Summary
Denne protokol er designet til billeddannelse og analyse af dynamikken i celleorientering og vævsvækst i Drosophila abdominal epithelia som frugtfluen gennemgår metamorfose. Den metode, der er beskrevet her, kan anvendes til undersøgelse af forskellige udviklingsstadier, væv og subcellulære strukturer i Drosophila eller andre modelorganismer.
Abstract
Inden for flercellede organismer udviser modne væv og organer høje grader i rækkefølge i de rumlige ordninger af deres bestanddele. Et bemærkelsesværdigt eksempel er givet ved sensorisk epithelia, hvor celler af samme eller forskellige identiteter samles via celle-celle vedhæftning viser velorganiseret planær mønstre. Celler justerer til hinanden i samme retning og viser tilsvarende polaritet over store afstande. Denne organisation af den modne epithelia er etableret i løbet af morfogenese. For at forstå, hvordan den planar arrangement af den modne epithelia opnås, er det afgørende at spore celle orientering og vækst dynamik med høj spatiotemporal troskab under udvikling in vivo. Robuste analytiske værktøjer er også afgørende for at identificere og karakterisere lokale til globale overgange. Den Drosophila puppe er et ideelt system til at evaluere orienteret celle form ændringer underliggende epitel morfogenese. Den pupal udvikle epitel udgør den ydre overflade af immobile kroppen, så langsigtet billeddannelse af intakte dyr. Protokollen beskrevet her er designet til at billedet og analysere celle adfærd på både globalt og lokalt plan i pupal abdominal epidermis som det vokser. Den beskrevne metode kan let tilpasses til billeddannelse af celle adfærd på andre udviklingsstadier, væv, subcellulære strukturer, eller model organismer.
Introduction
For at opnå deres roller, epitelvæv fuldt ud stole på den rumlige organisering af deres cellulære komponenter. I de fleste epithelia, celler er ikke kun pakket mod hinanden for at skabe en præcis brosten lag, men de orientere sig i forhold til kroppen akser.
Den funktionelle betydning af præcise væv organisation er indlysende i sensorisk epithelia, såsom hvirveldyr indre øre og nethinden. I det første tilfælde justeres hår og støtteceller i en bestemt aksial retning for effektivt at fornemme mekaniske indgange som lyd og bevægelse1,2. Tilsvarende fotoreceptor celle rumlige organisation er afgørende for at opnå optimale optiske egenskaber ved nethinden3. Rumlig kontrol af celleposition og -orientering er således af særlig relevans for korrekt fysiologisk funktion.
Drosophila er en holometabolous insekt, der gennemgår en fuldstændig transformation af sine larve kropsstrukturer gennem metamorfose, hvilket giver anledning til sin voksne væv. Den Drosophila puppe er en glimrende model for noninvasive levende billeddannelse af en række dynamiske begivenheder, herunder udviklingsmæssige celle migration4,celledeling og vækstdynamik5, muskelsammentrækning6,celledød7,sår reparation8, og celle orientering9. I den voksne Drosophila, den eksterne epitel viser en høj grad af orden. Dette er let observeret på arrangementer af trichomes (dvs. celle fremspring stammer fra enkelt epitelceller) og sensoriske børster over hele fluens krop overflade10. Faktisk er trichomes justeret i parallelle rækker vejledende luftstrøm11. Morfogenesen af den voksne epithelia og den bestilte placering af de enkelte celler starter under embryogenese og kulminerer under pupal stadier. Mens celledelinger, interkaleringer og form ændrer alle fald i vævsretningen12,13,tilbageføres dette på senere udviklingsstadier, især på hvalpestadier , når fluen nærmer sig modenhed9.
Den immobile Drosophila puppe giver et ideelt system til at evaluere celle form og orientering ændringer. Den pupal abdominal epidermis præsenterer særlige fordele. Mens prækursorer af den voksne hoved, brystkasse, kønsorganer, og vedhæng vokse og få mønstret fra larve stadier, histoblaster, som er integreret i larve epidermis, begynde at vokse og differentiere kun ved pupariation14. Denne funktion gør det muligt at spore alle spatiotemporale hændelser, der er involveret i etableringen af vævsorden i sin helhed9.
