Los ensayos de interacción de cocultura presentados en este protocolo son económicos, de alto rendimiento y simples. Estos ensayos se pueden utilizar para observar interacciones microbianas en el cocultivo, identificar patrones de interacción y caracterizar el potencial inhibitorio de una cepa microbiana de interés contra patógenos humanos y ambientales.
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Artículo de método
Ensayos de cocultura de alto rendimiento para la investigación de interacciones microbianas
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Resumen
Resumen
El estudio de las interacciones entre microorganismos ha dado lugar a numerosos descubrimientos, desde nuevos antimicrobianos hasta perspectivas en la ecología microbiana. Muchos enfoques utilizados para el estudio de las interacciones microbianas requieren equipos especializados y son costosos e intensivos en tiempo. Este artículo presenta un protocolo para ensayos de interacción de cocultura que son baratos, escalables a grandes números de muestra y fácilmente adaptables a numerosos diseños experimentales. Los microorganismos se cultivan juntos, y cada uno de ellos representa una combinación de microorganismos en pares. Un organismo de prueba se cultiva en un lado de cada pozo y primero se incuba en monocultivo. Posteriormente, los organismos objetivo se inoculan simultáneamente en el lado opuesto de cada pozo utilizando un sello de inoculación impreso en 3D. Después del cocultivo, los ensayos completados se puntúan para fenotipos visuales, como el crecimiento o la inhibición. Estos ensayos se pueden utilizar para confirmar fenotipos o identificar patrones entre aislados de interés. Utilizando este método simple y eficaz, los usuarios pueden analizar combinaciones de microorganismos de forma rápida y eficiente. Este enfoque de cocultura es aplicable al descubrimiento de antibióticos, así como a la investigación de microbiomas basada en cultivos y ya se ha aplicado con éxito a ambas aplicaciones.
Introducción
En la naturaleza, los microorganismos rara vez existen de forma aislada; consecuentemente, están constantemente interactuando con otros organismos. Por lo tanto, estudiar cómo los microorganismos interactúan entre sí es esencial para entender una multitud de comportamientos microbianos1. Las interacciones microbianas pueden ser mutualistas, commensales o antagónicas. Estos en las teracciones pueden afectar no sólo a los propios microorganismos, sino también a los ambientes y huéspedes que los microorganismos colonizan1,2.
Muchos científicos estudian las interacciones microbianas para identificar nuevas moléculas antimicrobianas. Una de las primeras moléculas antimicrobianas clínicamente importantes se encontró a través del estudio de interacciones microbianas. Sir Alexander Fleming observó un aislado de Penicillium spp. contaminante que inhibió el crecimiento de una cepa de Staphylococcus, que condujo al descubrimiento de la penicilina antibiótica comúnmente utilizada3. La caracterización de los mecanismos que utilizan los microorganismos para antagonizar a sus competidores sigue siendo un recurso fructífero para el descubrimiento de moléculas antimicrobianas. Por ejemplo, recientemente se demostró que Streptomyces sp. cepa Mg1 produce linealinas antibióticas, que tienen una actividad lítica y degradante contra Bacillus subtilis4.
Además, un péptido no ribosólomo sintetizado llamado lugdunin fue descubierto recientemente después de la observación de que la comensal nasal Staphylococcus lugdunensis inhibe Staphylococcus aureus5. Los estudios también han demostrado que las interacciones mutualistas entre microorganismos son tan poderosas como las interacciones antagónicas para el descubrimiento de moléculas antimicrobianas. Por ejemplo, muchas hormigas que cultivan hongos en la tribu Attini albergan bacterias simbióticas llamadas Pseudonocardia en su exoesqueleto que produce moléculas antifúngicas para inhibir un patógeno obligatorio de su cultivo de hongos6. Como el estudio de las interacciones microbianas ha sido beneficioso para descubrir moléculas antimicrobianas, el uso de pantallas de alto rendimiento puede dar lugar al descubrimiento de nuevas moléculas antimicrobianas.
Con respecto al costo y la facilidad de rendimiento, las metodologías utilizadas para estudiar las interacciones microbianas van de simples a complejas. Por ejemplo, un ensayo de tapón de agar es un método económico y simple que se puede utilizar para investigar el antagonismo entre múltiples microorganismos7. Sin embargo, un ensayo de tapón de agar no es un procedimiento eficiente y puede ser laborioso para muchas combinaciones por pares. Para evaluar los efectos de los productos producidos microbianamente en los aislados objetivo de interés de una manera de alto rendimiento, muchos laboratorios utilizan ensayos de difusión de discos8. Estos ensayos son fáciles y económicos y pueden ser escalables a un mayor número de muestras7. Sin embargo, este ensayo requiere la generación de extractos microbianos y puede producir resultados engañosos para ciertas combinaciones de organismos objetivo y antibióticos, como Salmonella y cefalosporinas9.
