Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.
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Artículo de método
Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos
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Resumen
Resumen
Los astrocitos se encuentran entre los tipos de células más abundantes en el cerebro adulto, donde desempeñan un papel clave en una multiplicidad de funciones. Como un jugador central en homeostasis cerebral, los astrocitos suministran a las neuronas metabolitos vitales y amortiguan el agua extracelular, los iones y el glutamato. Un componente integral de la sinapsis "tri-partito", los astrocitos también son críticos en la formación, poda, mantenimiento y modulación de las sinapsis. Para permitir estas funciones altamente interactivas, los astrocitos se comunican entre sí y con otras células gliales, neuronas, la vasculatura cerebral y el entorno extracelular a través de una multitud de proteínas de membrana especializadas que incluyen moléculas de adhesión, aquaporinas, canales iónionales, transportadores de neurotransmisores y moléculas de unión de separación. Para apoyar este flujo dinámico, los astrocitos, como las neuronas, dependen del transporte intracelular estrechamente coordinado y eficiente. A diferencia de las neuronas, donde el tráfico intracelular se ha delineado ampliamente, el transporte basado en microtúbulos en astrocitos ha sido menos estudiado. No obstante, el tráfico exo y endocítico de proteínas de membrana celular y transporte intracelular de orgáyos organiza la biología normal de los astrocitos, y estos procesos a menudo se ven afectados por enfermedades o en respuesta a lesiones. Aquí presentamos un protocolo sencillo para el cultivo de astrocitos murinas de alta calidad, para etiquetar fluorescentemente proteínas astrocíticas y orgánulos de interés, y para registrar su dinámica de transporte intracelular utilizando microscopía confocal de lapso de tiempo. También demostramos cómo extraer y cuantificar los parámetros de transporte relevantes de las películas adquiridas utilizando plugins de software de análisis de imágenes disponibles (es decir, ImageJ/FIJI).
Introducción
Los astrocitos son las células más abundantes en el sistema nervioso central adulto, donde realizan funciones únicas de desarrollo y homeostáticos1. Los astrocitos modulan el desarrollo sináptico a través del contacto directo con terminales pre y postsinápticos como parte de la sinapsis tripartito, que contiene receptores de neurotransmisores, transportadores y moléculas de adhesión celular que facilitan la formación de sinapsis y comunicación neurona-astrocito2. Además, los astrocitos controlan activamente la transmisión sináptica y previenen la excitotoxicidad neuronal eliminando rápidamente los neurotransmisores excitatorios de la hendidura sináptica, los neurotransmisores de reciclaje, y participando en la poda sináptica3 , 4 , 5 , 6. Para permitir estas funciones altamente interactivas, los astrocitos se comunican entre sí, con otras células gliales, y con las neuronas a través de proteínas de membrana especializadas, incluyendo moléculas de adhesión celular, acuporinas, canales ióniales, transportadores de neurotransmisores, y moléculas de unión de brecha. Los astrocitos cambian activamente los niveles superficiales de estas proteínas en respuesta a las fluctuaciones en su entorno intra y extracelular7. Además, los cambios en los niveles y la distribución de las mitocondrias, las gotas lipídicas y los orgánulos dedegradadores y reciclados modulan el suministro de energía, la disponibilidad de metabolitos y los procesos de limpieza celular que son esenciales para la función astrocitos y Supervivencia.