Histoblaster er specificeret under embryonal udvikling på kontralaterale positioner i hver formodede abdominal segment. Den dorsale abdominale epidermis af den voksne stammer fra dorsolaterally placeret histoblast reder til stede på den forreste og bageste rum15,16. Som histoblaster udvide, udskiftning af larve epitelceller (LECs), de kontralaterale reder sikring på dorsale midterlinjen danner et sammenløb ark17,18,19,20.
Dette arbejde beskriver 1) en metode til dissektion, montering, og langsigtet levende billeddannelse af Drosophila puppe, og 2) analytiske metoder til at studere dynamikken i cellulære orientering og vækst ved høj spatiotemporal opløsning. Der findes her en detaljeret protokol, der dækker alle de trin, der kræves fra det første pupa-præparat (dvs. iscenesættelse og billeddannelse) til udvinding og kvantificering af retningsbestemthed og orienteringsfunktioner. Vi beskriver også, hvordan man udleder lokale vævsegenskaber fra analysen af cellekloner. Alle de beskrevne trin er minimalt invasive og tillader langsigtede liveanalyser. De metoder, der er beskrevet her, kan let tilpasses og anvendes på andre udviklingsstadier, væv eller modelorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol er opdelt i fem trin: (1) iscenesættelse af pupper, (2) forberedelse af puppe til billeddannelse, (3) levende billeddannelse af den voksende abdominale epithelia, (4) generation af genetiske mosaikker, (5) databehandling og analyse (herunder sektioner, der beskriver, hvordan man analyserer celle orientering dynamik fra celle krydset skitserer og vækstdynamikker fra celle kloner).
1. Iscenesættelse af Drosophila pupper før billeddannelse
- Kulturfluer af den relevante genotype på standardmedium i plasthætteglas ved 25 °C i 5 dage (±12 timer) efter æglægning (AEL).
BEMÆRK: Metamorfose starter inden for indeslutning af den tredje-instar larver i pupal tilfælde ved 120 h AEL indtil 0 h efter puparium dannelse (APF). Denne overgang er let identificerbar, fordi larver holder op med at fodre og bevæge sig, og operkulære område dannes (Figur 1A) ved 0-12 h APF. Pupriet er oprindeligt blødt og hvidt, men hærder og tans gradvist. - Overfør hvid prepupae (0 h APF) til en frisk plast hætteglas ved hjælp af en fugtig pensel. Dyr kan holdes ved forskellige temperaturer afhængigt af det designede forsøg indtil den ønskede alder.
BEMÆRK: Pupa dannelse (dvs. pupation) forekommer ved 12 h APF, når hovedet og vedhæng af den voksne flue er helt everted (Figur 1A). På dette tidspunkt er hvalpesagen helt adskilt fra puppe, så det er fuldstændig fjernet (figur 1A).
2. Forberedelse af pupper til levende billeddannelse
BEMÆRK: Efter iscenesættelsen dissekeres pupperne og monteres som beskrevet nedenfor (se også figur 1).
- Fjern iscenesat pupper fra væggen af hætteglasset ved hjælp af pincet.
- Lim ventrale side af hver puppe på et glas dias dækket med dobbeltsidet tape. Tryk forsigtigt på hovedspikrerne (dvs. opercular region) og dorsale overflade af puppe med spidsen af pincet for at sikre vedhæftning af pupal sagen til båndet (Figur 1A,B).
BEMÆRK: Dorsale overflade bør ansigt op for at lette dissektion af sagen og inddrivelse af puppe. - Dissektion under et stereomikroskop ved forsigtigt at fjerne operculum fra pupriet med pincet (Figur 1C).
- Sæt en spids af pincet i en lavvandet vinkel mellem hvalpekassen og puppeoverfladen gennem den operulære åbning. Riv sagen fra hoved til hale sideværts i en eller flere gynger, så du undgår at klemme puppe (Figur 1D). Fold tilbage krakket pupal sag til de laterale sider, som du holder fortsætter til den bageste ende (Figur 1E).
BEMÆRK: Den pupal tilfældet er ganske stiv og revner let. I tilfælde af høj luftfugtighed eller især genotypiske baggrunde bliver hvalpesagen blødere, og det er vanskeligere at rive. I disse tilfælde kan revner i pupal sagen hjælpes ved at stikke sine frie kanter med begge spidsen af pincet. - Puppet ud af det åbnede pupal-etui ved forsigtigt at indsætte tangen under dyret og forsigtigt trække op (Figur 1F). Hvalpene klæber til spidsen af tangen (Figur 1G−H).