Los enfoques anteriores se basan en componentes aislados para dar lugar a una respuesta en un organismo objetivo, en lugar de permitir que los microorganismos interactúen entre sí. Esto es de nota porque las interacciones entre microbios pueden provocar la producción de moléculas antimicrobianas "crípticas" que no se producen en el monocultivo. Por ejemplo, recientemente se demostró que la keyicina antimicrobiana sólo es producida por un Micromonospora sp. cuando se co-cultiva con un Rhodococcus sp. que se aísla del mismo microbioma de esponja10. Las metodologías de interacción más complejas eluden este posible obstáculo monocultivo. Por ejemplo, el iChip es útil para aislar bacterias raras y difíciles de cultivar a partir de muestras ambientales y permite la observación de interacciones microbianas a través del crecimiento en el situ11. Para investigar las interacciones en detalle, se puede utilizar la desorción/ionización por láser asistida por matriz con espectrometría de masas de imágenes de tiempo de vuelo (MALDI-TOF-IMS). Este enfoque proporciona información detallada sobre la composición y distribución de moléculas pequeñas y péptidos producidos por colonias microbianas interactuando con alta resolución espacial. MALDI-TOF-IMS también se ha utilizado en múltiples estudios de interacciones bacterianas para caracterizar los mecanismos de competencia12,13,14,15. Sin embargo, MALDI-TOF-IMS a menudo requiere una laboriosa preparación de muestras, experiencia especializada para operar el equipo y espectrómetros de masas costosos y especializados. Por estas razones, es una técnica difícil de usar para estudios de alto rendimiento. Por lo tanto, un ensayo de cocultura simple, escalable y de alto rendimiento para interacciones microbianas que supere muchas limitaciones de los enfoques anteriores sería beneficioso.
Aquí, se presenta un protocolo para el cocultivo microbiano de alto rendimiento. Este ensayo es simple y fácilmente incorporado en estudios preexistentes de interacciones microbianas. A diferencia de muchos métodos comúnmente utilizados para el estudio de interacciones microbianas, nuestro método es simple, barato y es susceptible de investigar un gran número de interacciones. Estos ensayos no sólo son fáciles de realizar, sino que los materiales están ampliamente disponibles en la mayoría de los proveedores de laboratorio o recursos públicos (por ejemplo, bibliotecas y espacios de creadores). En consecuencia, este ensayo es ventajoso como primera línea de investigación para identificar y analizar patrones interesantes entre muchas combinaciones de microorganismos en pares, que pueden ser especialmente útiles para la investigación de la ecología microbiana.
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Protocolo
El consentimiento informado se obtuvo de los padres del donante, y el Comité de Asuntos Humanos de la Universidad de Wisconsin-Madison aprobó el estudio (número de aprobación de la Junta de Revisión Institucional [IRB] H-2013-1044).
1. Cultura de muestra
NOTA: Este procedimiento se utiliza aquí para el estudio de interacciones entre los aislados de bacterias de la cavidad nasal humana. En principio, los siguientes métodos son aplicables a cualquier condición de referencia cultural. El caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) se utiliza para la propagación general de bacterias nasales. Todas las placas se solidifican con un agar del 1,5%. Para este estudio, se toman muestras de solución salina en la nariz de un donante (lavado nasal), se transfieren a tubos de microcentrífuga y se congelan a -80 oC.
- Utilice técnicas de cultivo estándar para placar 100 l de cada una de las muestras de lavado descongelación en placas BHI.
- Incubar las placas aeróbicamente a 37oC durante 1 semana.
- Después de la incubación, seleccione 2 colonias de cada morfotipo distinto por placa y pasaje los aislados aeróbicamente en placas BHI saltando una colonia desde la placa inicial en una nueva placa BHI e incubando la placa a 37 oC. Repita hasta que los cultivos bacterianos sean puros.
NOTA: Los aislados bacterianos se pueden identificar a través de la morfología de la colonia, la tinción de gramos, la secuenciación del gen rRNA 16S u otro método. Sin embargo, conocer la identidad del aislado no es necesario para continuar con el protocolo. - Cryopreserve todos los aislados bacterianos a -80 oC después de combinar 1 ml de glicerol al 50% con 1 ml de cultivo bacteriano durante la noche (ver sección 3) en criotubos.
