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Disección de los músculos de vuelo de Drosophila melanogaster para los enfoques de Omics

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DOI:

10.3791/60309

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17 de octubre de 2019

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1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El músculo de vuelo drosofífia es un modelo potente para estudiar la regulación transcripcional, el empalme alternativo, el metabolismo y la mecanobiología. Presentamos un protocolo para la disección del músculo de vuelo con etiqueta fluorescente a partir de pupas vivas para generar muestras altamente enriquecidas ideales para la proteómica y la secuenciación profunda. Estas muestras pueden ofrecer importantes perspectivas mecanicistas sobre diversos aspectos del desarrollo muscular.

Resumen

El músculo de vuelo drosofilia es un modelo potente para estudiar diversos procesos como la regulación transcripcional, el empalme alternativo, el metabolismo y la mecanobiología, que influyen en el desarrollo muscular y la miofibrillogénesis. Los datos de omics, como los generados por espectrometría de masas o secuenciación profunda, pueden proporcionar información mecanicista importante sobre estos procesos biológicos. Para estos enfoques, es beneficioso analizar muestras específicas de tejido para aumentar la selectividad y la especificidad de las huellas dactilares omicas. Aquí presentamos un protocolo para la disección de músculo de vuelo con etiqueta fluorescente de pupas vivas para generar muestras musculares altamente enriquecidas para aplicaciones de omics. Primero describimos cómo diseccionar los músculos de vuelo en las primeras etapas pupal (<48 h después de la formación de puparium [APF]), cuando los músculos son discernibles por el etiquetado de proteína fluorescente verde (GFP). A continuación, describimos cómo diseccionar los músculos de las pupupas tardías (>48 h APF) o adultos, cuando los músculos son distinguibles bajo un microscopio de disección. El protocolo de vídeo que lo acompaña hará que estas disecciones técnicamente exigentes sean más accesibles para las comunidades de investigación de músculo y Drosophila. Para aplicaciones de ARN, se asayuna la cantidad y calidad del ARN que se puede aislar en diferentes puntos de tiempo y con diferentes enfoques. Demostramos además que Bruno1 (Bru1) es necesario para un cambio temporal en el empalme de la cadena pesada de miosina(Mhc),lo que demuestra que los músculos diseccionados se pueden utilizar para mRNA-Seq, espectrometría de masas y reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) Aplicaciones. Este protocolo de disección ayudará a promover análisis de omics específicos del tejido y se puede aplicar generalmente para estudiar múltiples aspectos biológicos de la miogénesis.

Introducción

Las tecnologías modernas de la omica proporcionan información importante sobre el desarrollo muscular y los mecanismos subyacentes a los trastornos musculares humanos. Por ejemplo, el análisis de datos de transcriptómica combinados con la verificación genética y bioquímica en modelos animales ha revelado que la pérdida del factor de empalme RBM20 causa miocardiopatía dilatada debido a su regulación de una red objetivo de más de 30 sarcomeres genes previamente asociados con enfermedades del corazón, incluyendo la titina1,2,3.

En un segundo ejemplo, estudios del cultivo celular, modelos animales y pacientes humanos han demostrado que la distrofia miotónica es causada por una interrupción en la regulación del ARN debido al secuestro de muscleblind (MBNL) y a la regulación ascendente de CELF14,5. La dinámica transversal y temporal entre MBNL y CELF1 (también llamada CUGBP1 o Bruno-Like 2) ayuda a explicar los patrones de empalme embrionario persistente en pacientes con distrofia miotónica. Además, la gran red de objetivos mal regulados ayuda a explicar la naturaleza compleja de la enfermedad4,6,7,8. La mayoría de estos estudios utilizan enfoques omics en organismos modelo genéticos para entender los mecanismos subyacentes a la enfermedad muscular humana. Además, destacan la importancia de entender primero la expresión génica específica de tipo temporal y tisular, la modificación de proteínas y los patrones metabólicos en el músculo sano para comprender las alteraciones en el músculo enfermo o envejecido.