- Overfør puppe ved hjælp af pincet til en glasbundet skål og deponere det på toppen af en lille dråbe gas-gennemtrængelig halocarbon olie (Figur 1I). Hold puppe forsigtigt ved ventralsiden for at undgå eventuelle vævsskader.
BEMÆRK: Dråben halocarbonolie skal være lille med en diameter på ca. under halvdelen af puppelængden. En sådan mængde er tilstrækkelig til at holde puppe til glasset ved kapillaritet og til at korrigere optik for olie nedsænkning mål. - Rul et stykke vådt silkepapir i skålens kanter for at opretholde luftfugtigheden. Dæk skålen for at undgå dehydrering af pupperne under billeddannelse.
BEMÆRK: Både kvindelige og mandlige pupper kan anvendes til billeddannelse. Vi anbefaler at anvende den tredje abdominal segmenter (AIII) som en reference abdominal metamere, da det er næsten identisk i begge køn med hensyn til størrelse, form og mønstre.
3. Live billeddannelse af voksende abdominal epithelia
BEMÆRK: En omvendt laser scanning konfokale mikroskop udstyret med en 40x/1.3 NA olie nedsænkning mål blev brugt til at billedet pupper på forskellige udviklingsstadier.
- Orienter puppe over oliedråben på glasbundsskålen i henhold til domænet og den proces, der skal evalueres (f.eks. dorsolaterally for langsigtet levende billeddannelse af den tidlige udvidelse af dorsale reder, eller dorsally at billedet deres sene ekspansion og væv remodeling). Se figur 1J,K og figur 4.
- Overfør den glasbundsskål, der indeholder den monterede puppe, til mikroskopstadiet, og fokuser på overfladen af maveregionen ved hjælp af det overførte lys.
BEMÆRK: Selvom denne protokol er optimeret til billedbehandling på omvendte mikroskoper, er det også muligt at udføre billeddannelse på et opretstående mikroskop. I så fald anbringes prøven på mikroskopet med glasbundens overflade opad. Halocarbon olie holder hver pupper på en menisk. - Indstil erhvervelse parametre: 1) antallet af Z-skiver er normalt mellem 20−40 for at tillade passende to-dimensionelle (2D) rekonstruktion af abdominal epidermis; 2) trinstørrelse mellem hver skive (f.eks. 1 mikron); 3) tidsinterval til optagelse (en 5 min interval er egnet til high fidelity analyser af celle orientering dynamik); og 4) rammeopløsning (f.eks. 1024 x 1024).
- Tænd for de relevante lasere (dvs. 488 nm og 561 nm for at visualisere henholdsvis GFP og RFP fluorophores), og juster lasereffekt- og forstærknings-/forskydningsindstillingerne for at visualisere de markerede celler. Brug den lavest mulige lasereffekt (i området 5%−20%) for at minimere fotobleaching og fototoksicitet.
- Manuelt indstille position og de relevante Z-stack grænser for flere pupper ved hjælp af vedlagte motoriserede fase og mikroskopet multiposition erhvervelse software.
4. Generation af genetiske mosaikker til at følge adfærd celle kloner
BEMÆRK: Vi anvender mitotisk rekombination til at fremkalde genetiske mosaikker i abdominale epitel via stedspecifik rekombination (FLP/FRT system21,22) ( Figur2).
- Cross jomfru hunner bærer en varme chok-inducerende Flippase transgene (hs-FLP), en FLP anerkendelse mål (FRT) site på et bestemt genomisk sted (f.eks FRT-plads ved position 40A ved kromosomets L-arm og en genkendelig cellemarkør (f.eks. Ubi-RFP.nls eller Ubi-GFP.nls) distalt for FRT-stedet, til mutante hanner, der bærer et FRT-sted på det tilsvarende genomiske sted (figur 2A−C).
BEMÆRK: Autonome og ikke-ikke-autonome virkninger inden for eller uden for kloner for ethvert gentab af funktion kan undersøges ved hjælp af specifikke recessive alleler, der er distalt for FRT-anlægget. - Generer FLP/FRT somatiske kloner i histoblasterne ved varmechokbehandling på det tredje instar larvestadium af afkom af korset. Dette udføres ved at nedsænke plasthætteglas, der indeholder dyrene i et vandbad ved 37 °C i 45 min til 1 time på det omvandrende larver (LIII) fase.
