Artículo de método

Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados

DOI:

10.3791/60197

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16 de septiembre de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Research, University of Veterinary Medicine Vienna

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se desarrolló un protocolo de microdisección de captura láser (LCM) para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica en células de cualquier tejido duro.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El rendimiento y la integridad del ARN son decisivos para el análisis del ARN. Sin embargo, a menudo es técnicamente difícil mantener la integridad del ARN a lo largo de todo el procedimiento de microdisección de captura láser (LCM). Dado que los estudios de LCM funcionan con cantidades bajas de material, también son importantes las preocupaciones sobre los rendimientos limitados del ARN. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. Se evaluó el efecto del protocolo de tinción, el grosor de las criosecciones, la cantidad de tejido microdiseccionado, el kit de extracción de ARN y el sistema LCM utilizado en el rendimiento del ARN y la integridad obtenida de las células óseas microdiseccionadas. Las secciones óseas congeladas de ocho m de espesor se hicieron con una película adhesiva y se teñiron utilizando un protocolo rápido para una mancha comercial de LCM. La muestra se emparedó entre una membrana de tereftalato de polietileno (PET) y la película adhesiva. Un sistema LCM que utiliza la gravedad para la recolección de muestras y un método de extracción de ARN basado en columnas se utilizaron para obtener ARN de alta calidad de rendimiento suficiente. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica in situ en células de cualquier tejido duro tanto en condiciones fisiológicas como en procesos de la enfermedad.

Introducción

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Los tejidos se componen de tipos de células heterogéneas y distribuidas espacialmente. Diferentes tipos de células en un tejido dado pueden responder de manera diferente a la misma señal. Por lo tanto, es esencial poder aislar poblaciones celulares específicas para la evaluación del papel de los diferentes tipos de células tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. La microdisección de captura láser (LCM) ofrece un método relativamente rápido y preciso para aislar y extraer células especificadas de tejidos complejos1. Los sistemas LCM utilizan el poder de un rayo láser para separar las células de interés de las secciones del tejido histológico sin necesidad de procesamiento enzimático o crecimiento en cultivo. Esto significa que las células están en su hábitat de tejido natural, y que la arquitectura del tejido incluyendo la relación espacial entre las diferentes células se mantiene. La morfología de las células capturadas y del tejido residual está bien conservada, y varios componentes de tejido se pueden muestrear secuencialmente desde la misma diapositiva. Las células aisladas se pueden utilizar para el análisis posterior de su ARN, ADN, proteína o contenido demetabolito2,3.

Para analizar la expresión génica en diferentes poblaciones celulares, o después de diferentes tratamientos, es necesario obtener ARNm de calidad y cantidad suficientes para el análisis posterior4,5. A diferencia del ADN, los ARN son más sensibles a la fijación y se recomienda el uso de tejido congelado cuando el objetivo es estudiar el ARN. Dado que los ARNm se degradan rápidamente por ribonucleasas ubicuas (RNase), se requieren condiciones estrictas libres de RNase durante la manipulación y preparación de muestras y evitar el almacenamiento de muestras a temperatura ambiente. Además, las técnicas rápidas sin pasos prolongados de fase acuosa son cruciales para prevenir la degradación del ARN6. El rendimiento y la integridad del ARN también pueden verse afectados por el proceso LCM y el sistema LCM utilizado7,8. Actualmente, hay disponibles cuatro sistemas LCM con diferentes principios de funcionamiento2. El método de extracción de ARN también puede ser importante, ya que se han probado diferentes kits de aislamiento de ARN con diferencias significativas en la cantidad de ARN y la calidad7,8.

Cualquier método de preparación de tejidos requiere encontrar un equilibrio entre obtener un buen contraste morfológico y mantener la integridad del ARN para análisis posteriores. Para la preparación de secciones congeladas a partir de hueso, se desarrolló una película adhesiva y se mejoró continuamente9. Las secciones óseas se cortan y se tiñen directamente sobre la película adhesiva. Esta película adhesiva es aplicable a muchos tipos de tinción, y se puede emplear para aislar las células de interés de las criosecciones óseas utilizando LCM9,10,11,12,13, 14. Todos los pasos, incluyendo la extracción quirúrgica, incrustación, congelación, corte y tinción se pueden completar en menos de una hora. Es importante destacar que las células como osteoblastos, células del revestimiento óseo y osteoclastos se pueden identificar claramente9,10,11,12,13,14. Este método tiene la ventaja de ser rápido y simple. Un método alternativo para generar criosecciones óseas es utilizar el sistema de transferencia de cinta15. Sin embargo, esta última técnica consume más tiempo y requiere instrumentación adicional, ya que las secciones tienen que ser transferidas desde la cinta adhesiva a diapositivas de membrana preenreadas por la reticulación ultravioleta (UV). Aunque el sistema de transferencia de cinta se ha acoplado con éxito con LCM16,17,18,19, debe tenerse en cuenta que el recubrimiento reticulado puede crear un patrón de fondo que puede interferir con la identificación de tipo de celda20.

