Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias

3.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/60170

⸱

11 de noviembre de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 3Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Surgery, University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

En este artículo

Resumen

Este estudio describe un método para aislar vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factores estimulantes de colonias de macrófagos de granulocitos inmunoestimulantes a partir de células madre embrionarias.

Resumen

Las células madre embrionarias (CES) son células madre pluripotentes capaces de autorrenovarse y diferenciarse en todo tipo de células embrionarias. Al igual que muchos otros tipos de células, las CES liberan pequeñas vesículas de membrana, como los exosomas, al entorno extracelular. Los exosomas sirven como mediadores esenciales de la comunicación intercelular y desempeñan un papel básico en muchos procesos (pato)fisiológicos. El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) funciona como una citoquina para modular la respuesta inmune. La presencia de GM-CSF en exosomas tiene el potencial de aumentar su función inmuno-reguladora. Aquí, GM-CSF se sobreexpresó de manera estable en la línea celular ESC murina ES-D3. Se desarrolló un protocolo para aislar vesículas extracelulares (VE) enriquecidas con exosomas de alta calidad de células ES-D3 que sobreexpresan GM-CSF. Los vehículos eléctricos aislados enriquecidos con exosomas se caracterizaron por una variedad de enfoques experimentales. Es importante destacar que se encontró que cantidades significativas de GM-CSF estaban presentes en los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas. En general, los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas que contienen GM-CSF de las CES podrían funcionar como vesículas libres de células para ejercer sus actividades inmunorreguladoras.

Introducción

Las CES se derivan de la etapa de blastocisto de un embrión preimplantacional1. Como células madre pluripotentes, las ESC tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en cualquier tipo de célula embrionaria. Debido a su notable potencial de desarrollo y capacidad proliferativa a largo plazo, los CES son extremadamente valiosos para la investigación biomédica1. Los esfuerzos de investigación actuales se han centrado en gran medida en el potencial terapéutico de las CES para una variedad de trastornos patológicos importantes, como la diabetes, las enfermedades cardíacas y las enfermedades neurodegenerativas2,3,4.

Se sabe que las células de mamíferos, incluidas las CES, liberan vesículas con tamaños variables al entorno extracelular, y estas EV poseen muchas funciones fisiológicas y patológicas debido a su papel en la comunicación intercelular5. Entre los diferentes subtipos de EVs, los exosomas son pequeñas vesículas de membrana liberadas desde varios tipos de células en el espacio extracelular tras la fusión de compartimentos endocíticos intermedios, cuerpos multivesiculares (MVB), con la membrana plasmática6. Se ha informado que los exosomas median la comunicación intercelular y están críticamente involucrados en muchos procesos (pato)fisiológicos7,8. Los exosomas heredan algunas funciones biológicas de sus propias células parentales, porque los exosomas contienen materiales biológicos adquiridos del citosol, incluidas proteínas y ácidos nucleicos. Así, los antígenos o factores asociados que estimulan la respuesta inmune específica para una enfermedad dada se encapsulan en los exosomas de tipos particulares de células9. Esto allanó el camino para los ensayos clínicos que exploran los exosomas derivados de tumores como una vacuna contra el cáncer10.

GM-CSF es una citocina secretada por diferentes tipos de células inmunes11. La evidencia emergente demuestra que el GM-CSF activa y regula el sistema inmunológico y desempeña un papel esencial en el proceso de presentación de antígenos12. Por ejemplo, un informe clínico sugiere que GM-CSF estimula la respuesta inmune a los tumores como adyuvante de la vacuna13. Varias estrategias de inmunoterapia contra el cáncer basadas en GM-CSF para explotar la potente actividad inmunoestimuladora de GM-CSF han sido investigadas en ensayos clínicos14. Entre estos, una vacuna contra el cáncer compuesta de células tumorales secretoras de GM-CSF irradiadas ha demostrado ser prometedora en pacientes con melanoma avanzado al inducir respuestas antitumorales celulares y humorales y la necrosis posterior en tumores metastásicos15.