2. Sellos de impresión 3D
NOTA: El policarbonato fue seleccionado como el material de estampado debido a su alta temperatura de transición de vidrio (147 oC) que supera las temperaturas estándar de autoclave (121 oC), lo que minimiza el potencial de deformación después de usos repetidos.
- Cargue la impresora 3D con filamento de policarbonato.
- Aplique pegamento escolar blanco (acetato de polivinilo) en el lecho de impresión para ayudar en la adhesión y minimizar la deformación del sello de inoculación durante la impresión.
- Cargue el archivo . Archivo de modelo STL ( Archivo dedatos suplementario) para el sello de inoculación (Figura 1) en el software de impresora 3D.
- Imprima el sello de inoculación a una temperatura de la boquilla de 290 oC, una temperatura de lecho de 60 oC y una altura de capa de 0,38 mm.
- Envuelva el sello en la lámina de aluminio y esterilizar mediante autoclave durante 1,5 h en un ciclo de gravedad con 15 minutos de secado.
NOTA: Aunque el policarbonato es higroscópico, los sellos sólo conservan aproximadamente un 0,5% de peso de agua después del autoclave.
3. Preparación de cultivos nocturnos
- Utilizando una pipeta serológica, pipeta 3 ml de caldo BHI estéril en tubos de cultivo de 14 ml.
- Usando un bucle de inoculado estéril de 1 L, inocular una colonia bacteriana en el caldo. Gire el lazo para asegurarse de que el grupo se dispersa en el caldo. Vortex los tubos de cultivo brevemente antes de la incubación.
- Incubar los tubos de cultivo a 37 oC durante la noche (16 h) en una coctelera a 250 rpm.
- Vórtice para romper los grupos de células una vez que los cultivos bacterianos alcanzan suficiente turbidez (OD600 s 1).
4. Preparación de placas de bioensayo
NOTA: Las placas de bioensayo se preparan en una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.
- Preparar los medios BHI con 1,5% de agar y esterilizar mediante autoclave de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Después del autoclave, enfríe el soporte BHI a 55 oC en un baño de agua con temperatura controlada.
- Usando una pipeta serológica, pipeta 3 ml de medios BHI fundidos en cada uno de los 12 pocillos en una placa de 12 pocillos. Asegúrese de que los pozos sean lo más exactos e uniformes posibles. Un litro de medios producirá 27 placas de bioensayo.
- Deje que el agar se ponga durante la noche.
5. Inoculando placas de bioensayo con el organismo de prueba
NOTA: Un organismo de ensayo se refiere al organismo para el que se determina la producción de actividad inhibitoria (por ejemplo, la producción de antibióticos) mediante el ensayo de interacción de cocultivo. Para este experimento, los organismos de prueba son Actinobacterias aisladas de muestras de lavados nasales.
- Inocular el organismo de ensayo en una placa de bioensayo insertando un bucle de inoculación estéril de 10 l en el cultivo nocturno y rayando una gota de cultivo sobre el tercio izquierdo de un pozo de placa.
NOTA: Se recomienda sólo rayar un tercio del pozo, ya que el crecimiento excesivo del pozo prohíbe la inoculación posterior de los organismos diana. - Repita hasta que los 12 pocillos de la placa hayan sido inoculados con el organismo de ensayo.
- Incubar las placas boca abajo a la temperatura adecuada durante 7 días. A temperaturas más altas (37 oC) o en climas más secos, guarde las placas en un recipiente húmedo para evitar que las placas se sequen.
6. Preparación de organismos objetivo
NOTA: Un organismo objetivo se refiere al organismo cuyo estado de inhibición se determina mediante el ensayo de interacción de cocultivo. Para este experimento, los organismos objetivo son Staphylococcus spp. aislado de muestras de lavadonasal nasal.
- Después de incubar las placas de bioensayo durante 6 días, prepare cultivos nocturnos de los organismos objetivo especificados, como se ha hecho anteriormente (ver sección 3).
7. Inoculación del organismo objetivo
NOTA: Después de la incubación durante la noche, asegúrese de que los cultivos estén turbiados (OD600 x 1). Algunos cultivos bacterianos pueden flocular en la parte inferior del tubo de cultivo. Vortex los tubos de cultivo para dispersar grumos y evaluar la turbidez del cultivo.
- Prepare la placa de destino llenando cada pocal de una placa vacía de 12 pocillos con 1,8 ml de BHI y 200 ml del cultivo de la noche a la mañana.
