Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.
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Artículo de método
Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático
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Resumen
Resumen
Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas son una herramienta importante en la biología celular que proporciona información sobre los procesos celulares que de otro modo podrían ser pasados por alto, malinterpretados o malinterpretados por el análisis de células fijas. Si bien la imagen y el análisis de células fijas son robustos y suficientes para observar el estado estacionario celular, puede ser limitado en la definición de un orden temporal de eventos a nivel celular y está mal equipado para evaluar la naturaleza transitoria de los procesos dinámicos, incluyendo progresión mitotica. Por el contrario, la imagen celular viva es una herramienta elocuente que se puede utilizar para observar procesos celulares a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo y tiene la capacidad de capturar la dinámica de procesos que de otro modo estarían mal representados en las imágenes de células fijas. Aquí describimos un enfoque para generar células que llevan marcadores etiquetados fluorescentesmente de cromatina y microtúbulos y su uso en enfoques de imágenes de células vivas para monitorear la alineación del cromosoma metafásico y la salida mitótica. Describimos técnicas basadas en imágenes para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitológica, incluida la identificación de células en varias etapas de la mitosis, la identificación y el seguimiento de defectos mitoticos, y el análisis de la dinámica del husillo y destino de células mitoticas tras el tratamiento con inhibidores mitoticos.
Introducción
El análisis basado en imágenes de células fijas se utiliza comúnmente para evaluar los cambios en el nivel de población celular en respuesta a diversas perturbaciones. Cuando se combina con la sincronización celular, seguida de la recopilación y la creación de imágenes de puntos de tiempo en serie, estos enfoques se pueden utilizar para sugerir una secuencia celular de eventos. Sin embargo, las imágenes de células fijas están limitadas en el sin embargo, las relaciones temporales están implícitas para una población y no se demuestran a nivel de celdas individuales. De esta manera, mientras que la creación de imágenes y análisis de células fijas es suficiente para obse....
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Protocolo
1. Generación de células hTERT-RPE-1 que expresan establemente RFP-Histone 2B (RFP-H2B) y -tubulin-EGFP (tub-EGFP)
NOTA: Todos los pasos siguen técnicas asépticas y tienen lugar en un armario de seguridad de nivel de bioseguridad II+ (BSL2+).
- Generar retrovirus que lleven los genes de interés (-tubulina-EGFP y RFP-H2B) por la transfección de células 293T con los plásmidos lentivirales apropiados de acuerdo con las instrucciones del fabricante del sistema de administración de transfección basado en lípidos.
- Día 1: Utilice una pipeta Pasteur de vidrio desechable para aspirar el medio de cultivo celular de una placa de célula....
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Resultados
Evaluación de la progresión mitotica en presencia de perturbaciones del husillo
La regulación del enfoque del polo del husillo es un paso esencial en la formación adecuada del husillo bipolar. Interrupción en este proceso a través de agotamiento de proteínas, inhibición de fármacos o alteraciones en el número centrosoma estructura del husillo corrupta y retrasar o detener la progresión mitológica10,11,
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Discusión
La resolución temporal proporcionada por las imágenes de lapso de tiempo permite la visualización y evaluación de eventos celulares secuenciales dentro de células individuales. Los enfoques que hacen uso de la sincronización celular seguido de la recopilación y fijación de celdas en puntos de tiempo secuenciales son limitados en que las comparaciones se hacen en última instancia entre poblaciones de celdas. En contextos donde la respuesta celular a las perturbaciones puede ser no uniforme, o donde el proceso que se visua.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
DLM es compatible con un NSF GRFP. ALM cuenta con el apoyo del Premio Smith Family a la Excelencia en Investigación Biomédica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina | Gibo-Life sciences | 25-510 | Una serina proteasa utilizada para liberar células adherentes de placas de cultivo |
| Tubos de centrífuga de 15 ml | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objetivo | Nikon | Para uso en imágenes de células vivas para visualizar tanto el campo brillante como la fluorescencia | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | Para uso en transfección retroviral; utilizado en el paso 1.1 |
| a-tubulina-EGFP | Vector | de expresión de alfa tubulina fusionada a una etiqueta de proteína fluorescente verde; para su uso en la visualización de tubulina en imágenes de células vivas: disponible comercialmente a través de addgene y otros proveedores | |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Inhibidor de molécula pequeña de la quinasa mitótica Aurora A. La concentración de stock se prepara a 10 mM en DMSO y se utiliza a una concentración final de 100 nM. |
| Blasticidina | Invitrogen | A11139-03 Agente de | selección de antibióticos; utilizado para seleccionar células que expresan |
| C02 | Gas | en cultivos celulares e imágenes de células vivas | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Juego de filtros de banda única; longitud de onda de excitación 545 nm con un ancho de banda de 25 nm y emisión a una longitud de onda de 605 nm con un ancho de banda de 70 nm; para la visualización de H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Juego de filtros de banda única; longitud de onda de excitación 470 nm con ancho de banda de 40 nm y emisión a 525 nm longitud de onda con ancho de banda de 50 nm; para la visualización de |
| pipetas Pastuer de vidrio desechables GFP-tubulina, esterilizadas | Fisher Scientific | 13-678-6A | Para uso en células aspirantes |
| Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM) | Gibo-Ciencias de la vida | 11965-084 | Medio de cultivo celular para el crecimiento de células RPE-1 y 293T |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibo-Ciencias de la vida | 10438-026 | Suplemento de medio de cultivo celular |
| Lipofectamine 3000 y p3000 Invitrogen | L3000-015 | Reactivo de transfección a base de lípidos para la transfección de plásmidos; utilizado en 1.1.4 Placas de cultivo de | |
| tejidos de pocillos múltiples | Corning | varios | para su uso en cultivo celular, transfección/infección e imágenes de células vivas |
| Microscopio Nikon Ti-E | Microscopio de epifluorescencia invertida Nikon para uso en imágenes de células vivas | ||
| Nikon | versión 4.51 | Software de adquisición y análisis de imágenes; utilizado en las secciones 3 y 4 | |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Medio sérico reducido para la transfección celular; utilizado en el paso 1.1.3 |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiótico utilizado en medio de cultivo celular |
| tampón de fosfatosolución salina roja (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | solución salina estéril para uso con cultivo celular |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Construcción de expresión de envoltura lentiviral VSV-G; utilizado en el paso 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Polímero catiónico utilizado para mejorar la eficacia de la infección viral; utilizado en el paso 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | plásmido de empaquetamiento lentiviral de 2ª generación; utilizado en el paso 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Agente de selección de antibióticos; utilizado para seleccionar células que expresan RFP-H2B |
| RFP- Histona 2B (H2B) | Addgene | varios números | Vector de expresión para la histona 2B marcada con proteínas fluorescentes rojas; para su uso en la visualización de la cromatina en la obtención de imágenes de células vivas: disponible comercialmente a través de Addgene y otros proveedores |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Reactivo de transfección a base de lípidos para la transfección de construcciones de siRNA |
| células RPE-1 | ATCC | CRL-4000 | Línea celular epitelial de pigmento de retina humana |
| Placa de cultivo de tejidos 100x20mm | Corning | 353003 | para su uso en el cultivo de células adherentes |
| Cámara Zyla sCMOS | Nikon | conectada al micrscopio, utilizada para capturar imágenes de células |
Referencias
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochor....
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Reimpresiones y permisos