Debido a que los exosomas derivados de las CES poseen actividades biológicas similares a las CES originales, tal vez los exosomas portadores de GM-CSF de las CSC podrían funcionar como vesículas libres de células para regular la respuesta inmune. En este artículo, se describe un método detallado para producir vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas de alta calidad a partir de CES que expresan GM-CSF. Estos vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas tienen el potencial de servir como vesículas inmunorreguladoras para modular la respuesta inmune.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Cultivo de células ES-D3

  1. Para generar suero bovino fetal libre de exosomas (FBS), cargue FBS en una ultracentrífuga y centrífuga a 100.000 x g durante 16 h a 4 °C. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante sérico como FBS libre de exosomas para cultivar la línea celular ESC murina ES-D3 y adquirir EV enriquecidos con exosomas.
  2. Antes de emplatar las células ES-D3, cubra los platos de cultivo de tejidos de 15 cm con gelatina (0,1%) a temperatura ambiente durante 30 min.
  3. Siguiendo un protocolo16descrito anteriormente, culta las células ES-D3 sin células de capa alimentadora en las vajillas de cultivo de tejido de 15 cm recubiertas de gelatina. El medio de cultivo celular ES-D3 está compuesto por DMEM, FBS libre de exosomas (15%), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), L-glutamina (2 mM), β-mercaptoetanol (0,1 mM), penicilina (50 unidades/mL), estreptomicina (50 μg/mL) y factor inhibidor de la leucemia (LIF; 100 unidades/mL). Culta células ES-D3 a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2.
  4. Una vez que las células ES-D3 alcancen alrededor del 90% de confluencia en platos de cultivo de tejidos de 15 cm, retire el medio por aspiración. Lavar las células con tripsina (5 ml; 0,05%). Añadir tripsina (5 ml) a los platos e incubar a 37 °C durante 5 min. Recoge las células de los platos.
  5. Agregue un medio de cultivo fresco (5 ml) a las células recolectadas para inactivar la tripsina. Centrifugar las células a 390 x g durante 5 min. Resuspend las células en medio fresco y determine el número de células usando un hemocitómetro.
  6. Para las células de paso, placa las células ES-D3 (5 x 106) en una placa de cultivo de tejido de 15 cm recubierta de gelatina (0,1%) con medio fresco (15 ml) y cultivo durante 3 días antes de subcultivar las células.
  7. Para recolectar el sobrenadante de cultivo celular para el aislamiento de EVs enriquecidos con exosomas, coloca las células ES-D3 (1 x 107) en una placa de cultivo de tejido de 15 cm recubierta de gelatina (0,1%) con medio fresco (15 mL) durante 3 días antes de recolectar el sobrenadante de cultivo celular.

2. Generación de plásmido de expresión GM-CSF

NOTA: Generar el plásmido de transfección pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpresar GM-CSF en células ES-D3. En este plásmido, la expresión del ADNc gm-CSF murino junto con el marcador proteico humanizado Renilla reniformis GFP (hrGFP) es impulsado por el promotor del factor de elongación de la cadena polipeptídica humana 1α (EF1α)17,18.

  1. Generar la columna vertebral vectorial.
    1. Digerir el plásmido pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg de ADN) utilizando la enzima de restricción EcoRI (100 unidades) a 37 °C durante 2 h para generar dos fragmentos de ADN: la columna vertebral del vector (6,0 kb) y el inserto FD3ER (2,5 kb).
    2. Transfiera el 50% del ADN plásmido digerido (10 μg) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y trátelo con fosfatasa alcalina (20 unidades) a 37 °C durante 1 h. Resolver tanto el ADN no tratado como el desfosforilado mediante electroforesis en gel de agarosa (2%).
    3. Purificar los fragmentos de ADN de la columna vertebral del vector (6.0 kb) utilizando un kit de extracción de gel de ADN. Mientras que la columna vertebral del vector no tratado servirá como vector vacío (pEF1α-IRES-hrGFP), la columna vertebral del vector desfosforilado se utilizará para generar plásmido que expresa GM-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
  2. Genere el inserto gm-CSF cDNA.
    1. Digerir el plásmido pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) utilizando la enzima de restricción EcoRI (100 unidades) a 37 °C durante 2 h para producir dos fragmentos de ADN: la columna vertebral vectorial (6,5 kb) y el inserto murino GM-CSF cDNA (474 pb).
    2. Resolver el ADN digerido a través de la electroforesis en gel de agarosa (2%). Purificar el fragmento murino de ADNc GM-CSF (474 pb) utilizando un kit de extracción de gel de ADN.
  3. Generar los plásmidos de expresión.
    1. Configure 2 reacciones de ligadura (volumen total de 10 μL) utilizando un kit de ligadura de ADN.
      1. Para generar el vector vacío pEF1α-IRES-hrGFP, ligar la columna vertebral del vector no tratado a partir del paso 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).
      2. Para generar pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligar los siguientes fragmentos de ADN: (1) la columna vertebral del vector desfosforilado del paso 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) y (2) el fragmento de aDNc mGM-CSF generado en el paso 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
    2. Ligar a 25 °C durante 5 min. Transformar el ADN ligado en células de E. coli competentes en DH5α. Placa las células transformadas de E. coli en placas de LB-agar que contienen carbenicilina (50 μg/mL).
    3. Purificar plásmidos de colonias individuales de E. coli utilizando un kit de aislamiento de ADN. Validar las identidades de los plásmidos mediante secuenciación de ADN.