Drosophila melanogaster es otro organismo modelo genético bien establecido. La estructura del sarcomere, así como los componentes individuales del sarcomere se conservan altamente de las moscas a los vertebrados4,9,10,y los músculos de vuelo indirectos (IfM) se han convertido en un modelo poderoso para estudiar múltiples aspectos del desarrollo muscular11,12. En primer lugar, los músculos de vuelo fibrilar son funcional y morfológicamente distintos de los músculos tubulares del cuerpo11,13, lo que permite la investigación de mecanismos de desarrollo específicos de tipo muscular. Los factores de transcripción, incluidos Spalt major (Salm)14,Extradenticle (Exd) y Homothorax (Hth)15, han sido identificados como reguladores del destino fibrilar. Además, aguas abajo de Salm, el homólogo CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) dirige un programa de empalme específico de la fibrilar16,17.

En segundo lugar, las HFI son un modelo importante para entender el proceso de miogénesis en sí, desde la fusión de mioblastos y el apego miotubo a la miofibrillogénesis y la maduración del sarcomere9,18,19. En tercer lugar, la genética Drosophila permite investigar las contribuciones de proteínas individuales, dominios de proteínas e isoformas de proteínas a la formación, función y propiedades biofísicas de sarcomere20,21,22 ,23. Por último, se han desarrollado modelos IFM para el estudio de múltiples trastornos musculares humanos, como distrofia miotónica, miopatías miofibrilares, trastornos degenerativos musculares, actinopatías, etc.24,25,26 ,27, y han proporcionado información importante sobre los mecanismos de la enfermedad y las posibles terapias28,29,30. Por lo tanto, Drosophila es un modelo útil para abordar muchas preguntas abiertas en el campo de la miogénesis, incluyendo mecanismos de transcripción específica de tipo muscular, empalme, y regulación de la cromatina, así como el papel del metabolismo en el desarrollo muscular. La aplicación de tecnologías omicas modernas, en particular en combinación con la amplia variedad de ensayos biológicos genéticos, bioquímicos y celulares disponibles en Drosophila,tiene el potencial de avanzar dramáticamente en la comprensión de los desarrollo, envejecimiento y enfermedades.

Las EMM son los músculos más grandes de la mosca, abarcando casi 1 mm a lo largo de toda la longitud del tórax en adultos31,32. Sin embargo, este pequeño tamaño genera el desafío de obtener suficiente muestra para aplicar tecnologías omicas en Drosophila de una manera específica de tipo de tejido. Además, las EFI son parte de la musculatura adulta que se forma durante las etapas pupal. Los mióblastos se fusionan para formar miotubos, que se unen a los tendones alrededor de 24 h después de la formación del puparium (APF) y se someten a un paso de compactación necesario para iniciar la miofibrillogénesis alrededor de 30 h APF(Figura 1A-D)18,33, 34.

Las miofibers crecen hasta entonces crecer hasta abarcar toda la longitud del tórax, con miofibrils sometidos a una fase de crecimiento inicial centrada en la adición de sarcomere hasta alrededor de 48 h APF, y luego la transición a una fase de maduración, en la que los sarvenes crecen en longitud y anchura y son remodelado para establecer la activación de estiramiento por 72 h APF(Figura 1A-D)32,35. La aparición de la maduración de la fibra está controlada al menos parcialmente por Salm y E2F32,36,37,y múltiples isoformas de proteína de sarcomere específicas de IFM cuya empalpedura es controlada por Bru1 se incorporan durante este fase16,17. Las moscas maduras cierran de 90-100 h APF. Esto significa que para estudiar el desarrollo muscular, IFM tiene que ser aislado con suficiente cantidad, calidad y pureza de múltiples puntos de tiempo pupal para facilitar el análisis utilizando enfoques omics.