Los cambios dinámicos en el tráfico y posicionamiento de proteínas de membrana y orgánulos en astrocitos seven facilitados por la función concertada de las proteínas motoras y adaptadores que promueven la motilidad de carga 8,9. Del mismo modo, los niveles superficiales de proteínas de membrana se modulan a través de eventos de internalización y reciclaje10. Estas cargas se transportan a través de una intrincada red de actina, microtúbulos y, posiblemente, filamentos intermediosdelas pistas 8. Los estudios basados en la tinción de inmunofluorescencia de la proteína de unión final 1 (EB1), que se acumula en los extremos del microtúbulo más, sugieren que en los haces de los astrocitos de microtúbulos irradian desde el perinúcleo y extienden su extremo más hacia el periferia11. Sin embargo, todavía falta un examen exhaustivo de la organización y polaridad de los microtúbulos y otros elementos citoesqueléticos mediante imágenes de células vivas. Mientras que muchos de los mecanismos subyacentes a la dinámica de los orgánulos y proteínas de membrana se han estudiado ampliamente en las neuronas y otros tipos de células, la motilidad de carga en los astrocitos es menos bien entendida. La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre los cambios en la distribución de proteínas y orgánulos en los astrocitos se basa en el etiquetado tradicional basado en anticuerpos de preparación fija, que impide el examen espacial y temporal preciso de la dinámica de carga7, 12.
Aquí, describimos un método para etiquetar proteínas de membrana y orgánulos para imágenes en vivo en cultivos primarios de astrocitos de ratón de alta pureza. Usando este protocolo, proporcionamos ejemplos en los que rastreamos la localización dinámica de proteínas de membrana etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) en astrocitos transinfectados, incluyendo la proteína de unión gap connexin 43 (Cx43-GFP) y el aminoácido excitatorio transportador 1 (EAAT1-GFP). También describimos el uso de una sonda acidotrópica fluorescente para visualizar orgánulos ácidos y seguir su dinámica de tráfico en astrocitos vivos. Por último, demostramos cómo analizar los datos de lapso de tiempo para extraer y evaluar los parámetros de transporte para cargas individuales.
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Protocolo
Todos los procedimientos de animales se realizaron con la aprobación de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Disección cerebral y cultura de los astrocitos primarios del ratón
NOTA: El siguiente protocolo se adaptó a partir de métodos publicados, que sigue el procedimiento original desarrollado por McCarthy y deVellis13,14,15. Los cultivos celulares mixtos de los astrocitos McCarthy/deVellis (MD) se preparan a partir de los córticos de ratón del día 2-4 (P2-P4) postnatal, tratados con un factor antimitótico, y purificados para producir el cultivo de astrocitos enriquecidos finales. Cuatro cortices de cachorros de ratón de ambos sexos son suficientes para generar un cultivo de matraz de cultivo de tejido T75.
- Recubrir la parte inferior de los matraces T75 (100% de acceso al cuello en ángulo, tapa de filtro ventilado hidrofóbico de 0,22 m) con poli-D-lisina (1 mg/ml en tampón Tris de 0,1 M, pH 8,5) e incubar a 37 oC durante 24 h antes del inicio de la disección.
- Antes de comenzar el procedimiento de disección, caliente 30 mL de medios de cultivo astrocitos (cañonó el medio de Eagle de Dulbecco [DMEM] de glucosa alta, 10% suero bovino fetal inactivado por calor, 1% penicilina/estreptomicina) a 37 oC y descongelar una alícuota de 5 ml de 2,5% de trippsina en hielo. Preparar dos platos de disección (60 mm de diámetro) sobre hielo relleno sin 6 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin Ca2+ o Mg2+.
- Desinfectar todas las herramientas quirúrgicas (pinzas finas de punta, tijeras de disección, tijeras Vannas rectas, fórceps Graefe con puntas curvas) en 70% etanol antes y entre cada disección.
- Rocíe la cabeza y el cuello de los cachorros de ratón P2-P4 con 70% de etanol antes de eutanasiarlos rápidamente por decapitación con tijeras quirúrgicas. Realice una incisión de línea media posterior a anterior a lo largo del cuero cabelludo para exponer el cráneo. Corte cuidadosamente el cráneo desde el cuello hasta la nariz.
- Realice dos incisiones laterales adicionales superiores a los ojos. Usando pinzas de punta fina, voltea suavemente las aletas del cráneo hacia un lado. Retire el cerebro y colóquelo en la primera placa de diseción llena de HBSS helado sin Ca2+ o Mg2+. Mantenga el plato en hielo y continúe cosechando el resto de los cerebros.