Típicamente, sólo pequeñas cantidades de ARN se extraen de células microdisectadas, y la calidad y cantidad del ARN a menudo se evalúan por electroforesis microcapilar21. Un programa informático se utiliza para asignar un índice de calidad a extractos de ARN llamados número de integridad de ARN (RIN). Un valor RIN de 1,0 indica ARN completamente degradado, mientras que un valor de 10,0 sugiere que el ARN está totalmente intacto22. Por lo general, los índices de más de 5 se consideran suficientes para los estudios de ARN. Se han notificado patrones de expresión génica en muestras con un valor De RIN de 5,0 a 10,0 que se correlacionan bien entresí 23. Aunque la sensibilidad de este método es alta, ya que se puede detectar tan solo 50 pg/L de ARN total, puede ser muy difícil obtener una evaluación de calidad si la concentración de ARN en la muestra es muy baja. Por lo tanto, con el fin de evaluar la calidad del ARN, la sección de tejido restante después del LCM se utiliza a menudo para extraer el ARN, mediante el tampón de pipeteo en la diapositiva24.

Aunque LCM se ha utilizado ampliamente en diferentes tejidos congelados, los valores DeR de ARN extraídos rara vez se notifican. Además, no existen estudios comparativos para aclarar el método más adecuado para estudiar el ARN en los huesos del ratón. En el presente estudio, se utilizaron secciones congeladas de fémures ratón adultos para optimizar la preparación de la muestra, el protocolo LCM y la extracción de ARN con el fin de obtener ARN de alta calidad. El protocolo actual fue optimizado particularmente para el sistema LCM que utiliza la gravedad para la recolección de muestras.

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Protocolo

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El tejido óseo de ratones se utilizó en estricta conformidad con las directrices vigentes para el cuidado de los animales y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal.

1. Animales e incrustaciones de congelación

  1. Animales de la casa en condiciones de temperatura ambiente constante (RT; 24 oC) y un ciclo oscuro de 12 h de luz/12 h con acceso gratuito a alimentos y agua.
    NOTA: Los tejidos óseos de este estudio se obtuvieron de ratones machos de 3 meses de edad de tipo c57BL/6.
  2. En la necropsia, los ratones exsanguiados de la vena cava abdominal bajo anestesia general (ketamina/xilazina, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
    NOTA: Para evitar la degradación del ARN, utilice instrumentos y materiales libres de RNase, use guantes y trabaje rápidamente evitando el almacenamiento de muestras en RT durante todo el experimento.
  3. Retire los fémures enteros rápidamente, límpielos de los tejidos blandos circundantes con bisturí y toallas de papel. Vierta el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en el molde de incrustación y coloque el fémur en la parte inferior del molde de incrustación. Congelalas en nitrógeno líquido. OCT es transparente en RT y blanco cuando se congela.
  4. Una vez completamente congelados, envuelva las muestras en papel de aluminio y transfieralas en hielo seco a -80 oC. Almacene las muestras a -80 oC hasta su posterior procesamiento.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