Se han publicado varios protocolos para la disección IFM. Si bien estos protocolos funcionan bien para sus aplicaciones previstas, ninguno es ideal para enfoques omics. Los protocolos que preservan la morfología IFM para la inmunofluorescencia de las IFM19pupales y adultas, aíslan las fibras IFM para la evaluación mecánica31,o utilizan microdisección de IFM pupal de las criosecciones38 son demasiado especializados y el tiempo y mano de obra para obtener razonablemente cantidades suficientes de tejido IFM para aplicaciones de omics. Otros protocolos se han desarrollado para la disección rápida de IFM38específicamente adultos,39, por lo tanto no son aplicables a las etapas pupal, y utilizan buffers que no son ideales o pueden ser incompatibles con, por ejemplo, el aislamiento de ARN. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos enfoques para aislar la IFM pupal para aplicaciones de bioquímica u omics.

Aquí presentamos un protocolo para la disección de IFM durante las etapas pupal que se ha utilizado con éxito para el análisis mRNA-Seq desde 16 h APF a través de etapas adultas16,32. El protocolo emplea una etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP) para identificar las MFI en todas las etapas del desarrollo pupal y adulto, permitiendo la disección en vivo bajo un microscopio de disección fluorescente. El enfoque es menos intensivo en mano de obra, con un mayor rendimiento que los protocolos de disección IFM existentes. Esto permite el aislamiento rápido y la criopreservación de muestras, generando suficiente material después de varias rondas de disección para enfoques omics, así como para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa estándar (RT-PCR) o la hincha occidental.

Presentamos el protocolo en dos partes, demostrando cómo diseccionar rápidamente las IfM tanto antes de 48 h APF (durante la metamorfosis temprana, cuando los accesorios de IFM son más tenues) como después de 48 h APF (cuando el plan corporal pupal y los accesorios de IFM están bien definidos). Demostramos que podemos aislar el ARN de alta calidad de las IfM diseccionadas en todos los puntos de tiempo y presentar datos sobre diferentes enfoques para el aislamiento del ARN y la transcripción inversa. Por último, demostramos la aplicación del protocolo de disección a mRNA-Seq, espectrometría de masas y RT-PCR utilizando el homólogo CELF1 Bruno1 como ejemplo. Mostramos la expresión errónea de isoformas de proteínasar en datos proteómicos de la IFM mutante Bruno1 y examinamos la regulación Bruno1 del evento de empalme C-terminal de la cadena pesada de Myosin (Mhc). Estos resultados ilustran cómo los datos de omics pueden proporcionar una comprensión más profunda de los fenómenos biológicos, complementando los experimentos genéticos y bioquímicos.

Protocolo

1. Escenificación de las puas

  1. Levante moscas del genotipo deseado en botellas(Figura 1E). Haga un nuevo tirón de la sección o establezca una cruz con al menos 20 moscas vírgenes femeninas. Mantener las botellas hasta que las moscas comiencen a pupar.
  2. Recoger las capas previas con un pincel humedecido y transferirlo al papel de filtro humedecido en una placa Petri de 60 mm(Figura 1F).
  3. Sexo las pupupas, recogiendo el género adecuado para el experimento(Figura 1G). Los machos se identifican por la presencia de testículos, que aparecen como bolas translúcidas en la pupa de otro modo opaca.
  4. Etiquete el plato Petri con la hora, la fecha y el genotipo y, a continuación, envejezque las puas hasta la etapa deseada(Figura 1H).
    NOTA: Mantener cruces/stocks y pueuras de edad en una incubadora de temperatura controlada (es decir, 25 o C o 27 oC para cruces RNAi, ya que el aumento de la actividad de Gal4 a temperaturas más altas aumenta la eficiencia de derribo40). Asegúrese de que la humedad es lo suficientemente alta para que las pupalas no se sequen cuando envejecen varios días.