NOTA: Realice el resto del procedimiento de disección bajo un ámbito de disección. - Retire las bombillas olfativas con tijeras Vannas o pinzas finas (Figura1Ai). Con los fórceps de punta curvados en la intersección de las fisuras transversales e interhemisféricas, inserte suavemente un segundo par de fórceps de punta curvada entre la corteza y el diencéfalo, abriendo lentamente los fórceps para separar los hemisferios cerebrales del resto de el cerebro (Figura1Aii,Aiii). Retire el tejido no deseado (Figura1Aiv).
- Para cada hemisferio cortical, retire cuidadosamente las meninges con pinzas finas. Opcionalmente, retire el hipocampo de los cortices. Transfiera los cortices de ratón diseccionados en un segundo plato lleno de HBSS helado sin Ca2+ o Mg2+ y manténgalo en hielo mientras disecciona el cerebro restante.
NOTA: Realice los siguientes pasos en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar. - Corta los cortices diseccionados en trozos pequeños (aproximadamente 2 x 4 mm) usando tijeras quirúrgicas afiladas estériles o un bisturí. Transfiera el tejido diseccionado a un tubo cónico de 50 ml que contenga solución enzimática (22,5 ml de HBSS sin Ca2+ o Mg2+, 2,5 ml de trippsina al 2,5 ml). Incubar a 37oC durante 30 min con una suave inversión cada 10 min.
- Recoger el tejido digerido por centrifugación a 300 x g durante 5 min y eliminar la solución enzimática por decantación (no utilice un aspirador de vacío). Añadir 10 ml de medios de cultivo astrocito y disociar el tejido en células individuales pipeteando la solución de 20 a 30 veces utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
- Filtrar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 m para minimizar los grumos celulares y el tejido no digerido. Recoger el filtrado en un tubo cónico limpio de 50 ml y ajustar el volumen total a 20 ml con medios de cultivo astrocitos. En este punto, evaluar la eficiencia de la disociación cortical mezclando 10 l de la suspensión celular con 10 s de color azul de trippan y contando células con un hemocitómetro.
NOTA: Una preparación de cuatro cortices de ratón P2-P4 produce 10 x 15 x 106 celdas individuales. - Aspirar la solución de recubrimiento de poli-D-lisina de los matraces de cultivo T75 y lavar dos veces con agua estéril. Placar la suspensión celular de 20 ml e incubar a 37oC y 5% CO2.
2. Purificación y mantenimiento de las culturas astrocítas
NOTA: Realice todos los cambios de medios en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar utilizando medios de astrocito sellos filtrados estériles (membrana de filtro de 0,22 m) calentados a 37 oC.
- Sustituya el soporte celular 48 h después del enchapado (día in vitro 2, DIV2).
- En DIV5, sustituya los medios de comunicación por medios de cultivo de astrocitos frescos complementados con 10 m de citosina arabinósido (AraC).
NOTA: Este paso facilita la eliminación de células contaminantes, incluyendo fibroblastos y otras células gliales. Es importante tratar las culturas con AraC no más de 48 h ya que los tiempos de incubación más largos reduciránla viabilidad de los astrocitos. - En DIV7, cambie los medios de comunicación a los medios de cultura astrocitos sin AraC y comience a comprobar la confluencia cultural todos los días. Una vez que las células hayan alcanzado el 80% de confluencia, cubra los matraces de dos T75 para cada matraz de cultivo de astrocitos no purificados con poli-D-lisina e incubar a 37 oC durante al menos 8 h a la noche.
- Al día siguiente, comience la purificación de los astrocitos agitando los matraces de cultivo a 180 rpm durante 30 minutos en una incubadora de temblor orbital de 37 oC. Retire los medios y reemplácelos por medios de cultivo de astrocitos frescos. Agitar las células a 240 rpm durante 6 horas en una incubadora de temblor orbital de 37 oC. Prewarm 1x solución salina con fosfato (PBS), medios de cultivo de astrocitos, y 0.25% trypsin-EDTA a 37 oC 20-30 min antes del final del período de agitación.
