Hemos expuesto un sistema microfisiológico (MPS) con organoides intestinales y hepáticos al paracetamol (APAP). Este artículo describe los métodos para la producción de organoides y las evaluaciones de propiedades farmacocinéticas y toxicológicas APAP en el MPS. También describe los análisis de funcionalidad tisular necesarios para validar los resultados.
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Artículo de método
Un sistema microfisiológico intestinal/hepático para la evaluación farmacocinética y toxicológica de fármacos
En este artículo
Resumen
Resumen
Se espera que los sistemas microfisiológicos (MPS) que cultivan organoides humanos recientemente introducidos funcionen mejor que los animales en la fase de pruebas preclínicas del proceso de desarrollo de fármacos porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. En este estudio, la barrera intestinal humana (emulada por un co-cultivo de células Caco-2 y HT-29) y el equivalente hepático (emulado por esferoides hechos de células HepaRG diferenciadas y células estelares hepáticas humanas) se integraron en un dispositivo microfluídico chip de dos órganos (2-OC) para evaluar algunas propiedades farmacocinéticas (PK) y toxicológicas de paracetamol (APAP). El MPS tenía tres conjuntos: Intestina sólo 2-OC, Hígado sólo 2-OC, e Intestino/Hígado 2-OC con el mismo medio perfundiendo ambos organoides. Para las evaluaciones PK, dosificamos el APAP en los medios en los puntos de tiempo preestablecidos después de administrarlo ya sea sobre la barrera intestinal (emulando la vía oral) o en el medio (emulando la vía intravenosa), a 12 m y 2 M respectivamente. Las muestras de medios se analizaron mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en fase inversa. Los organoides se analizaron para la expresión génica, para los valores TEER, para la expresión y la actividad de las proteínas, y luego se recogieron, fijaron y sometieron a un conjunto de evaluaciones morfológicas. La técnica de MTT tuvo un buen desempeño en la evaluación de la viabilidad organoides, pero los análisis de alto contenido (HCA) fueron capaces de detectar eventos tóxicos muy tempranos en respuesta al tratamiento APAP. Verificamos que el flujo de medios no afecta significativamente la absorción APAP mientras que mejora significativamente la funcionalidad equivalente del hígado. La absorción intestinal humana APAP y el metabolismo hepático podrían emularse en el MPS. La asociación entre los datos MPS y el modelado en silicio tiene un gran potencial para mejorar la previsibilidad de los métodos in vitro y proporcionar una mayor precisión que los modelos animales en estudios farmacocinéticos y toxicológicos.
Introducción
Debido a las diferencias genómicas y proteómicas, los modelos animales tienen un valor predictivo limitado para varios resultados humanos. Además, son lentos, caros y éticamente cuestionables1. MPS es una tecnología relativamente nueva que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Son dispositivos microfluídicos que cultivan organoides (unidades funcionales de órganos miméticos artificiales) bajo un flujo de medios que promueve la comunicación organoide-organoides. Los organoides hechos de células humanas aumentan larelevanciatraslacional 2
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Protocolo
1. Producción de equivalentes de tejido para el cultivo en el 2-OC
- Producción equivalente a barrera del intestino delgado
- Mantener las células de Caco-2 y HT-29 utilizando el medio equivalente intestinal: DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales, que se nombra como "DMEM S" en este manuscrito.
- Retire el medio, lave dos veces con 1 DPBS y agregue 8 ml de 0,25% de trippsina/EDTA para disociar las células de Caco-2 cultivadas en matraces de cultivo celular (175 cm2). Incubar durante 5 min a 37oC y detener la reacción añadiendo al menos el doble volumen de inhibidor de la....
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Resultados
Para realizar las pruebas PK APAP en el MPS 2-OC, el primer paso es fabricar el intestino humano y equivalentes hepáticos (organoides). Se integran en el dispositivo microfluídico 2-OC (Figura 1A) 24 h antes de iniciar el ensayo PK APAP. Al día siguiente, el medio se cambia, y el modelo se expone a APAP. La Figura 1 ilustra los equivalentes del intestino y del hígado colocados dentro del dispositivo 2-OC (Figura 1B) y el curso de ti.......