2. Disección IFM Antes de 48 h APF

  1. Montar el equipo necesario, incluidos dos fórceps de grado de biología #5, una pipeta, puntas de pipeta, hielo seco y (para muestras de ARN) reactivo de aislamiento (ver Tabla de Materiales). Además, platos de disección negros fríos (ver Tabla de Materiales),1 tampón de solución salina con fosfato (PBS) y tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo.
  2. Usando un pincel humedecido, transfiera pudeas escenificadas a un plato de diselación negro lleno de aproximadamente dos tercios con 1PBS frío(Figura 2A,B). Pasar a un microscopio de disección fluorescente.
    NOTA: Utilice tantas pudas como se puedan diseccionar en una ventana de tiempo de 30 minutos. Dependiendo de la experiencia, esto oscila entre 3 y 15 puyae. Consulte Métodos suplementarios para la discusión de alternativas a los platos de diselación negros.
  3. Usando #5 fórceps, empuje una de las pupas hacia la parte inferior de una placa de disección negra y ajuste el zoom y el enfoque del microscopio para ver claramente la pupa(Figura 2C).
  4. Agarre la anterior de la pupa con un fórceps(Figura 2D)y, a continuación, empuje las pupas con una sola punta de los otros fórceps ligeramente descentrado en el abdomen, justo detrás del tórax. Esto mantiene la pupa en su lugar y evita que las EMM se muevan hacia el abdomen(Figura 2E).
    NOTA: Comience a cronometrar la longitud de la disección desde este punto, tan pronto como se interrumpa la integridad pupal. Utilice una longitud definida de disección (por ejemplo, de 20 a 30 min) para minimizar la muerte muscular y los cambios transcriptomicos y proteómicos asociados. Diseccionar tantas moscas como sea posible en este período de tiempo.
  5. Con los primeros fórceps, quite la mitad anterior del estuche pupal(Figura 2F).
  6. Usa los mismos fórceps para pellizcar las pupas expuestas justo detrás del tórax, y separa el abdomen del tórax(Figura 2G).
  7. Con los fórceps, apriete suavemente la parte anterior del tórax (para <35 h APF) o abra el tórax para exponer las EMM con etiqueta fluorescente(Figura 2H). Las EFI se separarán fácilmente de la epidermis, ya que los accesorios de tendón en los primeros momentos son frágiles. Deseche el cadáver restante usando fórceps para empujarlo al lado opuesto de la placa.
  8. Repitiendo los pasos 2.3–2.7, diseccionar pupupas adicionales.
  9. Recoger las fibras IFM con fórceps y organizarlas en una pila en la parte inferior de la placa de diseción negra(Figura 2I, J). Elimine los restos expulsándolos del campo de visión con fórceps.
    NOTA: Con la práctica, las puntas de fórceps se pueden acercar sin tocarse entre sí. Esta técnica se puede utilizar para agarrar libremente las EMF sin destruirlas. Los métodos alternativos incluyen empujar o levantar suavemente las MFI con una sola punta o fórceps completamente cerrados, o tomar algo de grasa u otro tejido con el IFM y eliminar la grasa como se describe en el paso 2.10.
  10. Control de calidad de la muestra muscular IFM, utilizando los fórceps para eliminar los músculos no IFM, grasa, cutícula, etc. de la muestra(Figura 2K,L).
    NOTA: Con Mef2-Gal4, IFM está etiquetado con más fuerza que otros tipos de músculo en los primeros momentos(Figura 2K,K'),lo que permite la eliminación de músculo de salto y músculos larvales basados en la intensidad de la fluorescencia y la forma muscular. El tejido graso y de la cutícula se ve diferente y no está etiquetado por una etiqueta de fluorescencia específica del músculo(Figura 2K,K'). Consulte la sección de discusión para otras líneas Gal4 que etiquetan IFM.
  11. Usando una punta de pipeta recortada, transfiera la pila de EMM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml lleno de 250 ml de 1x PBS refrigerado(figura 2M-O). Proceda inmediatamente a la sección 4.
    NOTA: Las muestras de IFM pueden perderse simplemente adiéndose al lado de la punta de la pipeta. El tampón de pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de recoger las MFI puede hacer que las puntas estándar sean menos pegajosas, y las puntas siliconizadas o perfluoroalkoxi (PFA) (ver Tabla de materiales)con tensiones superficiales más bajas pueden ayudar a prevenir la pérdida de muestras.

