo plazo de productos biológicos a ojos de roedores.
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Artículo de método
Tecnología celular encapsulada para la entrega de productos biológicos al ojo del ratón
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Resumen
Resumen
Muchas terapias actuales en desarrollo para enfermedades del polo posterior del ojo son biológicas. Estos medicamentos deben administrarse con frecuencia, por lo general a través de inyecciones intravítreas. Las células encapsuladas que expresan el biológico de elección se están convirtiendo en una herramienta para la producción y liberación de proteínas locales (por ejemplo, a través de la administración de fármacos a largo plazo). Además, los sistemas de encapsulación utilizan materiales permeables que permiten la difusión de nutrientes, desechos y factores terapéuticos dentro y fuera de las células. Esto ocurre mientras se enmascaran las células de la respuesta inmune del huésped, evitando la necesidad de supresión del sistema inmunitario huésped. Este protocolo describe el uso del alginato como polímero en microencapsulación junto con el método de electrospray como una técnica de microencapsulación. Las células ARPE-19, una línea celular de RPE humana que surge espontáneamente, se ha utilizado en experimentos de terapia celular a largo plazo debido a su funcionalidad de vida útil, y se utiliza aquí para la encapsulación y entrega de las cápsulas a los ojos del ratón. El manuscrito resume los pasos para la microencapsulación celular, el control de calidad y la entrega ocular.
Introducción
Las terapias basadas en células representan técnicas biológicas revolucionarias que se han aplicado ampliamente en la medicina. Recientemente, se han aplicado con éxito en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, enfermedades oculares, y el cáncer. Las terapias celulares cubren una amplia gama de campos, desde el reemplazo celular hasta la administración de fármacos, y este protocolo se centra en este último. Las microcápsulas de alginato biodegradables (MC) han demostrado eficacia como sistema de administración, y se están utilizando ampliamente en el campo biomédico. El alginato se ha utilizado en microencapsulación debido a su sencillo proceso de gelificante, biodegradabilidad, excelente biocompatibilidad y estabilidad en condiciones in vivo1,2,3,4.
El método de electrospray, como técnica de microencapsulación, se ha utilizado con éxito para encapsular péptidos y proteínas utilizando alginato (polímero base) y poli-l-ornitina (polímero de recubrimiento secundario). Ambos polímeros se encuentran naturalmente y se utilizan para su biocompatibilidad5,,6,7. Sin embargo, el principal desafío en las terapias basadas en células es la supresión del sistema inmunitario huésped para evitar efectos secundarios causados por fármacos inmunosupresores. La permeabilidad de las microcápsulas de alginato se considera una propiedad adecuada para la encapsulación celular, que permite la difusión de nutrientes, residuos y factores terapéuticos dentro y fuera de las células mientras los enmascara desde la respuesta inmune del huésped8,9,10.
En el ojo, las células encapsuladas se han utilizado en ensayos clínicos para la administración constante de productos biológicos (es decir, factores de crecimiento11,,12 y antagonistas del factor de crecimiento13) para el tratamiento de la retinitis pigmentosa o degeneración macular relacionada con la edad. Otros objetivos, como los inhibidores del complemento14, también se están explorando actualmente en entornos preclínicos.
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de La Visión y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur bajo el protocolo ID 00399.
1. Cultivo celular
- Generar células epiteliales de pigmento de la retina humana (ARPE-19) que expresen de forma estable el gen de elección según los protocolos publicados14,15.
- Mantener las células en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS).
- Incubar las células a 37oC y 5%CO2.
- Sustituya el medio cada 2-3 días.
- Pasar las células después de alcanzar 70%-80% de confluencia usando procedimientos de cultivo de tejidos estándar.
2. Encapsulación celular
- Mezclar el alginato de sodio con agua desionizada (DI) para una concentración final de 2% p/v y purificar por filtración con un filtro de jeringa estéril de 0,2 m.
- Preparar las células que se van a mezclar con la solución de alginato mediante la trippsinización, centrifugación, y lavarcon 10 mM HEPES solución salina tamponada (pH a 7.4). Usando un hemocitómetro, cuente las células y ajuste la concentración celular final a 1 x 106 en solución de alginato.
NOTA: El proceso de encapsulación debe ejecutarse dentro de una capucha esterilizada. - Cargue alícuotas de alginato y células de 300 ol en una jeringa de 3 ml y adjúntela a una bomba de jeringa. La solución se bombeará a través de una aguja de punta contundente de 30 G a un baño de gelificante estéril colocado en un vaso de precipitados estéril de 50 ml debajo de la punta de la jeringa a 7 mm para una distancia de pulverización de aguja a baño.