BEMÆRK: Den følsomme periode for mitotisk rekombination er G2-fasen i cellecyklussen. Histoblasts er arresteret i G2 under hele larve udvikling. - Score to kloner for fravær (dvs. mutantceller) eller forbedrede (dvs. vilde type twin-spot celler) niveauer af fluorescerende protein markør fra 16 h APF og fremefter (Figur 2D).
BEMÆRK: I gennemsnit gør 45 min til 1 time ved 37 °C kun 2−3 tvillingekloner pr. interesseområde (f.eks. det abdominale hæmosegment). Pupper, der udviser for høj klontæthed (f.eks. mere end fire tvillingekloner pr. hæmsegment), bør kasseres fra yderligere kvantitative analyser. - Ved klon identifikation, billede levende puppe på det ønskede stadium og for den ønskede længde af tid som beskrevet i det foregående afsnit.
5. Databehandling og analyser
BEMÆRK: Data behandles ved hjælp af ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
- Skelne celleretningsdynamik fra cellekrydsningskonturer.
- Projisk Z-stak skiver erhvervet af konfokal mikroskopi i 2D ved hjælp af maksimal intensitet Projektion (MIP) funktion ImageJ.
BEMÆRK: Antallet af skiver pr. stak bør holdes på et minimum for at undgå støj, der genereres af makrofager, der patruljeres under epidermis. - Indstil et plankoordinatsystem, der identificerer pålidelige vævsmærker (f.eks. A/P-rumgrænser) til analyse af hvert datasæt (figur 3A).
BEMÆRK: Ved anvendelse af de samme planære referencer for hvert datasæt kan der sammenlignes flere målinger. - Brug OrientationJ-plugin'et (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) i ImageJ23,24 på lokale cellekanter til at opnå kvalitative og kvantitative orienteringsværdier. Plugin'et gengiver farvekodede overlejringer på inputbilleder baseret på lokale retninger og angiver numeriske værdier, når de bruges i kvantitativ tilstand (Figur 3B−B'' og Figur C−C'''').
BEMÆRK: OrientationJ plugin er baseret på struktur tensors, 2 x 2 matrix af eigenvalues afledt af gradient og retningsbestemte derivater (Se referencer23,24 for en detaljeret beskrivelse). - Brug indstillingen OrientationJ-fordeling til at farvekode cellekantretninger i forhold til det indstillede plankoordinatsystem (dvs. tilknytning til cellekantretning) (Figur 3B). Indstillingen Fordeling findes under plugin-menuen i ImageJ. De indstillinger, der skal anvendes, er: Gaussisk vindue sigma = 1 pixel; Kubisk spline = forløb; Minimum samtidighed = 20%; Minimum energi = 1%. Cellekantretninger vises som et farvekodet billede, der anvender indstillingen Farveundersøgelse i plugin 'et (Nuance = orientering; Mætning = sammenhæng; og lysstyrke = inputbillede).
BEMÆRK: Områder, der indeholder baggrundsfluorid, giver ingen retningsbestemt information og skal manuelt udelukkes fra analysen. Indstillinger for høje grænser reducerer de pixel, der tages i betragtning i de behandlede billeder. - Brug indstillingen RetningS-målpunkt til at kvantificere cellulære retninger og retningsbestemt cellecellejustering (dvs. sammenhæng) (Figur 3C). Indstillingen Mål findes under plugin-menuen i ImageJ. Generer små tilstødende ikke-overlappende interesseområder (ROI'er) med en ensartet vægt (64 x 64 pixel, ca. 20 μm x 20 μm) i det område, der er besat af histoblasterne (figur 3C).
- Beregn den dominerende lokale retning (dvs. den gennemsnitlige orientering mellem tilstødende cellers gennemsnitscellekantretningskort) og koherens fra retningslinjerne for retningslinjerne for kooperativer. Softwaren beregner den fremherskende orientering og lokale sammenhæng inden for hvert investeringsafkast (Figur 3C).
BEMÆRK: De største og mindste eigenvalues af strukturen tensor anslået af OrientationJ er ansat til at beregne sammenhængsbekæmpelse som forholdet mellem deres forskel og deres sum. Sammenhængsgrænse afgrænses mellem værdierne 0-1. En værdi på 1 angiver fuld justeringsensartethed, mens en værdi på 0 angiver isotropiske områder uden justering. - Statistisk analysere den beregnede orientering og sammenhæng værdier fra flere billeder ved hjælp af gratis software pakker såsom PAST25. Aksiale data som orienteringsværdier (i grader) beskrives korrekt af retningsbestemte statistikker.