3. Disección IFM Después de 48 h APF

  1. Montar el equipo necesario, incluidos dos fórceps de grado de biología #5, tijeras finas, portaobjetos de microscopio de vidrio estándar, cinta de doble palo, pipeta, puntas de pipeta, hielo seco y (para aplicaciones de ARN) reactivo de aislamiento (ver Tabla de materiales). Enfríe los 1x TUBOS PBS y microcentrífugos en hielo.
  2. Con un pincel ligeramente humedecido, transfiera las pupalas escenificadas a una tira de cinta adhesiva de doble cara montada en una diapositiva de microscopio(Figura 3A). Coloque las puas en una línea orientada en la misma orientación (ventral hacia abajo y anterior hacia la parte inferior de la diapositiva).
    NOTA: Tenga cuidado de no usar demasiada agua en el pincel o filtro, o las puas no se pegarán bien. Si las puas no se pegan, séquelas primero transfiriéndolas a un filtro seco o a papel tisú. Montar tantas pusias como se puedan diseccionar dentro de una ventana de tiempo de 30 minutos, idealmente 10 pupae.
  3. Retire la pupa de la funda pupal. Utilice fórceps para burlarse y abrir el estuche pupal por encima de los espiráculos anteriores(Figura 3B).
  4. Deslice suavemente un par de fórceps dorsalmente hacia la parte posterior, cortando la caja pupal a medida que los fórceps se mueven(Figura 3B'). Tenga cuidado de no romper la pupa subyacente. Liberar la pupa de la caja abierta y transferirla inmediatamente a una gota de 1x PBS en una segunda diapositiva del microscopio(Figura 3B",C).
  5. Repita los pasos 3.3 y 3.4 para todas las puas en la línea y, a continuación, deje a un lado la diapositiva de cinta de doble palo.
  6. Con las tijeras finas, corte el abdomen de la pupa lejos del tórax y empújelo en una pila separada(Figura 3D,D'). Repita el procedimiento para las puas restantes.
    NOTA: Comience a cronometrar la duración de la disección con el paso 3.6, tan pronto como se interrumpa la integridad del pupal. Diseccionar tantas moscas como sea posible en 20-30 minutos para prevenir la muerte celular y los cambios transcriptomicos y proteómicos asociados. Al disección 1 d adultos o >90 h pupae, a menudo es conveniente para pasos posteriores para quitar adicionalmente la cabeza con las tijeras finas.
  7. Usando un papel tisú, retire la mayoría de los 1x PBS (generalmente turbio con grasa suspendida) así como la pila de abdomen(Figura 3E). Añade una gota de 1x PBS fresco y frío a los thoraxes restantes.
  8. Utilice las tijeras para cortar el tórax por la mitad(Figura 3F, F')cortando desde la cabeza hacia abajo el eje longitudinal del cuerpo en un solo movimiento. Alternativamente, si se ha quitado la cabeza, primero inserte las tijeras donde se unificó la cabeza y corte la mitad superior del tórax longitudinalmente entre las EMB. A continuación, corte el lado ventral del tórax con un segundo corte en la misma orientación.
  9. Repita los pasos 3.7 y 3.8 para que todas las pupuas se diseccionen, generando una pila de hemisecciones del tórax cerca del centro de la diapositiva. Asegúrese de que haya suficiente 1 PBS refrigerado en la diapositiva para que las hemisecciones no se sequen.