NOTA: La incubación de CO2no es necesaria durantelos pasos de agitación. Si se desea, los medios recogidos después de los pasos de agitación de 30 minutos y 6 h se pueden utilizar para el cultivo de microglia y oligodendrocitos, respectivamente. El tratamiento de AraC del cultivo mixto, sin embargo, reducirá la abundancia de las otras células gliales. - Retire los matraces de cultivo de la coctelera y sustituya inmediatamente el medio por 10 ml de PBS caliente 1x por matraz. Retire el PBS y agregue 3 mL de 0.25% trypsin-EDTA por matraz. Incubar a 37oC y5% CO2, comprobando cada 5 min para el desprendimiento.
- Una vez que las células se hayan separado del matraz, detenga la trippsinización añadiendo 10 ml de medios de cultivo de astrocitos. Transfiera los astrocitos separados a un tubo cónico de 50 ml y células de pellets por centrifugación a 300 x g durante 5 min. Aspirar sobrenadante y volver a suspender las células en 40 ml de medios de cultivo de astrocitos.
- Lave dos dos veces los matraces T75 recubiertos de poli-d-lisina con agua estéril y la placa 20 ml de la suspensión de astrocitos purificados. Volver a la incubadora de 37oC y 5% de CO2. Cambia los medios de cultivo astrocitos cada dos días durante 10 días adicionales hasta que los astrocitos maduren.
NOTA: Cada matraz T75 de astrocitos purificados debe ser suficiente para producir 2 matraces Nuevos T75 con 3 x 105 celdas cada uno en chapado. - Repita los pasos 2.5-2.7 para pasadas posteriores o astrocitos de placa para microscopía.
NOTA: La pureza de los cultivos astrocitos después de la adición de AraC y después de la purificación se puede evaluar cualitativamente a través de la microscopía de campo brillante, o más precisamente mediante la cuantificación del porcentaje de proteína de ácido fibrilar glial (GFAP) positivo células por campo de visión en imágenes fluorescentes (Figura1B,C).
3. Transfección de plásmidos marcados fluorescentes
- El día antes de la transfección o el etiquetado, las semillas astrocitos a la densidad deseada para la toma de imágenes 24-48 h después de la transfección. Una densidad recomendada para placas de 24 pocillos o pozos inferiores de vidrio de 14 mm es 2 x 104 células/pozo.
NOTA: Este protocolo está optimizado para la transfección de astrocitos chapados en cubiertas de vidrio de 12 mm en placas de 24 pocillos o pozos inferiores de vidrio de 14 mm utilizando un método basado en lipofecciones. Los reactivos deben escalarse dependiendo del tamaño del plato de cultivo en el que los astrocitos están creciendo. - Diluir el reactivo de lipofección (Tablade materiales)en medios de suero reducido (Tablade materiales). Para optimizar la relación entre el reactivo de lipofección y el ADN, pruebe una serie de diluciones adecuadas. Por ejemplo, si se utiliza el reactivo empleado en este protocolo (Tablade materiales), diluir 2, 3, 4 y 5 l del reactivo de lipofección en 50 ml de medios de suero reducido.
- Diluir 5 g de ADN de alta pureza en 250 ml de medios séricos reducidos. Añadir 5 l de reactivo potenciador de lipofección (Tablade materiales). Combine el tubo que contiene el reactivo de lipofección con un volumen igual de la mezcla del potenciador de la lipofección de ADN. Mezclar en pipeteo e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
- Elimine los medios de cultivo de astrocitos y agregue la mezcla de transfección (paso 3.3) a las celdas con gota. Después de una incubación de 6 horasa 37oC y 5% de CO2, sustituya el complejo de transfección por un volumen adecuado de medios de cultivo de astrocitos (2 ml para platos inferiores de vidrio de 14 mm). Incubar durante 24 a 72 h adicionales antes de proceder a la adquisición de la imagen. Monitorear de cerca la duración del paso de incubación para lograr el mejor equilibrio entre la expresión de proteínas y la viabilidad celular.