3. Generación de células ES-D3 que sobreexpresan GM-CSF

NOTA: Transfectar las células ES-D3 con el plásmido pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpresar GM-CS. Cotransfectar el plásmido pBabe-Neo en células ES-D3 para facilitar la selección de células transfectadas de forma estable18,20.

  1. Transfectar los plásmidos en las células ES-D3.
    1. Placa las células ES-D3 (1,4 x 106) en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm recubierta de gelatina (0,1%) con medio de cultivo (10 ml) para transfección. Cultivar células ES-D3 chapadas a 37 °C durante 24 h.
    2. Preparar dos mezclas de plásmidos en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, control vectorial) con pBabe-Neo (4 μg) y (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, expresando GM-CSF) con pBabe-Neo (4 μg). Realizar la transfección utilizando un kit de transfección siguiendo el protocolo del fabricante.
    3. Añadir medio de transfección (1 ml) y reactivo de transfección (64 μL) a cada tubo que contenga las mezclas de plásmidos e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Agregue las mezclas de transfección a los respectivos platos de 10 cm de células ES-D3. Incubar a 37 °C durante 5 h.
    5. Reemplace el medio en platos de 10 cm con medio de cultivo fresco (10 ml). Incubar a 37 °C durante 24 h.
  2. Generar poblaciones masivas de células ES-D3 transfectadas de manera estable.
    1. Retire el medio de las células ES-D3 transfectadas. Lavar las células con tripsina (2 ml; 0,05%). Añadir tripsina (2 ml) e incubar a 37 °C durante 5 min. Transfiera las células a un tubo centrífugo de 15 ml y agregue 2 ml de medio de cultivo fresco para neutralizar la tripsina. Centrifugadora a 390 x g durante 5 min.
    2. Resuspend las células transfectadas en medio de cultivo fresco (10 mL). Evaluar la intensidad de fluorescencia de GFP en células ES-D3 transfectadas utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), siguiendo el protocolo del fabricante.
    3. Transfiera las células transfectadas a dos platos de 10 cm que contengan un medio de cultivo fresco (10 ml). Añadir neomicina (0,5 mg/ml) para eliminar las células no transfectadas.
    4. Continuar cultivando las células transfectadas en medio de cultivo que contenga neomicina (0,5 mg/ml). Cuando el ES-D3 transfectado alcance el 90% de confluencia, transfiera las células a platos de cultivo de tejido de 15 cm nuevamente. Repita el procedimiento durante 2 semanas.
  3. Generar clones de células ES-D3 transfectadas de forma estable.
    1. Una vez que se generan poblaciones masivas de células ES-D3 transfectadas de manera estable, recoja las células como antes. Determine los números de células usando un hemocitómetro. Centrifugar las células a 390 x g durante 5 min. Resuspend las células (1 x 107 células/ml) en medio de cultivo fresco.
    2. Filtre las células a través de un colador de células estéril de 40 μm. Purifique las células ES-D3 GFP positivas utilizando FACS, siguiendo el protocolo del fabricante.
    3. Placa una sola célula ES-D3 clasificada en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos recubierta de gelatina (0,1%) que contiene células ES-D3 parentales (1 x 103) en medio libre de neomicina (200 μL). El cocultivo de células ES-D3 transfectadas con sus contrapartes parentales no transfectadas garantiza que las células ES-D3 individuales transfectadas de manera estable sobrevivan y proliferen como un solo clon.
    4. Culta las células durante 48 h y luego agregue neomicina (0,5 mg / ml) a placas de 96 póyes para eliminar las células ES-D3 parentales no transfectadas.
    5. Continuar cultivando las células ES-D3 GFP positivas en placas de cultivo de tejidos de 96 pozos con medio que contenga neomicina (0,5 mg/ml) durante 1 semana. Transferir líneas celulares clonales es-D3 a platos de cultivo de tejidos de 6 cm recubiertos de gelatina (0,1%) con medio de cultivo (5 ml) que contenga neomicina (0,5 mg/ml) durante 1 semana.
    6. Determinar la intensidad de la fluorescencia GFP en cada uno de los clones de células ES-D3 transfectadas utilizando FACS, siguiendo el protocolo del fabricante. Seleccione los clones de ES-D3 que expresan GM-CSF o el vector vacío con altos niveles de fluorescencia verde.
    7. Determine las cantidades de GM-CSF secretadas por las células ES-D3 utilizando un kit ELISA GM-CSF murino, siguiendo el protocolo del fabricante.

4. Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas

  1. Cultivo de las células ES-D3 (1 x 107) en platos de cultivo de tejidos de 15 cm durante 72 h a 37 °C. Recoger el sobrenadante de cultivo celular. Almacene el sobrenadante recolectado a 4 °C hasta 1 semana para mantener la integridad exosomal.
  2. Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular a 5.000 x g durante 60 min a 4 °C utilizando una centrífuga para sedimentar fragmentos celulares grandes.
  3. Recoger el sobrenadante y la centrífuga a 100.000 x g durante 90 min a 4 °C utilizando una ultracentrífuga.
  4. Retire el sobrenadante. Enjuague suavemente cada gránulo dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 1 ml) para eliminar el sobrenadante de cultivo residual.
  5. Resuspenda cada pellet en PBS. Cuantificar los EVs enriquecidos con exosomas por su contenido proteico5.
    1. Mida la concentración de proteínas de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas con un ensayo de ácido bicinconinico (BCA). El rendimiento esperado de los EV enriquecidos con exosomas de las células ES-D3 es de aproximadamente 4 μg de proteína/ml de sobrenadante de cultivo celular. Resuspend los EV enriquecidos con exosomas en PBS (concentración de proteínas: ~6 μg/μL). Guarde los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas a -80 °C.

5. Caracterización de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión

NOTA: Investigar la composición y la estructura de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas aislados de CES mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)5.

  1. Fije los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas (3-5 μg/μL) con una concentración final de paraformaldehído de grado EM al 2% a temperatura ambiente durante 2 h.
  2. Cargue muestras fijas (10 μL) en rejillas de cobre con película de soporte de carbono. Incubar las muestras con rejillas de cobre durante 1 minuto y luego drenar las rejillas con papel de filtro.
  3. Manche las rejillas con una solución de tinción siguiendo el protocolo del fabricante.
  4. Transfiera las rejillas a un trozo de papel de filtro con pinzas. Deje que las rejillas se sequen durante la noche a temperatura ambiente.
  5. Adquirir imágenes de microscopía electrónica utilizando un microscopio electrónico de transmisión (aumento de 50.000x), siguiendo el protocolo del fabricante.

