In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Resumen

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

Resumen

Décadas de investigación en muchos organismos modelo han llevado al concepto actual de plasticidad sináptica subyacente al aprendizaje y la formación de la memoria. Los cambios inducidos por el aprendizaje en la transmisión sináptica a menudo se distribuyen a través de muchas neuronas y niveles de procesamiento en el cerebro. Por lo tanto, se necesitan métodos para visualizar la plasticidad sináptica dependiente del aprendizaje a través de las neuronas. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster representa un organismo modelo particularmente favorable para estudiar los circuitos neuronales subyacentes al aprendizaje. El protocolo presentado aquí demuestra una manera en que los procesos subyacentes a la formación de memorias olfativas asociativas, es decir, la actividad sináptica y sus cambios, pueden ser monitoreados in vivo. Utilizando la amplia gama de herramientas genéticas disponibles en Drosophila,es posible expresar específicamente indicadores de calcio codificados genéticamente en poblaciones celulares determinadas e incluso células individuales. Mediante la fijación de una mosca en su lugar, y la apertura de la cápsula de la cabeza, es posible visualizar la dinámica de calcio en estas células mientras se entregan estímulos olfativos. Además, demostramos una configuración en la que la mosca puede ser sometida, simultáneamente, a descargas eléctricas al cuerpo. Esto proporciona un sistema en el que las moscas pueden someterse a un acondicionamiento olfativo clásico - por el cual se aprende a asociar un olor previamente ingenuo con el castigo por descarga eléctrica - al mismo tiempo que la representación de este olor (y otros olores no entrenados) es observada en el cerebro a través de una microscopía de dos fotones. Nuestro laboratorio ha informado previamente de la generación de sensores de calcio localizados sinaptically, lo que permite limitar las señales de calcio fluorescente a compartimentos pre o postsinápticos. La microscopía de dos fotones proporciona una manera de resolver espacialmente estructuras finas. Ejemplificamos esto centrándonos en las neuronas que integran información del cuerpo de la seta, un centro de orden superior del cerebro de insectos. En general, este protocolo proporciona un método para examinar las conexiones sinápticas entre las neuronas cuya actividad se modula como resultado del aprendizaje olfativo.

Introducción

Descifrar dónde y cómo se adquiere la información en el cerebro a través del aprendizaje y posteriormente se almacena como memoria constituye una de las tareas más desafiantes en neurociencia¹. La investigación neurocientífica ha llevado al concepto de un cambio en la transmisión sináptica como el sustrato neuronal que subyace al aprendizaje y la formación de la memoria^2,3. Se presume que, durante el aprendizaje, las conexiones sinápticas entre los conjuntos neuronales que están activos durante la percepción de un estímulo se modifican de tal manera que su patrón de actividad combinado puede ser recuperado durante la memoria, instruyendo así acción conductual futura⁴. Estas "células de engrama" y sus sinapsis se distribuyen a menudo entre las regiones cerebrales y los niveles de procesamiento, lo que hace difícil asignar los cambios observados en la transmisión sináptica al aprendizaje de una tarea o un estímulo. Para localizar y visualizar los cambios sinápticos que están vinculado causalmente a una tarea de aprendizaje específica se necesita un sistema modelo adecuado que permita precisamente el confinamiento de esas sinapsis.

Para tal esfuerzo, Drosophila melanogaster es particularmente adecuado porque combina simplicidad cerebral relativa, riqueza conductual y accesibilidad experimental. Entre los organismos modelo bien establecidos, Drosophila está situado entre el nematodo C. elegans y mamíferos genéticamente tractables como ratones en términos de complejidad neuronal. El número estereotípico de neuronas (300) y el repertorio de comportamiento limitado se observa en C. elegans. Los mamíferos, por otro lado, tienen millones de neuronas y una complejidad conductual asombrosa. El cerebro de la mosca de la fruta es, con sus 100.000 euros, neuronas significativamente más pequeñas que los cerebros de la mayoría de los vertebrados, y muchas de las neuronas son identificables individualmente⁵. Sin embargo, Drosophila demuestra un amplio espectro de comportamientos complejos, incluyendo la capacidad de exhibir un sólido aprendizaje olfativo asociativo y la formación de la memoria, descrito por primera vez hace más de 40 años⁶. En el curso de este procedimiento de acondicionamiento clásico, los grupos de moscas son sometidos a un olor como estímulo condicionado (CS⁺) mientras reciben una descarga eléctrica castigadora como estímulo incondicional (EE.UU.). Un segundo olor (CS^-) se presenta sin ningún castigo. De este modo, los animales aprenden a evitar el olor asociado con el castigo, que se puede probar en una situación de elección posterior entre los dos olores, CS⁺ y CS^-. El trabajo en la disección del sustrato neuronal subyacente a este comportamiento en Drosophila ha identificado los cuerpos de setas (MB) como el sitio primario del "engram"^7,8,9,10 y, por lo tanto, el circuito de esta región cerebral fue y es objeto de intensa investigación con el fin de descubrir la lógica por la que se adquiere y almacena un engrama de memoria (revisado recientemente en^11,12).