- Gennem softwaren beregnes middelretningen og den cirkulære varians for hvert sæt orienteringsfordelinger. Den statistiske signifikans mellem fordelingen af retningerne mellem forskellige genotyper eller betingelser bestemmes ved hjælp af den ikke-parameter Mardia-Watson-Wheeler test (W-test) for lige fordelinger.
- Den statistiske signifikans af forskellen i sammenhæng, der anvendes i den ikke-parametriske Kolmogorov-Smirnov-test (K-S-test). Vis data grafisk efter ønske (polære plots, søjlediagrammer, boksplots osv.).
- Projisk Z-stak skiver erhvervet af konfokal mikroskopi i 2D ved hjælp af maksimal intensitet Projektion (MIP) funktion ImageJ.
- Vækstdynamik fra cellekloner
BEMÆRK: Følgende trin gør det muligt at hente geometriske og formparametre for celler fra 2D MIP-billeder, der indeholder den eller de af interesse fordærv, der indeholder den eller de klon(er), der er af interesse. Til sammenligninger mellem flere kloner skal billeder anskaffes med de samme indstillinger.- Segmentere klonområder ved at tegne deres konturer med værktøjet Billedj-frihåndsmarkering.
- Beregn geometriske parametre og formparametre ved hjælp af værktøjet Angiv målinger under ImageJ under menuen Analysér. Aktivér indstillingerne Område, Omkreds, Tilpas ellipseog Figurbeskrivelse.
BEMÆRK: Dette vil gøre det muligt at hente forskellige geometriske parametre, herunder området (summen af pixels inden for klonen), omkredsen (summen af pixlen af klonkanten), højde-bredde-forholdet (AR, forholdet mellem de overordnede og mindre akser af den bedst egnede Legendre ellipse indskrevet i klonkanten) og retningsvinklen (dvs. vinklen på klonens hovedakse i forhold til grænsen for anteroposterior). - Hvis du beregner ikke-dimensionelle nøgletal ud fra disse målinger, hentes formparametre. Disse omfatter rundhed (4 x [areal]/π x [hovedakse]2),ruhed (soliditet - område/konvekst område) og cirkularitet (4π x [areal]/[perimeter]2).
BEMÆRK: Hver af formparametrene repræsenterer klonernes afvigelsesgrad fra ideelle former som f.eks. Værdier svarende til 1 angiver maksimal symmetri (dvs. minimal kompleksitet). - Analyser geometriske parametre og formparametre statistisk mellem forskellige genotyper eller betingelser ved hjælp af Microsoft Excel og/eller PAST. Statistisk signifikans af forskellen bestemmes ved hjælp af en paraferet to-tailed Student's t-test for lige middelværdi eller den ikke-parametriske Kolmogorov-Smirnov K-S-test for lige fordelinger mellem betingelser. Data kan vises grafisk som ønsket (f.eks. liggende søjlediagrammer, kasseplots osv.). Se figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne protokol omfatter forberedelse af Drosophila puppe til langsigtet levende billeddannelse og procedurerne for analyse af celleorientering og vækstdynamik af abdominal epidermis. Ved at anvende denne metode er det muligt at generere høj opløsning film af den udviklende puppe i perioder på op til 48 timer uden væsentlig fotobleaching eller fototoksicitet. Øjebliksbilleder af abdominal epidermis (f.eks. histoblaster og LECs) på forskellige tidspunkter og fra pupper orienteret i forskellige vinkler er vist i figur 4. Den efterfølgende analyse af disse film giver mulighed for identifikation og kvantificering af dynamikken i lokale og globale ændringer i de vigtigste geometriske og form parametre moduleret under udvidelsen af histoblasts og udskiftning af LECs. Disse analyser kan udføres i forskellige scenarier og specifikke mutantbaggrunde. De kan også anvendes til kloner, hvor genekspression ændres, hvilket fører til autonomt tab eller gevinst af funktionsforhold. Dette vil gøre det muligt at udforske ikke-autonome reaktioner i de omkringliggende celler, hvilket vil gøre det lettere at identificere krydstale- eller cellekommunikationsmekanismer (figur 5). Denne fremgangsmåde er for nylig blevet anvendt til identifikation af fat/dachsous/four jointed pathway som et centralt element, der leder og orienterer cellernes tilpasning under indsættelsen af det planære polære mønster i den voksne9.-sabdominale epidermis .