4. Etiquetado de endosomas tardíos/lisosomas utilizando sondas fluorescentes
NOTA: Algunas cargas se pueden etiquetar con colorantes fluorescentes con alta afinidad por las proteínas específicas de la carga. El siguiente ejemplo permite el etiquetado de endosomas/lisosomas tardíos con una sonda acidotrópica fluorescente.
- Diluir la sonda de etiquetado lisosomal (Tablade materiales) en 200 s de medios de cultivo de astrocitos a una concentración de trabajo de 1 M y aplicar a los astrocitos del paso 3.1 a una densidad de 2 x 104 células/pozo. Incubar durante 30 min a 37oC.
- Lave las celdas una vez con medios de cultivo de astrocitos calientes y sustitúyalas por medios de imagen (Tablade materiales). Proceda a las imágenes en vivo inmediatamente.
5. Adquisición de imágenes mediante un sistema de imágenes de lapso de tiempo
NOTA: Las imágenes en vivo de lapso de tiempo deben realizarse utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad, enfoque definido, cámara de incubación y un objetivo de aceite 40x con una apertura numérica alta (por ejemplo, Plan-Apochromat 1.4NA). Una variedad de software de adquisición está disponible para imágenes de lapso de tiempo. La selección del sistema de microscopía y el software de adquisición deben basarse en su disponibilidad e idoneidad para los objetivos del estudio en particular. A continuación se proporcionan algunas directrices generales.
- Coloque la cámara de cultivo o el plato en el adaptador adecuado en el escenario del microscopio. Usando la luz de epifluorescencia, seleccione las células que expresan proteínas fluorescentes o sonda para registrar. Ajuste la iluminación de la muestra fluorescente para visualizar las celdas seleccionadas con la cámara digital. Evite el uso de iluminación alta que podría causar fotoblanqueo y fototoxicidad. Ajuste el enfoque y el zoom.
- Adquiera una sola serie de lapso de tiempo de pila Z a una frecuencia de 1 fotograma cada 2 s para intervalos de tiempo que oscilan entre 300 s y 500 s utilizando las funciones de zoom y enfoque definido.
NOTA: La dinámica de tráfico (velocidad, frecuencia de movimiento, etc.) variará dependiendo de la proteína de interés, por lo tanto, el tiempo de adquisición puede requerir ajuste. Por ejemplo, las mitocondrias son menos motiles que los lisosomas y presentan pausas frecuentes. En este caso, es más apropiado ajustar los parámetros de adquisición a 1 fotograma cada 5 s para 800 s. - Guarde imágenes de lapso de tiempo y expórtelas como archivos de pila AVI o TIFF.
6. Análisis de imágenes
NOTA: El análisis de imágenes se realizó utilizando el plugin KymoToolBox para ImageJ/Fiji16. Las instrucciones detalladas por escrito paso a paso están disponibles en línea17. Los siguientes pasos abreviados deben ser suficientes para crear los kymographs y extraer los parámetros de transporte de partículas.
- Secuencia de imágenes de lapso de tiempo abierto en el software ImageJ/Fiji. Importe imágenes desde el menú Archivo como archivos de pila AVI o TIFF. Convierta las imágenes a 8 bits o 16 bits seleccionando uno de estos tipos de imagen mediante la herramienta Texto del menú Imagen. Si trabaja con archivos RGB, divida los canales con la herramienta Dividir canal disponible en la función Color del menú Imagen.
- Para generar un kymograph (representación en posición y tiempo de trayectorias de partículas), dibuje cada pista en la que se mueven las partículas trazando una línea a lo largo de las trayectorias de las partículas utilizando la herramienta de línea segmentada. Para asignar correctamente la direccionalidad del movimiento, dibuje la polilínea utilizando la misma convención direccional deseada para todas las películas de modo que la polaridad sea coherente dentro y entre todas las celdas que se están estudiando. Por ejemplo, dibuje la polilínea desde el centro de la celda hacia la periferia o viceversa. Ajuste el ancho de línea para que coincida con el grosor de la pista haciendo doble clic en la herramienta Línea.