6. Evaluación de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas mediante análisis de western blot

  1. Preparar extractos de células enteras.
    1. Retire el medio de las células ES-D3 cultivadas en platos de 15 cm. Lavar las células con tripsina (5 ml; 0,05%). Agregue tripsina (5 ml) a las células. Incubar a 37 °C durante 5 min. Recoger las células y añadir medio de cultivo fresco (5 ml) para neutralizar la tripsina. Centrifugar las células a 390 x g durante 5 min. Resuspend las células en PBS.
    2. Determine los números de células utilizando un hemocitómetro. Centrifugar las células de nuevo a 390 x g durante 5 min. Resuspend las celdas en el búfer de carga SDS-PAGE que contiene 0,5% SDS (5.000 celdas/μL).
    3. Sonicar las muestras durante 10 s utilizando un sonicador con 10% de amplitud (potencia: 500 W; frecuencia ultrasónica: 20 kHz). Calentar las muestras a 100 °C durante 5 min.
  2. Prepare los lisados de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas.
    1. Resuspend los EV enriquecidos con exosomas en tampón de carga SDS-PAGE que contiene 0,5% SDS a una concentración de 1,2 μg/μL.
    2. Sonicar las muestras durante 10 s utilizando un sonicador con 10% de amplitud (potencia: 500 W; frecuencia ultrasónica: 20 kHz). Calentar las muestras a 100 °C durante 5 min.
  3. Detectar proteínas por Western blot.
    1. Cargue extractos de células enteras (10 μL; 5.000 células/μL) y lisatos EV enriquecidos con exosomas (10 μL; 1,2 μg/μL) en cada pozo de un gel Bis-Tris PAGE (4-20%). Transfiera proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF).
    2. Incubar membranas con anticuerpos primarios y secundarios apropiados. Diluir los anticuerpos (en las concentraciones indicadas a continuación) en tampón secante que contenga PBS, Tween-20 (0,2%) y leche en polvo sin grasa (10% p/v).
      1. Utilice los siguientes anticuerpos primarios: anti-Anexina V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-citocromo c (100 ng/mL), anti-proteína disulfuro isomerasa (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) y anti-Oxphos COX IV-subunidad IV (600 ng/mL).
      2. Utilice los siguientes anticuerpos secundarios: IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa (20 ng/mL) e IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (20 ng/mL).
    3. Detecte proteínas utilizando un kit de detección de quimioluminescencia mejorado.

7. Determinación de las concentraciones de GM-CSF en vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas por ELISA

NOTA: Evalúe las cantidades de GM-CSF en vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas mediante ELISA utilizando un kit para GM-CSF murino, siguiendo el protocolo del fabricante con algunas modificaciones.

  1. Cubra la placa ELISA con anticuerpos de captura. Tratar los EVs enriquecidos con exosomas (0,6 μg) en PBS solo o PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) a temperatura ambiente durante 30 min. Agregue las muestras tratadas a la placa ELISA recubierta e incube a temperatura ambiente durante 1 h. Lave la placa con PBS solo o PBS + 0.05% Tween-20.
  2. Agregue anticuerpos de detección a las muestras. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lave la placa con PBS solo o PBS + 0.05% Tween-20. Agregue Avidin-HRP a las muestras. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Lave la placa con PBS solo o PBS + 0.05% Tween-20.
  3. Determine las concentraciones de GM-CSF en vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas midiendo la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Gm-CSF se sobreexpresa en las CES murinas.
Para sobreexpresar de manera estable GM-CSF en células ES-D3, el ADNc GM-CSF murino se clonó en un vector de transfección para generar el vector de expresión pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figura 1A). GM-CSF se sobreexpresó en las células ES-D3 por transfección, y alrededor del 20% de las células ES-D3 transfectadas transitoriamente fueron GFP positivas. Los clones celulares que sobree...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este estudio muestra un método altamente eficiente para producir vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas que transportan la proteína inmunoestimulante GM-CSF, que se puede emplear para estudiar los efectos inmunomoduladores de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas. Varios estudios sugieren que los exosomas exhiben funciones inmunorreguladoras y antitumorales22. Por lo tanto, los exosomas de las CES que expresan GM-CSF también podrían poseer actividades biológicas que regulan la...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li y John W. Eaton presentaron una solicitud de patente estadounidense "Composiciones que comprenden exosomas derivados de células madre embrionarias modificadas y métodos de uso de los mismos".