La Drosophila MB se compone de 2.000 neuronas intrínsecas (células de Kenyon) por hemisferio, organizadas en proyecciones axonales paralelas^13. Los axones de neuronas de proyección olfativa se extienden a la protocerebra lateral y a los cálices MB, el principal sitio de entrada dendrítica del MB y reciben la entrada olfativa de los lóbulos antenales. El largo y paralelo haz de axons de células Kenyon constituyen el pedúnculo y los lóbulos. La mayoría de las células de Kenyon se bifurcan formando lóbulos horizontales de los lóbulos de la parte media del cerebro, y los lóbulos verticales de los lóbulos de la línea central de la región, extendiendo la segunda proyección colateral en la dirección dorsal-anterior. El otro grupo de células de Kenyon forma los lóbulos horizontales¹³ del MB donde el proceso de aprendizaje y la posterior formación de la memoria a corto plazo podrían ser localizados¹⁰. Los lóbulos MB reciben una entrada aferente y proporcionan una salida eferente, que normalmente están restringidas a subregiones compartimentales distintas a lo largo de los axons de celda Kenyon^14,15,16. En particular, se ha demostrado que las neuronas de entrada dopaminérgicas aferentas MB median en medios basados en valores, por ejemplo, efectos punitivos y de refuerzo en el aprendizaje olfativo asociativo^15,17. Las neuronas de salida estereotípicas efusivas y efusivas MB de los lóbulos del cuerpo de la seta integran información a través de un gran número de células Kenyon, se dirigen a diversas áreas cerebrales y llevan información apologiva o aversiva al comportamiento¹⁵ . Esta arquitectura neuronal ha llevado a un concepto de la organización del engrama asociativo. Los olores son codificados con relativa precisión por conjuntos escasamente activados de células Kenyon. La actividad coincidente de estos conjuntos celulares de Kenyon y la liberación de dopamina - evocado por estímulos castigadores - modula la transmisión de la célula de Kenyon presinapnaftas en las neuronas de salida MB de modo que los animales posteriormente evitarán este olor en particular^{10 ,12}. Usamos este engrama bastante preciso definido y localizado como un caso paradigmático para ilustrar cómo se pueden determinar y supervisar estos cambios dependientes del aprendizaje en la actividad sináptica.