- Ejecute la macro Draw Kymo del plugin KymoToolBox usando un ancho de línea de 10. Aparecerá un mensaje que pide calibrar la imagen en el tiempo (número de fotogramas, velocidad de fotogramas) y espacio (resolución x,y). Una vez calibrados, los kymographs se generan y se pueden guardar como archivos TIFF para la presentación de datos o el análisis de partículas posterior.
- Asigne trayectorias de partículas rastreando manualmente cada partícula en el kymograph utilizando la herramienta de línea segmentada durante toda la duración de la adquisición. Registre cada trayectoria de partículas como una región de interés (ROI) utilizando la herramienta administrador de ROI que se encuentra en el menú Analizar/Herramientas. Guarde todos los ROI por cada vídeo de lapso de tiempo para su posterior análisis.
NOTA: Es fundamental asignar la trayectoria correcta para partículas individuales en el kymograph para lograr el cálculo más preciso de los parámetros de transporte.- Ejecute la macro Analyze Kymo del plugin KymoToolBox. Se abrirá una ventana que pide definir la dirección "hacia afuera" del movimiento de partículas (de izquierda a derecha o viceversa) en el menú desplegable. Esta selección depende de la posición de las cargas fluorescentes que se muestren en relación con el núcleo o la periferia celular, como se establece en el paso 6.2. Por ejemplo, si el núcleo está situado a la izquierda de las cargas, y la polilínea en el paso 6.2 se alejó del núcleo, defina el movimiento de la partícula externa como "de izquierda a derecha".
- Defina la velocidad límite (velocidad mínima a la que una carga se considera móvil) en la ventana Analizar Kymo. Para las cargas que se mueven a velocidades de transporte intracelulares rápidas, 0,1 m/segundo es una opción adecuada. Modifique este valor para ajustar la sensibilidad del software a cada carga de interés. Ajuste el ancho de línea para que coincida con el grosor de cada trayectoria de partícula.
- Seleccione las opciones Registrar todos los datos y Registrar coordenadas extrapoladas en la ventana Analizar kymo. Esto calculará varios parámetros de transporte de carga, incluyendo la velocidad media, la velocidad de entrada, la velocidad exterior, la distancia acumulada recorrida, la distancia recorrida en la dirección de entrada o exterior, el número de interruptores para cada partícula, el porcentaje de tiempo moviéndose en cada dirección o en pausa, etc. Los datos calculados para pistas individuales se agrupan por kymograph y se guardan en archivos de texto específicos de cada imagen.
NOTA: La opción Mostrar Kymo de color de la macro Analizar Kymo genera una superposición codificada por colores de la ruta sobre el kymograph original. Las partículas que viajan hacia afuera están coloreadas en verde, hacia adentro en rojo y partículas estacionarias en azul. La opción Coordenadas de informe en la pila original de la macro Analizar Kymo genera una superposición codificada por colores de la posición del objeto extrapolado en el vídeo y el kymograph originales de lapso de tiempo.
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Resultados
El protocolo para establecer astrocitos MD de ratón primario descrito anteriormente debería producir cultivos reproducibles y de alta calidad. Aunque los cultivos inicialmente contienen una mezcla de astrocitos, fibroblastos y otras células gliales, incluyendo microglia y oligodendrocitos (Figura1Bi,Biv;puntas de flecha rojas), la adición de AraC al cultivo mixto entre DIV5-DIV7 minimiza la proliferación de estas células contaminantes. El tratamiento combinado de AraC y la e...