Figur 1: Dissekering og montering af pupper til levende billeddannelse. (A) Fra venstre mod højre: dorsal visning af en prepupa på 0 h APF (venstre) og af en puppe på 14 h APF før (i midten) og efter (højre) fjernelse af den uigennemsigtige pupal sag. Det opternede område er angivet (hvide pilespidser). (B) Den væsentlige værktøjskasse til dissektion er vist. Fra venstre mod højre: glas slide, dobbeltsidet tape, et par pincet, og en glas-bund parabol. (C) Iscenesat pupae er immobiliseret på dobbeltklæbende tape på glas dias dorsal side op. Det pupale tilfælde af hver puppe åbnes fra opercular regionen med kirurgiske pincet. (D−E) Peeling af pupal sagen er gradvis. Sagen er revet og foldet til pupal sider fra hovedet til maven. (F−H) Puppe løftes forsigtigt fra ventralsiden med spidsen af tangen (G) og overføres til en glasbundsskål over en minimal dråbe halocarbonolie. (I) Hvalpene er derefter passende orienteret (dorsolaterally, top; dorsally, bund). Flere pupper kan monteres samtidigt ved at gentage de trin, der er vist i panel C−I. (J) Billede, der viser omridset af cellerne i dorsale histoblast reden af AIII segmentet udtrykker junctional markør Atpα::GFP. Den pupa var orienteret dorsolaterally og afbildet på 14 h APF. Vægtstang = 22 μm. (K) Billede svarende til (J), men fra et dorsalt synspunkt. Dynamikken i vævsudvikling kan visualiseres i flere timer. Se også figur 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Generering af genetiske mosaikker via FLP/FRT-system. (A) En forældresterozygotcelle (bleg magenta) bærer en recessiv mutant allel (stiplede rektangel) på den ene kromosomarm og en genkodning for en fluorescerende markør (magenta) i den anden kromosomarm [kromosomarmens venstre arm 2 (2L) i dette eksempel]. FRT steder (orange rektangler) er konstrueret i begge arme på samme kromosomale positioner proksimalt til centromere (grå ovaler). (B) Aktivering af FLP recombinase ved varmechok i celler, der er sat på pause i G2, fører til rekombination mellem FRT'erne for søsterkromatiderne 1-1' og 2-2«. Som følge heraf udveksles regionen, der er distalt for FRT-lokaliteterne (FRT40A på 2L). Der vises en forstørret visning i højre panel. (C) Ved polare adskillelse af de omarrangerede regioner (1-1' og 2-2') under mitose dannes der to genetisk forskellige søsterceller. En datter er homozygot for recessiv allel og for hele kromosom arm distal til stedet for rekombination. Denne celle mangler det gen, der koder for fluorescerende markør, negativt markeret med hvid. Den anden datter celle vil være homozygot for den vilde type arm, hvilket giver anledning til en twin-spot og udtrykke to kopier af gener kodning for fluorescerende markør (mørk magenta). For nemheds skyld vises adskillelser af omarrangerede områder til modsatte poler i den mitotiske celle (dvs. 1−2 og 1'−2') ikke. Disse giver anledning til celler fænotypisk skelnes fra forældrenes celle (heterozygot baggrund, bleg magenta). (D) Billede, der viser kloner i A-rummet genereret via FLP/FRT somatiske rekombination på den tredje instar larver fase og visualiseret ved 26 h APF. Kloner af celler er præget af fraværet af RFP.nls (sort) og homozygot udtryk for RFP.nls (lyse magenta, twin spots) i en ellers heterozygot RFP.nls baggrund (dim magenta). Tilsvarende hændelser kan opnås for FRT-steder, der er placeret på andre kromosomale steder (2R, 3L, 3R og X). Se også figur 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Illustration af celleorienteringsmålinger. Hvis du vil udtrække oplysninger om celleretninger, indstilles først et plankoordinatsystem, der skal relatere celleorientering med vævsaksen (A). For det andet udtrækkes celleretninger fra cellekonturer (B). Til sidst kvantificeres celleretninger og justeringer til vævsaksen (C). (A) Til venstre, et diagram over en lateral visning af en puppe orienteret i henhold til planarkkoordinatsystemet. Det røde faste og det cyanfarvede stiplede linjer definerer det kartesiske plan, der repræsenterer henholdsvis anteroposteriorgrænsen (A/P). I midten, en omvendt billede, der viser en dorsolateral visning af den ekspanderende histoblasts på 26 h APF skitseret af junctional markør Atpα::GFP (input billede). A/P-grænsens placering fremhæves med en rød linje. Til højre vises et aksialt kompas, der viser den farvekode, der anvendes til at beskrive cellekantretninger (polygoner) eller