    NOTA: Después de 48 h APF, las IfM son lo suficientemente grandes como para ser visibles bajo un microscopio de disección estándar al ojo entrenado. En este punto del protocolo, los músculos con una etiqueta fluorescente se pueden mover a un alcance de disección fluorescente para ayudar en la identificación de IFM o con fines de entrenamiento, pero esto no es necesario.
  10. Diseccionar las EFI fuera del tórax. Aísle una de las hemisecciones utilizando el #5 fórceps(Figura 3G,H). Inserte suavemente las puntas de un fórceps por encima y por debajo de la mitad de las MFI(Figura 3G', H'). Mientras mantiene los primeros fórceps todavía, utilice tijeras finas para cortar un extremo de la IFM lejos de la cutícula y los tendones. A continuación, corte el otro extremo de la IfM libre de la cutícula(Figura 3G'', H'').
    NOTA: Dependiendo de la orientación del tórax después del primer corte IFM, es útil girar el tórax 180o para que el segundo corte IFM sea más fácil de realizar.
  11. Retire el haz IFM del tórax con fórceps(Figura 3G''', H'''), transfiriéndolo al borde de la burbuja PBS para utilizar la tensión de agua para mantenerlo en su lugar(Figura 3I). Empuje el cadáver hacia el lado opuesto de la diapositiva. Repita para las hemisecciones restantes del tórax, generando una colección de EFI diseccionadas.
    NOTA: Si las EFI no permanecen en una pila ordenada, retire algunos de los 1o PBS con un tejido. Tenga cuidado de no dejar que todos los PBS se evaporen y asegúrese de que las EFI y los hemitóreos diseccionados permanezcan cubiertos por el tampón.
  12. Después de diseccionar todos los MFI, realice rápidamente un control de calidad en el músculo diseccionado. Usando #5 fórceps, eliminar cualquier músculo de salto o fragmentos de cutícula que puedan haber encontrado su camino en la muestra(Figura 3J-K'').
    NOTA: El músculo de salto parece diferente del IFM. Si disección Mef2-Gal4 etiquetado músculo bajo fluorescencia, el músculo de salto tiene una fluorescencia más débil y una forma y textura diferente. Bajo la luz normal, parece casi translúcido, mientras que las HFI son de amarillo opaco y lechoso(Figura 3J-J'',K).
  13. Usando la tensión del agua, capture (pero no agite) las EMM diseccionadas entre un par de fórceps(Figura 3L). Transfiera las HFI a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml precargado con 250 ml de 1x PBS refrigerado(Figura 3M). Proceda inmediatamente con la sección 4.
    NOTA: Cuando las puntas de fórceps se elevan entre sí y se levantan de una solución tampón, la tensión del agua hace que se capture una burbuja de amortiguación entre las puntas de los fórceps. Si las MFI también están presentes en esta burbuja, pueden ser sacadas de la solución y transferidas fácilmente a otro recipiente lleno de tampón. Es importante apretar los fórceps para acercar las puntas entre sí sin tocarse entre sí, para evitar macerar el tejido capturado en la burbuja tampón.