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Discusión
Aquí, describimos un enfoque experimental para expresar, visualizar y rastrear orgánulos y proteínas de membrana etiquetados fluorescentemente de interés utilizando microscopía de vídeo de lapso de tiempo en astrocitos corticales MD de ratón primariode mayor pureza. También delineamos una metodología para medir la dinámica de partículas. La visualización directa de la dinámica de proteínas y orgáulos en astrocitos primarios proporciona una poderosa herramienta para estudiar la regulación del transporte intracelular en es...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
DNL fue apoyado por la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill (UNC) School of Medicine como becario Simmons. TWR fue apoyado por UNC PREP Grant R25 GM089569. El trabajo que utilizaba el Fondo de Microscopía del Centro de Neurociencia de la UNC fue apoyado, en parte, mediante la financiación del NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 y la NiH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Grant U54 HD079124.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2.5% Tripsina (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Centrífuga de sobremesa | Thermo Scientific | 75-203-637 | Centrífuga Sorvall ST8 Grado |
| cultivo celular | Clon de agua Gen Clon | 25-511 | |
| Microscopio de cultivo celular | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 visor invertido, Microscopio de cultivo de tejidos invertido con capacidades fluorescentes |
| Arabinósido de citosina | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Disuelva el polvo liofilizado en agua estéril de grado de cultivo celular para hacer un stock de 10 mM, alícuota y congele para el almacenamiento a largo plazo |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Disuelva el polvo liofilizado en agua desionizada a una concentración máxima de 20 mg / ml, caliente o sonique según sea necesario. Úselo a 300 nM para contratinción. |
| Microscopio de disección | Zeiss | Stemi 305 | |
| Tijeras de disección | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Suero fetal bovino | Gemini | 100-106 | FIJI inactivado por calor |
| (Fiji es solo imagen J) | fina NIH | versión 1.52i | |
| F.S.T | 11254-20 | Estilo #5 | |
| Fuente de luz fluorescente | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP anticuerpo | Señalización celular | 3670S | GFAP (GA5) anticuerpo monoclonal de ratón |
| Platos con fondo de vidrio | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C Plato de | 35 mm | Nº 1.5 Cubreobjetos | Diámetro de vidrio de 14 mm | |
| Pinza Graefe | F.S.T | 11054-10 | Pinza de iris Graefe con puntas curvas |
| Tinte fluorescente verde que tiñe compartimentos ácidos (endosomas tardíos y lisosomas) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Predisuelto en DMSOS hasta obtener una solución madre de 1 mM. Diluir hasta la concentración final de trabajo en el medio de crecimiento o tampón de elección. |
| Solución salina equilibrada de Hank (10x) | Gibco | 14065-056 Medios de | sin magnesio ni calcio |
| Life Technologies | A14291DJ | solución de imagen de células vivas | |
| Microscopio confocal invertido | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Reactivo potenciador de lipofectión | Life Technologies | 11514015 | Plus Reactivo Reactivo |
| de lipofección | Life Technologies | 15338100 | Reactivo Lipofectamine LTX |
| Incubadora de agitación orbital | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , incubadora de agitación orbital con control de temperatura y velocidad |
| Solución de penicilina/estrepomicina (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Disolver en tampón Tris, pH 8.5, a 1 mg / mL. Congele para almacenamiento a largo plazo. Evite los ciclos de congelación y descongelación |
| Medio sérico reducido | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Matraces de cultivo de tejidos | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. Acceso al cuello 100% en ángulo, 0,22 um Tapa de filtro ventilada hidrofóbica |
| Incubadora de cultivo de tejidos | Thermo Scientific | 51030285 HERAcell VIOS 160i, incubadora de cultivo de tejidos con control | |
| de temperatura, humedad y CO2Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g disuelto en un litro en agua con 4.829 g Tris HCl para hacer 0.1 M Tampón Tris, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g disuelto a un litro en agua con 8.402 g Tris Base para hacer 0.1 M Tampón Tris, pH 8.5 |
| Tripsina-EDTA (0.25%), rojo fenol | Gibco | 25200072 | |
| Sistemas de filtro accionados por vacío | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, membrana PES, 0,22 y micro; m |
| Tijeras Vannas rectas | Roboz | RS-5620 |
Referencias
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