El valor de Drosophila como sistema modelo se basa en gran medida en la caja de herramientas genética sin igual que permite expresar transgenes para identificar, monitorear y controlar neuronas individuales dentro de circuitos complejos^18. El advenimiento de técnicas para el monitoreo de la actividad neuronal -como la toma de imágenes de calcio, discutida aquí- ha permitido la determinación de patrones de actividad neuronal en respuesta a un estímulo específico. Mediante la combinación de la expresión específica impulsada por Gal4 de indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) con estimulación olfativa, se puede visualizar la dinámica de calcio evocada por olores de las neuronas de interés¹⁹. En este protocolo, se demuestra que al acoplar aún más esta técnica con un paradigma de acondicionamiento clásico, es posible examinar estas respuestas olfativas en el contexto del aprendizaje. La plasticidad inducida por el aprendizaje se puede diseccionar aún más utilizando GECI que no solo se localizan en una sola neurona específica, sino también en subcompartimentos específicos de una neurona. ²⁰ establecieron una selección de herramientas que permiten exactamente esto. Al dirigir setrata de GCaMP3²¹ a la pre- o postsina) - a través de la vinculación con el vertebrado Synaptophysin o dHomer, respectivamente²⁰- se puede distinguir la modulación diferencial de estos sitios. Esta localización confiere, en este contexto, una ventaja sobre la mayoría de las GECI que están presentes omnipresentes en todo el citosol - por ejemplo, GCaMP^22,GCaMP3²¹o GCaMP6²³ - porque significa que los transitorios pre y postsinápticos pueden ser transitorios distinguida de la influjo de calcio integrado general que se produce como resultado de la activación de la neurona. Esto puede proporcionar pistas sobre la ubicación y los tipos de plasticidad que se producen como resultado de o que causan el aprendizaje y la formación de la memoria. Como ejemplo, el protocolo proporcionado aquí muestra el valor de esta herramienta para descifrar la modulación de las neuronas de salida MB durante el aprendizaje asociativo olfativo dirigiendo la expresión del sensor de calcio a sólo la postsinapsis. Mediante el monitoreo, dentro de una mosca individual, la actividad evocada por olores antes y después del acondicionamiento olfativo se puede extraer una comparación directa entre una respuesta de olor ingenua y una respuesta de olor aprendido. Mientras se fijan en la misma cámara de imágenes, las moscas se exponen a una selección de olores. A continuación, reciben un protocolo de acondicionamiento asociativo aversivo en el que uno de estos olores se combina con la descarga eléctrica (convirtiéndose en el CS⁺) y otro olor se presenta sin refuerzo (convirtiéndose en el CS^-). Finalmente, las moscas se exponen de nuevo a los mismos olores que en el primer paso. La dinámica del calcio se observa mediante microscopía de dos fotones.

Protocolo

1. Moscas de la fruta transgénicas, Drosophila melanogaster

1. Cruzar moscas vírgenes y machos hembras (elevadas a 25oC en 60% de humedad relativa en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h) llevando las construcciones deseadas de Gal4 y UAS^25,respectivamente, para producir moscas en las que neuronas específicas de interés expresan una indicador de calcio.
2. Envejecer la progenie femenina de la cruz anterior hasta que estén en el rango de 3-6 días después de la eclosión. Las moscas hembra son preferibles debido a su tamaño ligeramente más grande.

2. Preparación de la mosca de la fruta para imágenes de calcio in vivo

1. Seleccione una sola mosca hembra y anestetizar en hielo durante no más de 5 min.
2. Con fórceps finos, coloque la mosca en la cámara de imágenes (demostrada en la Figura 1c). Asegúrese de que el tórax y las patas estén en contacto con los cables eléctricos en la parte inferior de la cámara y que la cabeza quede plana. Fije la posición de la mosca usando cinta adhesiva transparente.
   NOTA: Este protocolo requiere una cámara construida a medida en la que las moscas estén fijas, con la cápsula de la cabeza accesible para su apertura, y las moscas capaces de recibir tanto estimulaciones de olor a las antenas como descargas eléctricas en el tórax y las piernas(Figura 1).
3. Usando una cuchilla quirúrgica de bisturí fijada a la manija del bisturí (ver Tabla de Materiales),corta una ventana en la cinta alrededor de la cabeza de la mosca, dejando las antenas cubiertas y sólo la porción anterior del tórax expuesta.
4. Rodea los lados y la parte posterior de la cabeza con pegamento de curado de luz azul, cuidadosamente manipulado usando un alfiler de insectos sostenido por mandíbulas cóncava-convexas. Ajuste el pegamento con una lámpara LED azul emisor de luz.
5. Compruebe que el pegamento está completamente ajustado y borre cualquier pegamento residual sin endurecer de la superficie dorsal de la cabeza de la mosca.
6. Aplique una gota de la solución²⁴ de Ringer (ver Tabla de Materiales)para cubrir la cutícula expuesta de la cabeza.
7. Usando un cuchillo de apuñalamiento muy fino, corta la cutícula. Para la eliminación más eficiente de la cutícula, primero corte a través de la parte posterior de la cabeza utilizando el ocelli como punto de partida. Luego, corte cada lado, medial a los ojos, para formar una solapa de la cutícula que se puede arrancar fácilmente usando fórceps.
8. Retire cualquier exceso de cutícula que pueda bloquear la región cerebral de interés.
9. Limpie cuidadosamente la superficie dorsal de cualquier tráquea usando fórceps finos, evitando la interrupción del propio tejido cerebral. Retire y refresque la solución²⁴ de Ringer (ver Tabla de Materiales)según sea necesario para limpiar el área de los desechos de tejido.
10. Coloque la aguja de entrega de olor hipodérmico en posición, aproximadamente a 1 cm de la cabeza de la mosca. Asegúrese de que no haya nada que pueda obstruir la entrega de olores a las antenas.
11. En el microscopio, conecte la cámara de imágenes al sistema de suministro de olores a través de la aguja de entrega de olor hipodérmico.
12. Para permitir que la mosca se recupere completamente de la anestesia y la cirugía, y para adaptarse al flujo de aire, implemente un período de descanso de 10 minutos en esta etapa.