4. Pellet y Conservar la muestra IFM

  1. Pellet las HFI mediante centrifugación del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 3-5 min a 2.000 x g en una centrífuga de mesa(Figura 4A,B).
  2. Retire el búfer con una punta de pipeta (Figura 4C).
  3. Para aplicaciones de ARN, resuspenda el pellet IFM en 50–100 l del búfer de aislamiento de ARN deseado (consulte Tabla de materiales, Figura 4D). De lo contrario, continúe con el paso 4.4.
    NOTA: Las EMM se pueden congelar en seco después del paso 4.2 para preparaciones de espectrometría de masas o aislamiento de ARN con kits comerciales (ver resultados representativos). Para aplicaciones de ARN, se obtienen mejores resultados reemplazando y congelando inmediatamente el pellet IFM en el búfer de aislamiento.
  4. Congele la muestra en hielo seco o congele a presión en nitrógeno líquido (Figura 4E). Conservar a -80oC hasta que esté listo para los pasos posteriores en la preparación de la muestra para el análisis posterior.
    NOTA: Después de la criopreservación, las muestras se pueden almacenar durante varios meses antes de su procesamiento para la investigación posterior.

Resultados

Los protocolos de disección presentados anteriormente son útiles para generar muestras enriquecidas con IFM desde 16 h después de la formación del puparium (APF) hasta la etapa adulta. Las muestras de músculo de vuelo diseccionadas se pueden utilizar para múltiples aplicaciones, y hasta ahora se han aplicado con éxito para RT-PCR4,17, RNA-Seq16,32, ChIP36,37, Western 14,41 y experimentos de espectrometría de masas (ver más abajo). Para ayudar a los usuarios potenciales a disecciónpara aplicaciones basadas en ARN, primero presentamos nuestros resultados destacando consideraciones importantes específicamente para el aislamiento del ARN de las MFI. Para demostrar más ampliamente la utilidad de nuestros protocolos de disección, ilustramos algunas de las posibles aplicaciones de omics utilizando nuestros datos sobre la proteína de unión al ARN Bruno1.

El protocolo de disección IFM produce ARN de alta calidad

Es importante determinar el número de moscas a diseccionar de antemano, ya que se estima que el ARNm de codificación constituye sólo entre el 1 y el 5% del ARN total42. Obtuvimos en promedio 24 x 9 ng de ARN total por mosca de IFM diseccionado a partir de 1 d adultos(Figura 4F y Figura Suplementaria 1A),con rendimientos que normalmente aumentan con experiencia. Este rendimiento de ARN total por mosca es relativamente constante, fluctuando alrededor de 25 ng para IFM diseccionado a 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF y 90 h APF(Figura 4F y Figura Suplementaria 1B,D,E). Estas observaciones también reflejan cualquier ARN aislado de grasa contaminante, tendón, tráquea u otros tipos de células, que pueden ser más altos en muestras aisladas de puntos de tiempo anteriores. Por lo tanto, obtuvimos >1 g de ARN total de IFM de 50 moscas y típicamente diseccionamos IFM de 100 a 150 moscas para generar >3 g de ARN total para muestras de ARN-Seq.

El método de aislamiento de ARN afecta la cantidad y calidad del ARN recuperado, y animamos a los usuarios a validar su enfoque de aislamiento. Por ejemplo, mientras que el aislamiento mediante el método 1 produce en promedio 1143 a 465 ng de ARN total de IFM de 50 1 d moscas adultas, el aislamiento con varios kits comerciales produce en cualquier lugar de 186 a 8 ng a 1261 a 355 ng de ARN total (Figura 4G y Figura suplementaria 1C). Arn aislado de kits comerciales es generalmente de buena calidad(Figura 4H y Figura Suplementaria 1F),pero las bajas recuperaciones sugieren que el ARN puede no ser eluydo eficientemente de las columnas. La integridad del ARN también puede verse comprometida por el uso de un kit como se hace en el método 2(Figura 4H, segunda parcela), probablemente debido a la constitución del búfer y los tratamientos térmicos, lo que conduce a una fragmentación severa que puede afectar los experimentos aguas abajo.

También es importante observar la técnica adecuada libre de RNase al aislar y manipular muestras de ARN. Aunque los ciclos de congelación-descongelación y una incubación de temperatura ambiente de 4 h no afectan dramáticamente los perfiles de integridad del ARN, incluso pequeñas cantidades de RNase conducen a una rápida degradación del ARN(Figura 4I y Métodos Suplementarios). Todavía se alienta a los usuarios a trabajar en hielo y limitar el deshielo de congelación para prevenir la hidrólisis de ARN y la fragmentación. Esto no se detectó aquí, pero la prevención de la contaminación por RNase mediante el uso de puntas de filtro y tampones tratados con DEPC es absolutamente esencial.