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Discusión
La evaluación precisa y fiable de las propiedades farmacológicas de los nuevos fármacos de investigación es fundamental para reducir el riesgo en los siguientes pasos de desarrollo. El MPS es una tecnología relativamente nueva, que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Nuestro grupo está avanzando en la evaluación de las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas que se necesitan principalmente para la optimización del plomo. Trabajamos c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Christie Guguen-Guillouzo, al Dr. Philippe Gripon en la Unidad 522 INSERM y al Dr. Christian Trepo en la Unidad 271 INSERM por el uso del Material Biológico (células Hepa RG) y por ponernos a nuestra disposición con el fin de realizar la investigación académica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | Sin calcio, sin magnesio |
| 2-OC | TissUse GmbH | Chip de dos órganos | |
| Microplaca de esferoide de 384 pocillos | Corning | 3830 | Negro/Transparente, Fondo Redondo, Accesorio Ultrabajo |
| 4% Paraformaldehído | Úselo para fijar la célula | ||
| Paracetaminofén | Sigma Aldrich | A7085 | Uso para ensayos MPS |
| Acetonitrilo | Tedia | Se utiliza para realizar HPLC | |
| Alexa Fluor 647 faloidina | Thermo Fisher Experimento | confocal | |
| Acetato de amonio | Sigma Aldrich | Se utiliza para realizar | |
| HPLC Células Caco-2 | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Tampón | |||
| Matraces | de cultivo celularSarstedt | ||
| Microscopio de fluorescencia confocal | Leica DMI6000 | ||
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM alta glucosa | Thermo Fisher Scientific 12800017 | Añadir suplementos: 10% suero fetal bovino, 100 unidades por mL de penicilina, 100 &; g/mL de estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Agregue un 2% a los medios HepaRG |
| Etanol Synth | |||
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Medio de congelación OCT | Tissue-Tek | Tejido-Tek® O.C.T. y comercio; El compuesto es una formulación de glicoles y resinas solubles en agua, que proporciona una matriz de muestra conveniente para el corte de criostato a temperaturas de -10 grados; C e inferiores. | |
| Hematoxilina & Células | |||
| Biopredic International | HPR101 | Células indiferenciadas | |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Células y todos los suplementos de cultivo |
| Hoechst 33342 | Experimentos de HCA | ||
| Células HT-29 | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Insulina Humana | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hidrocortisona | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky' s fijador | |||
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 columna de protección SS | Phenomenex | Se utiliza para realizar HPLC | |
| Microscopio | Leica | DMi4000 | |
| Microtomo | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µ Insertos de tamaño de poro | m Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 metros | Merck | MERS00002 | utilizado para la medición de TEER |
| MitoTracker Deep Red | Experimentos de HCA | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| Sistema de MX3000P | Agilent Technologies | ||
| Cámara | NeubauerRecuento de células | ||
| Opereta Sistema de imágenes de alto contenido | Perkin Elmer | Se utiliza para realizar el ensayo HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 con Luciferina-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicilina/estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cultivo celular |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | ||
| Histology Primers | RT-qPCR | ||
| Membrana de PVDF | BioRad | ||
| PVDF Filtro | 0,22 μ m tamaño de poro | ||
| Fase reversa Columna Luna C18 | Phenomenex | Se utiliza para realizar HPLC | |
| Agitador (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Se utiliza para esferoides para mejorar el ensayo MTT |
| Medios de células estrelladas (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Añadir suplementos de STeC CM |
| SuperScriptIITM Transcriptasa | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| Reactivo TRizol TM | Thermo Fisher Scientific | Trizol es una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina. | |
| Solución de tripsina/EDTA | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Placas de fijación ultra baja | Corning | CLS3471-24EA | 6 pocillos |
| Medios de montaje | |||
| Microplaca blanca opaca de 96 pocillos | PerkinHelmer | ||
| Puntas | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Añadir suplementos: 10% suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 100 unidades por ml de penicilina, 100 µ g/mL de estreptomicina y 5 µ g/mL de insulina humana |
Referencias
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A.
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Reimpresiones y permisos