3. Imágenes de calcio in vivo

1. Utilice un microscopio multifotón equipado con un láser infrarrojo y un objetivo de inmersión en agua (ver Tabla de Materiales),instalado en una mesa aislada por vibración. Para la visualización de indicadores de calcio basados en GFP, ajuste el láser a una longitud de onda de excitación de 920 nm e instale un filtro de paso de banda GFP.
2. Usando la perilla de ajuste Z gruesa, escanee a través del eje Z del cerebro y localice la región cerebral de interés. Utilice la función de recorte para enfocar el escaneo solo en esta área para minimizar el tiempo de escaneo y para girar la vista de escaneado de modo que la parte anterior de la cabeza esté orientada hacia abajo.
3. Ajusta el tamaño del marco a 512 x 512 px, la velocidad de escaneo a > 4 Hz y la región de escaneo (en la dimensión Y) para que las neuronas de interés estén cubiertas.

4. Visualización de transitorios de calcio con olor escondedos a través del condicionamiento olfativo

1. Utilice un sistema de suministro de olores^19,26 que pueda suministrar varios estímulos de olor de una manera temporalmente precisa.
   1. Utilice un ordenador adicional para controlar el dispositivo y para comunicarse con el software del microscopio de imágenes para coordinar las estimulaciones de olores con la captura de imágenes durante los experimentos.
   2. Iniciar un paquete de macros preprogramado capaz de vincular el software de adquisición de imágenes y el programa de entrega de olores (por ejemplo, un paquete de macros VBA instalado en el software de control del microscopio, consulte Tabla de materiales)que responde a una entrada externa activador proporcionado por la iniciación de un protocolo de entrega de olores en un programa separado).
2. Comience la medición monitoreando los transitorios de calcio "preentrenamiento"/olor ingenuo evocado a una resolución de 512 x 512 px y una velocidad de fotogramas de 4 Hz. Proporcione un estímulo de olor de 2,5 s flanqueado por la adquisición de imágenes adicionales para 6,25 s antes del inicio del olor (para establecer una F ₀ valor basal) y 12,5 s después del desplazamiento del olor. Repita esto con un segundo olor y luego con un tercer olor.
3. Continúe 3 minutos después de esta medición con el acondicionamiento clásico ("entrenamiento") la mosca.
   1. Seleccione uno de los olores presentados en la fase de "preentrenamiento" para convertirse en el CS⁺ olor y otro para convertirse en el CS^- olor. Presente el CS⁺ olor utilizando el sistema de entrega de olores controlado por computadora para 60 s junto con doce descargas eléctricas de 90 V.
   2. Después de una rotura de 60 s, presentar la CS^- olor solo para 60 s. Usar como olorantes 4-metilciclohexanol y 3-octanol. No presente el tercer olor (por ejemplo, 1-octen-3-ol) durante este entrenamiento, ya que se utiliza como control sólo antes (paso 4.2.) y después (paso 4.4) de la fase de entrenamiento.
4. Mida de nuevo los transitorios de calcio con olor "post-entrenamiento" repitiendo el protocolo de estimulación del olor "preentrenamiento" (paso 4.2.) 3 min después de terminar la fase de entrenamiento (paso 4.3).
   NOTA: El tiempo de este paso debe reflejar el tiempo de interés después de la formación de la memoria (por ejemplo, llevar a cabo este paso 3-4 min después del paso de acondicionamiento para investigar la memoria a corto plazo). Típicamente, las moscas pueden sobrevivir durante varias horas en esta preparación.
5. Guarde los archivos de imágenes en un formato adecuado (por ejemplo, Tiff) para un análisis de imagen posterior.