- Desenvuelva y coloque un sello de inoculación estéril en la placa de destino. Remolino suavemente las culturas alrededor de los pozos, teniendo cuidado de asegurarse de que las culturas no crucen los pozos vecinos.
- Levante el sello de inoculación y asegúrese de que haya una gota de cultivo objetivo diluido en cada punta de sello.
-
Preparar una placa de control de monocultivo colocando el sello de inoculación en una placa de bioensayo no inoculada y mecer suavemente el sello para que una gota de cultivo inocula cada pocaculo. Una vez que se retira el sello de inoculación, una gota de cultivo debe ser visible en los pozos de la placa de bioensayo.
- Si no se inoculan los pozos con el sello de inoculación debido a niveles desiguales de medios, detecte 3 l de cultivo difial durante la noche en el lado derecho de los pozos utilizando una pipeta.
- Inocular las placas de bioensayo como se hizo anteriormente (ver paso 7.4.1), pero alinee el sello para que las puntas se alineen con el lado derecho de la placa de 12 pocillos. Asegúrese de que el sello no entre en contacto con la colonia bacteriana existente al inocular los pozos.
- Retire cuidadosamente el sello y vuelva a colocarlo en la placa de destino.
- Repita la inoculación para cada placa de bioensayo hasta que se inoculen todas las placas.
- Incubar placas de bioensayo al revés a la temperatura adecuada durante 7 días.
8. Puntuación
-
Después de co-cultivar los organismos de prueba y objetivo durante 1 semana, puntuar las interacciones basadas en la siguiente evaluación visual:
- Puntuar los pozos con el crecimiento del organismo objetivo que exhibe un crecimiento que es indistinguible del control de monocultivo como "0" (sin inhibición) (Figura 2A,B).
- Puntuar los pozos con el organismo objetivo que exhibe un crecimiento disminuido en comparación con el control como "1" (inhibición débil) (Figura 2C).
- Puntuar los pozos donde el organismo objetivo no creció como "2" (inhibición fuerte)(Figura 2D).
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Resultados
Los ensayos de interacción de cocultivo se pueden utilizar para comprender las interacciones microbianas, identificar patrones de interés y descubrir aislados microbianos con actividades intrigantes. En estos ensayos, un organismo de prueba es monocultivo en un lado de una placa de agar de 12 pocillos e incubado durante 7 días. Posteriormente, un organismo objetivo se detecta junto al organismo de ensayo y los dos microbios fueron co-cultivados durante 7 días antes de puntuar para el feno...
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Discusión
Los antibióticos y otros metabolitos secundarios que median las interacciones microbianas son útiles para una multitud de aplicaciones, incluido el descubrimiento de fármacos. En este documento, se presenta un protocolo de ensayos de cocultura para evaluar un gran número de interacciones microbianas. Estos ensayos de interacción de cocultivo son un medio simple, asequible, escalable y de alto rendimiento para investigar muchas combinaciones en pares de microorganismos en tándem. Los organismos objetivo se detectan junto ...
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a Daniel May, Marc Chevrette y Don Hoang por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo, incluyendo los esfuerzos de Cameron R. Currie, fue apoyado por la Universidad de Wisconsin-Madison, Oficina del Vicerrectorado de Investigación y Educación de Posgrado con fondos de la Wisconsin Alumni Research Foundation, fondos también proporcionados por la Institutos Nacionales de Centros de Salud para la Excelencia en Investigación Traslacional (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck fue apoyado por una beca de capacitación de la Biblioteca Nacional de Medicina para el Programa de Capacitación en Computación e Informática en Biología y Medicina (NLM 5T15LM007359). Los funderos no tuvieron ningún papel en el diseño, la recopilación de datos y la interpretación del estudio, ni en la decisión de presentar la obra para su publicación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 y mu; L asas inoculadoras desechables de poliestireno, azul | VWR | 12000-806 | |
| 10 μ L asas de inoculación de poliestireno desechables, amarillas | VWR | 12000-810 | |
| Placa de cultivo celular de 12 pocillos, estéril con tapa | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL tubo de poliestireno de fondo redondo, 17 x 100 mm 2style, no pirogénico, estéril | Falcon | 352057 | |
| 2.0 tubos autoportantes con tapones, estériles | USA scientific | 1420-9710 | |
| Pipeta serológica de 25 mL | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriológico | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Filamento de policarbonato, blanco, 3 mm de diámetro | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| Pegamento escolar | Elmer's | EPIE304 | |
| Impresora 3D Taz 6 | Lulzbot |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