- El baño de gelificante contiene un volumen de 40 ml de solución salina tamponada HEPES de 10 mM que contiene cloruro de calcio de 100 mM (CaCl2) y 0,5% p/v poli-L-ornitina (PLO). La OLP es un recubrimiento de polímero secundario que se puede omitir o cambiar de acuerdo con las necesidades del investigador.
- Ajuste el voltaje y el caudal y manténgalos constantes durante el proceso de encapsulación a un caudal de 60 mm/h y un voltaje inicial de 6,0 kV para producir microcápsulas de tamaño de 150 m.
- Conecte el clip del cable de ánodo (rojo) de una punta de aguja del generador de alto voltaje a la aguja y conecte el clip de tierra (negro) al cable de cobre que está medio sumergido en el baño de gelificante. Un lote de la mezcla de alginato + célula (1 ml) tarda aproximadamente 30 minutos en preparar las células encapsuladas (aproximadamente 25.000 microcápsulas).
- Lavar las microcápsulas formadas que contienen células con solución de lavado (10 mM de solución tamponada HEPES que contiene 1,5 mM de CaCl2,pH a 7,4) dos veces. No utilice PBS para lavar.
- Incubar las células encapsuladas con medios DMEM suplementados al 10% FBS en una incubadora humidificada a 37oC y 5% deCO2.
NOTA: Los instrumentos de proceso de encapsulación se muestran en la Figura 1.
3. Confirmación de que la encapsulación no afecta a la viabilidad celular
- Después de incubar las células encapsuladas durante 24 horas en medios, prepare una pequeña muestra de 500 l (30 microcápsulas) para la tinción.
- Lavar las microcápsulas 2 veces con solución de lavado (10 mM DE HEPES solución salina tamponada que contiene 1,5 mM CaCl2) y mancharlas para la viabilidad viva-muerta utilizando un kit de ensayo vivo/muerto.
- Preparar una mezcla de tinción de calceína AM (acetoxymethyl) y etidio homodímero-1 en concentraciones finales de 2 m y 4 m, respectivamente.
- Añadir 2 ml de la mezcla de tinción a las células encapsuladas e incubar durante 30-45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (RT).
- Con una aspiración cuidadosa, aspirar la solución de tinción y lavar las microcápsulas 2x con la solución de lavado. Utilice un sistema de microscopio fluorescente para observar e imaginar las células encapsuladas.
NOTA: La documentación de la encapsulación se muestra en la Figura 2.
4. Confirmación de que las Cápsulas son el tamaño apropiado para la entrega y entrega de la
- Las inyecciones intravítreas en el ojo del ratón se realizan típicamente con una aguja de punta contundente de 27 G (diámetro interno de 210 m) unida a una jeringa Hamilton de 2,5 ml.
- Genere cápsulas que van de 100 a 200 m, diluya en medios libres de suero y tire cuidadosamente de ellas hacia arriba en la jeringa de Hamilton. PBS no es un vehículo adecuado, ya que las cápsulas de alginato se disolverán en PBS.
- Expulse lentamente 1 l de gotas que contengan cápsulas a una diapositiva del microscopio y determine su integridad utilizando un microscopio de campo brillante vertical.
- Ajuste el tamaño de la cápsula (consulte el paso 2.3) ajustando el voltaje y el caudal en consecuencia. Las microcápsulas más pequeñas se producen de manera no lineal aumentando el voltaje y disminuyendo ligeramente el caudal8. En nuestras manos, cápsulas de 150 m de diámetro demostraron ser las más adecuadas. El ajuste del tamaño de la cápsula también depende de mantener constante la concentración de alginato mientras se cambian los otros parámetros.
- Mantener un conjunto separado de células en cápsulas del tamaño adecuado en medio libre de suero para determinar la cantidad de secreción del biológico deseado. Utilice ELISA sensibles o hincha occidental para determinar la concentración de los biológicos en el sobrenadante.
- Determinar la cantidad necesaria de cápsulas que deben inyectarse en función de la PK/PD conocida (farmacocinética/farmacodinámica) de la terapéutica. En nuestras manos, 10 cápsulas por ojo de ratón demostraron ser más eficaces.
5. Entrega de cápsulas en el vítreo del ratón
- Realice inyecciones intravítreas con un microscopio de disección. Consulte la Figura 3 para la configuración quirúrgica y los materiales utilizados durante el procedimiento. Un protocolo detallado para las inyecciones intravítreas se puede encontrar en otro lugar16.
- Anestetizar ratones por inyección intraperitoneal de xilazina y ketamina (20 mg/kg y 80 mg/kg) u otros anestésicos preferidos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de la institución específica. Asegurar la profundidad adecuada de la anestesia usando un pellizco de dedo del dedo del día17.