5. Análisis de imágenes

1. Para analizar imágenes, abra archivos Tiff (o similares) en el software de análisis de imágenes como Fiji²⁷.
2. Alinee las pilas utilizando un algoritmo de corrección de movimiento para garantizar un movimiento mínimo en las direcciones X e Y. Deseche las grabaciones que muestren un movimiento fuerte en el eje Z.
3. Seleccione la herramienta del software utilizado para marcar una región de interés (ROI) alrededor del área que se va a examinar. Esto debe ser lo más preciso posible para limitar la influencia de la fluorescencia de fondo.
4. Utilice la herramienta respectiva del software para extraer datos de intensidad de fluorescencia temporal como archivos de datos del ROI seleccionado, de modo que se genere un valor para cada fotograma de la grabación.
5. Abra los datos utilizando un programa de análisis de datos para calcular los valores de F/F₀ para cada seguimiento de olor. F₀ - fluorescencia media en los 2 s antes de la aparición del olor. •F : la diferencia entre la fluorescencia en bruto en un fotograma determinado y F₀. A partir de estos valores, calcule un valor de F/F₀ para cada fotograma que se puede trazar contra el tiempo para reflejar la fluorescencia relativa durante todo el período de estímulo del olor.

Resultados

Un ejemplo de las imágenes adquiridas con el protocolo antedicho se puede ver en el cuadro 2. d Homer-GCaMP3 se expresa en una neurona de salida MB cuyas dendritas infunden el compartimiento 1 del lóbulo MB (la neurona se denomina MVP2^28,29)y está dirigida genéticamente utilizando la línea split-Gal4 MB112C¹⁶. También, se demuestra la diferencia en la localización subc...

Discusión

La disección de los circuitos neuronales subyacentes al aprendizaje y la memoria es un objetivo prominente en el campo de la neurociencia. La accesibilidad genética de Drosophila y la amplitud y facilidad de las pruebas conductuales hacen de esta una herramienta ideal para investigar este tipo de fenómenos. Aquí, se presenta un método con el que es posible visualizar, dentro de moscas individuales, la modulación que se produce a un nivel subcelular como resultado del acondicionamiento olfativo. Mediante la reali...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU	O5284	Producto químico utilizado como odorante
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	218405	Producto químico utilizado como odorante
4-Metilciclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU	. 153095	Producto químico utilizado como odorante
Filtro de paso de banda para EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania
Cinta adhesiva transparente	Tesa SE, Norderstedt, Alemania		Cinta adhesiva transparente estándar
Mordazas cóncavas-convexas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	10053-09	Portacuchillas con mordazas cóncavas-convexas Pinzas
finas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	11412-11	Pinzas con punta 0,1 x 0,06 mm
Aguja hipodérmica	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Alemania	4665120	1.20x40mm
Alfileres de Minutien para insectos	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	26002-10	Diámetro 0,1 mm, punta 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Reino Unido	953683	Pegamento fotopolimerizable azul Portaobjetos
microscopio	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemania	0656.1	Objetivo estándar Diapositiva 76 x 26 mm
Aceite mineral	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Utilizado como diluyente para odorantes
Láser Ti-Sapphire con bloqueo de modo Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Láser de femtosegundo infrarrojo sintonizable
Microscopio multifotónico LSM 7MP equipado con detectores BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania		Microscopio multifotónico, varias empresas proporcionan dispositivos similares.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) objetivo de inmersión en agua	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania	421452-9900-000	Objetivo W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Solución de Ringer			KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sacarosa, pH = 7,4
Cuchillo de apuñalamiento	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, EE. UU	. 72-1551	5,0 mm Profundidad de hoja recta restringida
Hoja de bisturí quirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	0303	Producto n.º 11
Mango de bisturí quirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	0907	N.º de producto 7S/S
Software Visual Basics of Applicatons (VBA) para recibir un disparador del dispositivo de entrega de olores y el dispositivo de aplicación de descargas eléctricas (fuente de alimentación) para interactuar con el software ZEN de Zeiss que controla el microscopio.	Escrito a medida y disponible a pedido	n.a.n.a	.