gennemsnitscelleretninger (søjler). (B) Visning af plugins /OrienteringJ menuen og OrienteringJ Distribution vinduet. ( B.) Visning af vinduet OrientationJ-fordeling, der viser indstillingerne for de parametre, der er anvendt til at hente cellekantretningskortet til højre. (B'') Illustration af de farvekodede cellekonturer på idealiserede celler. En cirkel viser ikke nogen foretrukken farve. (C) Visning af vinduet RetningS-målpunkt. c. Sekventielle skærmbilleder af vinduet OrientationJ-mål, der viser, hvordan du måler lokal orientering og sammenhæng i på hinanden følgende ROI'er med ensartet vægt. Den lokale orienteringsvinkel og sammenhæng for hvert område vises som ellipsoider. c'') Repræsentation af de endelige resultater af orienteringsmålingen. Ellipsoider viser visuelt retningen (dvs. vinkel på ellipseoid længste akse med hensyn til A / P grænse) og sammenhæng (dvs. forholdet mellem den længste og den kortere akse af ellipsoid). De numeriske værdier for begge parametre gemmes i et regneark til yderligere analyser. c''') Illustration af de farvekodede cellekonturer og gennemsnitscelleretning (søjler) på idealiserede celler. En cirkel viser ikke nogen foretrukken retning. c'''') Repræsentation af den foretrukne lokale orientering af hvert investeringsafkast (lokalt beregnet orienteringskort). Farverne fremhæver retningen af hvert område. Forreste er til venstre. Vægtstang = 22 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Langsigtet levende billeddannelse af voksende abdominal epithelia. (A) Repræsentative snapshots fra langsigtede billeddiagnostiske film fra tidlige til sene faser af histoblast ekspansion. Top: Skematisk udsigt over en puppe orienteret for dorsolateral billeddannelse på 16 h og 26 h APF. Det område, som rederne har besat, og som er synligt fra den dorsolaterale side af puppet, fremhæves i mørkegrå ved 16 og 26 h APF. Nederst: Billeder, der viser cellekonturer fra både histoblaster og LEC'er, der er mærket af det allestedsnærværende udtryk for samlemærket Atpα::GFP. A/P-grænsen ligger mellem de to fremhævede rum (Falske farvede celler i blåt = forreste rum; grøn = posteriorrum). (B) Repræsentative snapshots fra langsigtede billeddiagnostiske film fra tidlige til sene faser af reder sammenløbet. Top: Skematisk visning af en puppe orienteret for dorsal imaging på 32 h og 48 h APF. Bund: Cellekonturer (mærket og farvet som i A). Bemærk, at Atpα::GFP-mærket tillader afgrænsning af formen af de enkelte epitelceller over tid med høj opløsning. Vægtstang = 22 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Vævsegenskaber udvundet af klonal analyse. (A) Eksempler på vilde farvekloner i A-rummet, der er markeret med fravær af RFP.nls (sort) og deres to pletter (lyse magenta) ved 26 h APF. Klonerne forlænger langs de segmentale grænser. Tvillingekloner arrangerer parallelt eller i tandem. Vægtstang = 22 μm. (B) Top: Billeder, der illustrerer de parametre, der er kvantificeret fra klonkonturerne. Bund: Oversigtstabel, der rapporterer gennemsnitsværdierne for de angivne parametre for vilde typer dyr (n = 29). (C) Morfologi af en vild type klon ved 26 h (venstre) og 47 h (højre) APF. Klonen viser kompleks kantmorfologi på begge stadier. (D) Kasse- og piskerisplotte til geometriske parametre ved 26 timer (lysegul) og 47 h APF (mørkegul). Det gennemsnitlige område og omkredsen stiger betydeligt i dette tidsvindue. (E) Polarparceller, der repræsenterer klonernes retning (placeringsstørrelse 18°, tæthed proportional med området). Orientering opretholdes under ekspansion og remodeling. (F) Box og whisker plots for form parametre på 26 h (lysegul) og 47 h APF (mørkegul). Ruhed (soliditet), rundhed og cirkularitet ændrer sig næsten ikke. Medianværdierne vises med en rød vandret linje, og whiskers strækker sig til minimum- og maksimumværdierne for fordelingen. Der blev udført statistik med K-SM-test eller W-test (p < 0,0001****, p > 0,05 ikke signifikant). Forreste er til venstre, dorsal er op. Vægtstang = 16 μm. Genotype er hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Langtrækkende orden er en væsentlig egenskab ved de fleste funktionelle fysiologiske enheder. Under morfogenese opnås orden gennem integration af komplekse instruktioner implementeret med høj tidsmæssig og rumlig præcision. Flere og flere niveauer begrænser er integreret i stereotype væv arrangementer.