- Dilatar las pupilas del ratón con fenilefrina HCL (2,5%) y sulfato de atropina (1%) para permitir una buena visibilidad de la cámara vítrea y aplicar un gel lubricante para los ojos a los ojos para mantenerlos hidratados durante el procedimiento.
- Perforar la esclerótica en el limbo con una aguja de 26 G como orificio guía, asegurándose de que 1) la aguja está en un ángulo de 45o con el ojo y la mesa y 2) la punta biselada se apunta hacia arriba para evitar perforar la lente.
- Inyecte cuidadosamente las cápsulas con una aguja de punta contundente de 27 G unida a una jeringa de Hamilton en un ángulo de 45o bajo inspección visual, asegurándose de evitar tocar la lente con la aguja. La lesión de la lente conducirá a la formación de cataratas. Las cápsulas deben ser visibles en el vítreo utilizando el microscopio de disección (Figura 4A).
- Después de la retracción de la aguja, tratar el lugar de inyección con ung enbetos antibiótico sulfatos de neomicina y polimixina B, además de dexametasona oftalmológica antibiotic pomada.
- Aplicar goniotaire hipromelosa solución oftálmica demulcente (2,5%) a ambos ojos para evitar que las córneas se sequen durante el período de recuperación.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento a 37 oC y monitoree hasta que esté completamente despierto.
- Una inyección exitosa de células ARPE-19 encapsuladas debe revelar la presencia de cápsulas intactas en la cámara vítrea del ratón con sólo pequeñas cantidades de escombros al tomar imágenes del ojo por tomografía de coherencia óptica u otros métodos(Figura 4B).
- El ojo del ratón inyectado, después de unos días de recuperación debido a la cirugía, ahora está listo para el paradigma experimental en cuestión.
NOTA: La configuración quirúrgica y la documentación de las cápsulas en el ojo se describen en la Figura 3 y la Figura 4,respectivamente.
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Resultados
Las células ARPE-19 son una línea celular de RPE humana inmortalizada espontáneamente que se ha demostrado que es susceptible de encapsulación y supervivencia a largo plazo tras la implantación de cápsulas en el ojo. Las herramientas para encapsular alginato se muestran en la Figura 1. En este estudio, se demostró que al encapsular en alginato, las células de las cápsulas de alginato fueron confirmadas por imágenes de campo brillante(Figura 2A). Se realizaron en...
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Discusión
Esta técnica de encapsulación de células es relativamente rápida y fácil de realizar; sin embargo, ciertos puntos deben tenerse en cuenta para obtener resultados descendentes precisos. Las células deben mantenerse en cultivo en un plato de Petri antes de la encapsulación y mantenerse en la confluencia adecuada. La encapsulación debe realizarse en una campana de ventilación adecuada con flujo de aire regulado, si es posible. Demasiado fuerte de una corriente de aire puede afectar la formación de cápsulas, especialmente en...
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
El estudio fue apoyado en parte por subvenciones otorgadas a B. R. por los Institutos Nacionales de Salud (R01EY019320), el Departamento de Asuntos de Veteranos (RX000444 y BX003050), y la South Carolina SmartState Endowment.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de 3 mL | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Aguja roma | Tecnología de infusión SAI | B30-100 | |
| Sal sódica de ácido algínico de algas pardas | Sigma | A0682 | |
| Sulfato de atropina Solución oftalmólica (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | para la dilatación de la pupila |
| BD 1 mL Jeringa 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson y La empresa | DG518105 500029609 REF 309625 | para generar el orificio guía |
| Cloruro de calcio, anhidro, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | para lubricar los ojos durante la anestesia |
| Goniotaire: Hipromelosa (2,5%) Solución demulcente oftálmica (estéril) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | para lubricar los ojos durante la anestesia |
| Hamilton Aguja/jeringa Punta: 27 G, cubo pequeño RN NDL, longitud del cubo (12 mm), estilo de punta 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | para la administración intravítrea de cápsulas |
| Jeringa Hamilton: 2,5 y micro; L, modelo 62 RN SYR, NDL Se vende por separado | Hamilton | 7632-01 | para la administración intravítrea de |
| cápsulas Tampón HEPES, 1 m | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| Generador de alta tensión | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| VIVO/MUERTO Kit de Viabilidad/Citotoxicidad | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| Clorhidrato de L-Ornitina, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomicina y polimixina B sulfatos y dexametasona Pomada oftálmica | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiótico para prevenir la infección después de la inyección intravítrea |
| Clorhidrato de fenolefrina Solución oftálmica (2,5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | para la dilatación de la pupila |
| Cloruro de sodio | Sigma | S-5886 | |
| Jeringa estéril filtros, 0,2 μ m | VWR | 28143-312 | |
| Bomba de jeringa | GRASEBY | MS16A |
Referencias
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