Agradecimientos

Agradecemos al Sr. Arkadiusz Slusarczyk y a kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) por adquirir imágenes de microscopio electrónico de transmisión. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 y CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) y Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fosfato alcalino, ternero intestinalNew England BiolabsM0290SPlásmido de ADN desfosforilante
anti-anexina V mAbCruzclon H-3, sc-74438blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAbSanta Cruz Biotechnologyclon B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
anti-citocromo c mAbSanta Cruz Biotecnologíaclon A-8, sc-13156blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillillin-1 mAbCruz Biotechnologyclon C-2; sc-74566blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33Sblot, RRID:AB_11182910
anti-ratón IgG de cabra, conjugado con peroxidasaThermo Fisher31430blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunidad IV mAbThermo Fisher20E8C12 A21348blot, RRID:AB_221509
anti-proteína disulfuro isomerasa (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890blot, RRID:AB_10616242
anti-conejo IgG, cabra, conjugada con peroxidasaThermo Fisher31460blot, RRID:AB_228341
Ensayo BCA (ácido bicinconínico)Thermo Fisher23223Determinación de las concentraciones de proteínas
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015blot
Carbenicillina, sal disódicaThermo Fisher10177012Selección de colonias E. coli
Centrífuga, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterCentrifugación de baja velocidad
Rotor centrífugo, JA-10Beckman Coulter09U1597de centrifugación de baja velocidad
, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKCu de centrifugación de baja velocidad
con película de soportede carbono Ciencias de la Microscopía ElectrónicaFF200-CuAdquisición de imágenes de microscopía electrónica
EcoRINew England BiolabsR0101Plásmido de ADN de digestión
Quimioluminiscencia mejorada sistema de detecciónThermo Fisher32106Western blot
FACScitómetro de flujo CaliburBecton DickinsonExamen de los niveles de GFP de las células ES-D3
Suero fetal bovinoATCCSCRR-30-2020Medio para células ES-D3
Fisherbrand Filtros de células estériles; Tamaño de malla: 40μ mThermo Fisher22-363-547Filtrado de células ES-D3 para la clasificación de FACS
Gelatina (0,1%)Thermo FisherES006BCultivo de células ES-D3
GM-CSF Kit ELISA THERMOFISHER Thermo Fisher88733422Determinación de las concentraciones de GM-CSF
KnockOut Dulbecco' s Águila Modificada' s MedioThermo Fisher10-829-018Medio para células ES-D3
Factor inhibidor de la leucemiaThermo FisherESG1106Medio para células ES-D3
L-glutaminaVWRVWRL0131-0100Medio para células ES-D3
Reactivo de transfección Lipofectamine 2000Thermo Fisher11668019Transfecting Celdas ES-D3
Lector de microplacas, PowerWave XSBioTekDeterminación de las concentraciones de GM-CSF Clasificador
de células de alta velocidad MoFlo XDPBeckman CoulterAislamiento de clones de células ES-D3 individuales
NEB 5-alfa E. coli competenteNew England BiolabsC2988JGeneración de plásmido de expresión de GM-CSF
Neomicina ThermoFisher10-131-035Selección de clones de ES-D3
Aminoácidosno esencialesMedio Thermo FisherSH3023801para células ES-D3
Leche en polvo descremadaThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Medio de suero reducidoThermo Fisher31985062Transfectación de células ES-D3
ParaformaldehídoMicroscopía electrónica Ciencias15710Adquisición de imágenes de microscopía electrónica
Penicilina/estreptomicinaVWRsc45000-652Medio para células ES-D3
plásmido pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270Generación de expresión de GM-CSF plásmido de expresión
de PVDF membranasMillipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106Generación de plásmido de expresión de GM-CSF
QIAquick Kit de extracción de gel (50)QIAGEN28704Generación de plásmido de expresión de GM-CSF
Kit de ligadura rápidaNew England BiolabsM2200SGeneración de plásmido de expresión de GM-CSF
Microscopio electrónico de transmisiónHitachiHT7700Adquisición de imágenes de microscopía
electrónica TripsinaVWR45000-660Cultivo de células ES-D3
Ultracentrífuga, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHigh centrifugación de velocidad
Rotor ultracentrífugo, 45TiBeckman Coulter09U4454Centrifugación de alta velocidad
Botella de policarbonato UltracentrífugaBeckman Coulter355622Centrifugación de alta velocidad
UranyLess solución de tinciónCiencias de la Microscopía Electrónica22409Adquisición de imágenes de microscopía electrónica
Santa Western Western Santa Western Western Western clon Western Western Western Western Botella de centrífuga Rejillas de

Referencias

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289(2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81(2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119(2019).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Sobreexpresión de GM-CSFProtocolo de ultracentrifugaciónMicroscopía electrónica de transmisiónAnálisis de Western blotKit de detección ELISAMétodo de aislamiento de exosomasSobrenadante de cultivo celularMarcadores exosomales
Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.