2. Preparación de la sección

  1. Ajuste la temperatura en el criostato a -19 oC y del soporte del bloque a -17 oC. Limpie el interior del criostato con un 70% de etanol. Coloque la cuchilla desechable para los tejidos duros, los portaobjetos de vidrio y una herramienta de ajuste en el criostato para enfriar. Manténgalos dentro del criostato mientras dure el seccionamiento.
  2. Transfiera el bloque de tejido congelado en hielo seco al criostato y deje que se equilibre durante al menos 10 minutos.
    NOTA: Evite la descongelación repetitiva y el ciclismo frecuente de un bloque de -80 oC a -19 oC para la criosección.
  3. Presione la parte inferior del molde de incrustación para empujar el bloque OCT fuera del molde. Aplique suficiente medio OCT al soporte del bloque para adherir el bloque a él. Espere hasta que el medio OCT esté completamente congelado.
  4. Coloque el soporte de bloque en el soporte del objeto y apriételo en su lugar. Ajuste la posición de la hoja y recorte el bloque con incrementos de corte de 15 m para eliminar el OCT que cubre la muestra. Si la muestra se ha cortado antes y la superficie expuesta al aire, deseche las primeras 2 x 3 secciones de tejido del bloque.
  5. Ajuste el criostato para generar secciones de 8 m y corte 2 x 3 criosecciones que se descartarán (las primeras serán típicamente más gruesas que 8 m). Coloque la película adhesiva en el bloque y utilice una herramienta de ajuste para adherir la película al bloque. Haga el corte lentamente y a una velocidad constante manteniendo la sección por la película.
  6. Coloque la película (muestra hacia arriba) inmediatamente sobre un portaobjetos de vidrio preenfriado (en el criobar dentro del criostato) para evitar la descongelación de la muestra. Utilice cinta adhesiva para fijar la película a la diapositiva de vidrio para facilitar la tinción. Proceda inmediatamente con el protocolo de tinción.

3. Protocolo de tinción rápida

  1. Preparar 40 ml de las siguientes soluciones en tubos de 50 ml y ponerlas en hielo: 95% etanol, agua libre de RNase, 100% etanol, 100% etanol y 100% xileno. Realice todos los pasos sobre hielo (excepto la tinción). Para cada día experimental, prepare todos los reactivos acuosos frescos con agua libre de RNase.
    PRECAUCION: Trabaje en la capucha para evitar la intoxicación por xileno.
  2. Incubar secciones para 30 s en 95% etanol, luego sumergir las secciones 30 s en agua libre de RNase para eliminar OCT cuidadosamente y completamente que puede interferir con lCM y aplicaciones aguas abajo.
  3. Dispensar 50 l de mancha de sección congelada LCM comercial(Tabla de Materiales)en la sección, incubar durante 10 s en RT y drenarla colocando el borde de la corredera sobre papel de tejido absorbente. Elimine el exceso de manchas encerrando 30 s en 100% etanol.
  4. Sumerja las secciones óseas en un segundo tubo con 100% de etanol durante 30 s y transfiera las secciones al 100% de xileno durante 30 s.
  5. Coloque la película adhesiva (muestra hacia arriba) en el portaobjetos de vidrio seco como soporte. Tenga cuidado de que la película no se vea afectada y colocada lo más plana posible. No deje que la muestra se seque por completo.
  6. Coloque una diapositiva de marco de membrana PET en él. Presione en breve un dedo enguantado en la membrana para fijarlo a la película. La muestra se intercala entre la membrana y la película adhesiva. La película adhesiva no debe plegarse ni arrugarse y no debe haber burbujas de aire entre la película y la membrana. Proceda inmediatamente con el LCM.

4. Microdisección de captura láser

  1. Limpie el soporte de la etapa y la tapa de RNase utilizando descontaminante de superficie(Tabla de materiales). Cargue la corredera y las tapas del portaobjetos y del soporte de la tapa, respectivamente.
  2. Ajuste el enfoque y adquiera una visión general de la diapositiva con un objetivo de 1,25x. Cambie al objetivo 40x y ajuste el enfoque. Elija el área de interés utilizando el resumen de diapositivas. Ajuste los parámetros del láser de la siguiente manera: apertura, 7; potencia láser, 60; velocidad, 5; frecuencia de pulso, 201; saldo de especímenes, 20. Optimice estos parámetros para cada objetivo.
  3. Si el láser no logra cortar la muestra, aumente la potencia del láser. Alternativamente, el láser se puede aplicar más de una vez. Además, inspeccione el objetivo en busca de puntos de cortes incompletos y vuelva a dibujar la línea en estos puntos utilizando la opción Mover y cortar. Guarde la configuración del láser para la disección de diapositivas posteriores.
  4. Seleccione osteoblastos, osteocitos y células del revestimiento óseo en hueso sinmoral o de hueso cortical disal basado en criterios morfológicos. Dibuja una línea para la trayectoria del láser más lejos de las células objetivo para minimizar el daño por el láser UV. Realice todas las microdisecciones dentro de menos de 1 h después de la tinción.
  5. Recoja cada tipo de celda en una tapa separada de un tubo de 0,5 ml.
    NOTA: La captura en seco en lugar de la recuperación de líquidos puede evitar la degradación del ARN. Además, los volúmenes muy pequeños de tampón contenidos en la tapa del tubo de microcentrífuga pueden evaporarse o cristalizarse (dependiendo de su composición) durante el LCM.
  6. Confirme el éxito de la captura mediante la observación de la tapa del tubo de recogida después del LCM cuando corresponda. Proceda inmediatamente con la extracción del ARN.