Polaritet og retningsbestemthed er afgørende for ordnet rumligt arrangement under udvikling. Polaritet indebærer symmetri bryde under udviklingen. Det er nødvendigt at opnå asymmetri til bestemmelse af embryonale anteroposterior (A/P) og dorsoventrale (D/V) akser og voksenorganisation26. Ud over denne tidlige rolle er lokale asymmetrier afgørende for morfologisk mangfoldighed på alle niveauer. Retningsbestemthed er et vigtigt supplement af asymmetri og polaritet under morfogenese. Global orden er implementeret af evnen af celler til at fornemme og sende signaler lokalt på en celle-til-celle base med en præcis forstand eller orientering. Enkeltceller asymmetrier harmonisere kooperativt over tid ved at orientere positioner eller bevægelser inden for bestemte retninger i rummet. Cellekommunikation implicerer udskillede faktorer, cellecellekontakter og mekaniske indgange. Signaler reagerer på felter i celler, der først lokalt og derefter globalt ændrer deres adfærd27.
Dette arbejde præsenterer en enkel måde at analysere den koordinerede adfærd af de enkelte celler, herunder deres planære orientering og vækstparametre under udviklingen af væv orden. Den morfogenese af den voksne mave af Drosophila under pupation præsenterer en række tekniske fordele i forhold til andre tilsvarende modeller såsom kim band forlængelse / tilbagetrækning28 eller dorsal lukning29 under flyve embryogenesis, Drosophila fløj morfogenesis ex vivo30, ventrale kabinet i Caenorhabditis elegans31, eller palatal fusion i mus32, blandt andre.
For det første, maven morfogenese udgør en proces, der kan følges i sin helhed in vivo. Kontinuerlig levende billeddannelse af udskiftning af LECs af histoblaster kan udføres fra 12 h APF, når puppe er dannet, op til afslutningen af voksne epitelmorfogenese. For det andet giver det mulighed for analyser af et komplet sæt celleadfærd, f.eks. Sidst, det er modtagelige for genetisk interferens og klonal analyse. Autonome og ikke-autonome virkninger af tab og gevinst af funktionsaktiviteter kan overvåges live ved at anvende passende markører. Men, puppe som en model system præsenterer nogle mindre begrænsninger. På grund af sin ægformede form, er det ikke muligt at udføre samtidige live billeddannelse af laterale og dorsale begivenheder med høj opløsning. Dette problem kan løses ved at udføre sekventiel billeddannelse i dorsolaterally og dorsally orienteret pupper eller bedre, ved at ansætte flere vinkler lys ark selektiv plan belysning mikroskopi (SPIM) mikroskopi. En anden ulempe er tilstedeværelsen af to forskellige cellepopulationer af forskellige størrelser i analyserne (dvs. polyploid LECs og diploid histoblaster). Dette kan gøre billedsegmentering kompleks, og de to cellepopulationer skal analyseres separat.
I fremtiden kan den langsigtede billeddannelse af Drosophila pupper let tilpasses til at studere en bred vifte af morfogenetiske fænomener, herunder koordinering af epidermal, muskuløs, og neurale udvikling under metamorfose i vilde type og mutant betingelser. Desuden kan de algoritmer og plugins i brug anvendes til at studere organisationen, mønstre og dynamikken i mange andre væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af martín-blanco-laboratoriet for nyttige drøftelser. Vi takker også Nic Tapon (The Crick Institute, London, UK), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) og FlyBase (for Drosophila genanmærkning). Federica Mangione blev støttet af et JAE-CSIC prædoc.stipendium. Martín-Blanco-laboratoriet blev finansieret af Laboratoriumet Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P og BFU2017-82876-P) og fra Fundación Ramón Areces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R.
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W.
