Fotometría multifibra para registrar la actividad neuronal en animales en movimiento libre

Resumen

Este protocolo detalla cómo implementar y realizar grabaciones de fotometría multifibra, cómo corregir artefactos independientes del calcio y consideraciones importantes para la toma de imágenes de fotometría de doble color.

Resumen

Registrar la actividad de un grupo de neuronas en un animal que se mueve libremente es una tarea difícil. Además, a medida que el cerebro se disecciona en subgrupos funcionales más pequeños y más pequeños, se vuelve primordial registrar a partir de proyecciones y/o subpoblaciones genéticamente definidas de las neuronas. La fotometría de fibra es un enfoque accesible y potente que puede superar estos desafíos. Mediante la combinación de metodologías ópticas y genéticas, la actividad neuronal se puede medir en estructuras cerebrales profundas mediante la expresión de indicadores de calcio codificados genéticamente, que traducen la actividad neuronal en una señal óptica que se puede medir fácilmente. El protocolo actual detalla los componentes de un sistema de fotometría multifibra, cómo acceder a estructuras cerebrales profundas para entregar y recoger luz, un método para tener en cuenta los artefactos de movimiento y cómo procesar y analizar señales fluorescentes. El protocolo detalla consideraciones experimentales al realizar imágenes de color simple y doble, ya sea de fibras ópticas de implante simple o múltiple.

Introducción

La capacidad de correlacionar las respuestas neuronales con aspectos específicos del comportamiento de un animal es fundamental para entender el papel que desempeña un grupo particular de neuronas en la dirección o respuesta a una acción o estímulo. Dada la complejidad del comportamiento animal, con la infinidad de estados internos y estímulos externos que pueden afectar incluso a las acciones más simples, el registro de una señal con resolución de un solo ensayo dota a los investigadores de las herramientas necesarias para superarlas Limitaciones.

La fotometría de fibra se ha convertido en la técnica de elección para muchos investigadores ....

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, San Diego, y la Guía Canadiense para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Universidad Laval Animal Protection Comité.

1. Alineación de la trayectoria óptica entre la cámara CMOS (semiconductor de óxido metálico complementario) y el cable de conexión individual o ramificado

1. Afloje todos los tornillos del traductor de 5 ejes (11, Figura 2B).
2. Tornillo en el cable de conexión (12, Figur....

Resultados

Los correlatos neuronales de las respuestas conductuales pueden variar dependiendo de una variedad de factores. En este ejemplo, utilizamos fotometría de fibra in vivo para medir la actividad de los terminales de axón desde el área hipotalámica lateral (LHA) que terminan en la habenula lateral (LHb). Los ratones de tipo salvaje fueron inyectados con un virus asociado a adeno (AAV) que codificaba GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) en la LHA y se implantó una fibra óptica con la punta inmediatamente por encima del LHb