5. Extracción de ARN

  1. Dispensar 50 l del tampón de lisis que contiene é-mercaptoetanol en la tapa del tubo de recogida y lijar la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo en la tapa durante 1 min. Si se van a agrupar varias tapas, tenga cuidado de que el volumen total de tampón sea el recomendado para el kit de extracción de ARN (Tabla de materiales).
    ADVERTENCIA: se debe añadir -mercaptoetanol para proteger el ARN de la degradación, pero se considera tóxico. Use ropa y guantes de protección y trabaje en la capucha.
  2. Además, para cada diapositiva prepare un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetado con 350 ml del tampón de lisis que contenga mercaptoetanol. Utilice las secciones restantes después del LCM para extraer el ARN. Separe cuidadosamente la película de la membrana y lise la muestra pipeteando lentamente el tampón de lisis en la sección varias veces.
    NOTA: La cantidad total de tampón de lisis debe ser de 350 l. No lo use todo a la vez para la digestión, ya que fluirá fuera de la diapositiva.
  3. Poner las muestras de lisado sobre hielo seco y almacenarlas a -80 oC.
    NOTA:     El protocolo se puede pausar aquí.
  4. Descongelar los lysates en RT. Transfiera los lysaatos de las células cosechadas por LCM de los tubos de recolección a los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Si se utilizó más de una tapa para cosechar la muestra, abarque varios lysates.
  5. Extraiga el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tratar columnas con DNase I para eliminar el ADN genómico. Elute el ARN con 14 l de agua libre de RNase, lo que resulta en un eluido de 12 l. Almacenar el ARN a -80 oC.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

6. Medición del rendimiento y la integridad del ARN

  1. Descongelar EL ARN sobre hielo húmedo. Mida el rendimiento y la integridad del ARN aislado utilizando electroforesis microcapilar. Cargue el ARN total (1 l por muestra) en un chip(Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Resultados

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Se desarrolló un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas de fémures ratón. En el protocolo optimizado, se cortaron secciones óseas congeladas de 8 m de espesor en una película adhesiva y se teñieron utilizando un protocolo rápido para una mancha de sección congelada LCM comercial. La muestra se emparedó entre la membrana PET y la película adhesiva. Las células óseas del ratón se microdiseccionaron utilizando un sistema LCM que util...

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Discusión

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Tanto la calidad como la cantidad de ARN pueden verse afectadas negativamente en todas las etapas de la preparación de la muestra, como la manipulación de tejidos, el proceso de LCM y la extracción de ARN. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el posterior análisis de la expresión génica.

Para LCM, la mayoría de los laboratorios utilizan secciones de 7 a 8 m de espesor2. Las secciones más gruesas permitirían la ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Ute Zeitz y Nikole Ginner por su excelente ayuda técnica, así como al personal de Vetcore y de cuidado de animales por su apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-MercaptoetanolSigma63689-25ML-F
Etanol absoluto EMPLURAMerck Millipore8,18,76,01,000
Película adhesiva (película LMD)Section-LabC-FL001
Sistema de bioanalizador Agilent 2100Agilent Technologies
Agilent RNA 6000 Pico Chip KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus HistoGene Solución de tinciónApplied Biosystems12241-05
Herramienta de montaje de criopelículaSection-LabC-FT000
Cryostat Leica CM 1950Leica Biosystems
Portaobjetos de microscopio de vidrio, color cortado naranja esmeriladoVWR Life Science631-1559
Histología Moldes de tejidos PVCMEDITE48-6302-00
LMD7  Láser  Mikrodissektion  SistemaLeica Microsystems
Cuchillas de micrótomo de perfil bajo Leica DB80 XLLeica Biosystems14035843496
Agua sin nucleasasVWR Life ScienceE476-500ML
Portaobjetos de membrana PET 1.4 μ mMáquinas moleculares & Industries GmbH50102
Descontaminante de superficies RNase AwayBioProduct Molecular7002
RNeasy Micro KitQiagen74004
Tissue-Tek compuesto de temperatura de corte óptima (OCT)Sakura Finetek4583
XilenoVWR Life Science2,89,73,363

Referencias

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