Discusión

La fotometría de fibra es un enfoque accesible que permite a los investigadores registrar la dinámica de calcio a granel de poblaciones neuronales definidas en animales que se mueven libremente. Este método se puede combinar con una amplia gama de pruebas de comportamiento, incluyendo tareas "pesadas de movimiento" tales como pruebas de natación forzada², miedo-acondicionamiento¹⁸, interacciones sociales^1,4, y otros.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tornillo de cabeza de acero inoxidable de 1/4"-20,	Thorlabs de	SH25S100
Tornillo de cabeza de acero inoxidable de 1/4"-20,	Thorlabs de	SH25S050
Tornillo de cabeza de acero inoxidable de 1/4"-20,	Thorlabs	SH25S038
1000 µ m, 0,50 NA, SMA-SMA Cable de conexión de fibra	Thorlabs	M59L01
Poste óptico de 12,7 mm	Thorlabs	TR30/M
12,7 mm Soporte de poste de pedestal	Thorlabs	PH20EM
15 V, 2,4 A Unidad de fuente de alimentación con conector Jack de 3,5 mm para T-Cube	Thorlabs	KPS101
Objetivo 20x	Thorlabs	RMS20X	#10 en la Figura 2, #11 en la Figura 5
Cubo de jaula de 30 mm con montura de filtro dicroico	Thorlabs	CM1-DCH/M	#8-9 en la Figura 2, #8-10 en la Figura 5
Lentes dóricas	LED de 405 nm	CLED_405	#2 en la Figura 2
Filtro de paso de banda de 410 nm	Thorlabs	FB410-10	#5 en la Figura 2; #7 en la Figura 5
465 nm. Lentes	dóricas	CLED_465	#1 en la Figura 2
Filtro de paso de banda de 470 nm	Thorlabs	FB470-10	#4 en la Figura 2; #6 en la Figura 5
Filtro de paso de banda de 560 nm	Semrock	FF01-560/14-25	#5 en la Figura 5
Lentes Doric	LED de 560 nm	CLED_560	#1 en la Figura 3
Montura cinemática de 5	ejes Thorlabs	K5X1	#11 en la Figura 2, #12 en la Figura 5
Doblete acromático	Thorlabs	AC254-035-A-ML	#7 en la Figura 2
Adaptador para el colimador 405	Thorlabs	AD11F	#3 en la Figura 2; #4 en la Figura 5
Adaptador para el colimador ajustable	Thorlabs	AD127-F	#3 en la Figura 2; #4 en la Figura 5
Placa de pruebas de aluminio	Thorlabs	MB1824
Horquilla de apriete	Thorlabs	CF125
Conector cúbico	Thorlabs	CM1-CC
Dual 493/574 dicroico	Semrock	FF493/574-Di01-25x36	#10 en la Figura 5
Filtro de emisión para GCaMP6	Semrock	FF01-535/22-25	#6 en la Figura 2
Carcasa con paneles de madera prensada negra	Thorlabs	XE25C9
Tapa de extremo roscada externamente SM1 para el mecanizado	de Thorlabs
Portafiltros de tubo de lente SM1 de cambio rápido	Thorlabs	SM1QP	#4-6 en la Figura 2, #5-7 en la Figura 5
Colimador fijo para luz de 405 nm	Thorlabs	F671SMA-405	#3 en la Figura 2; #4 en la Figura 5
Colimador fijo para luz de 470 y 560 nm	Thorlabs	F240SMA-532	#3 en la Figura 2; #4 en la Figura 5
Filtro de emisión verde	Semrock	FF01-520/ Divisor de haz de luz de 35-25	pulgadas
Cámara CMOS USB 3.0 de alta resolución	Thorlabs	DCC3260M	#13 en la Figura 2, #15 en la Figura 5
Divisor de haz de luz	Neurofotometría SPLIT		#14 en la Figura 5
Espejo dicroico de paso largo,	Thorlabs	DMLP425R	#8 en la Figura 2, #9 en la Figura 5
Espejo dicroico de paso largo, Semrock		de corte de 495 nmFF495-Di03	#9 en la Figura 2, #8 en la Figura 5
Cemento dental Metabond	C& Cable B
M8 - M8	Lentes dóricas	Cable_M8-M8
Cánulas de fibra óptica	Lentes		Es necesario especificar que se utilizarán para experimentos de fotometría que requieran baja autofluorescencia
Fibra óptica Latiguillos Lentes		dóricas	Es necesario especificar que se utilizarán para experimentos de fotometría que requieran baja autofluorescencia Filtro
emisión roja	Semrock	FF01-600/37-25	Divisor de haz de luz
T7 LabJack	LabJack
T-cube Controlador LED	Thorlabs	LEDD1B
Cable de E/S USB 3.0, Hirose 25, para DCC3240	Thorlabs	CAB-DCU-T3

1" de largo 1/2" de largo de 3/8" de largo LED SM1CP2M de corte de 425 nm dóricas de