La eficiencia de la transcripción inversa también afecta al éxito de las aplicaciones posteriores. Obtuvimos resultados fiables con dos de los tres kits rt comerciales que probamos, que amplifican las bandas RT-PCR fuertes para el gen ribosomal rp49 (Figura 4J). Sin embargo, RT Kit #2 puede ser más sensible para la detección de transcripciones de baja expresión, ya que obtuvimos bandas más fuertes para la proteína de unión al ARN bru1 para las tres réplicas biológicas(Figura 4J). En conjunto, estos resultados ilustran que el ARN de alta calidad se puede aislar de las ECM diseccionadas con este procedimiento.

Los IFM diseccionados producen datos de mRNA-Seq y proteómica de alta calidad

Utilizando IFM diseccionado de acuerdo con el protocolo anterior a 30 h APF, 72 h APF y a partir de moscas adultas 1d, previamente mostramos que la proteína de unión al ARN y CELF1-homologue Bruno1 (Bru1, Arrest, Aret) controla una vía de empalme específica de IFM factor de transcripción Spalt major (Salm)16. Las EMM de mutantes nulos, así como las moscas con bruno1 RNAi específicos del músculo (bru1-IR) muestran defectos de crecimiento sarcomere, mala regulación de la actividad de la miosina y, en última instancia, hipercontracciones y pérdida de fibras musculares16,17 . A continuación demostramos la utilidad de las IfM diseccionadas para espectrometría de masas proteome entera y demostramos que varios de los cambios de expresión que observamos a nivel de ARN también son evidentes a nivel proteico. Destacamos además un evento específico de empalme de desarrollo en Mhc que fue encontrado regulado por Bruno1, ilustrando que mRNA-Seq y RT-PCR de las ECM diseccionadas pueden ser utilizados para demostrar la regulación de eventos de empalme alternativo.

Dependiendo de la calidad y profundidad de la biblioteca, los datos mRNA-Seq se pueden analizar en el nivel de unidades genéticas (promediando el recuento de lectura en todos los exons de un gen), exons individuales o uniones de empalme. Los datos mRNA-Seq de las IFM bru1-IR en comparación con el tipo salvaje muestran cambios débiles en la expresión en el nivel16 de la unidad génica(Figura 5A). A 72 h APF, ya existe una tendencia para genes sarcomeres como la proteína muscular LIM a 60A [Mlp60A], actina 57B [Act57B], proteína específica del músculo 300 kDa [Msp300] o Stretchin-Mlck [Strn-Mlck]) que son importantes para el desarrollo muscular adecuado para ser downregulated inregulated bru1-IR (Figura 5A y Tabla Suplementaria 1). Sin embargo, hemos demostrado anteriormente que a nivel de exons individuales, hay una regulación descendente mucho más fuerte de las isoformas específicas del gen sarcomere16,lo que sugiere que la función principal de Bruno1 es controlar el empalme alternativo(Tabla Suplementaria 1 ).

Utilizando espectrometría de masas de proteome completo en EMM diseccionadas, podemos mostrar una regulación similar en el nivel de proteína(Figura 5B y Tabla Suplementaria 2). De los 1.895 grupos de péptidos detectados, 524 (28%) de ellos están mal regulados en Bru1M2 mutante IFM en 1 d adultos (Tabla Suplementaria 2). También se observa una regulación descendente de la proteína Strn-Mlck y Mlp60A, haciendo coincidir las observaciones a nivel de transcripción en nuestros datos mRNA-Seq. A pesar del número limitado de péptidos de base de datos que se asignan a isoformas de proteínas específicas (ver Métodos Suplementarios para los detalles de análisis), para las proteínas sarcomeres Tropomiosin 1 (Tm1), mantenidas (up/TnT), Mhc, bent (bt/projectin) y Paramyosin (Prm) observar la regulación ascendente de los péptidos de una isoforma y la regulación descendente de otra(Figura 5B),confirmando nuestras observaciones anteriores de regulación similar en el nivel de ARN16. Esto demuestra que las IfM diseccionadas son útiles tanto para aplicaciones de ARNm-Seq como de proteómica.

Como ejemplo más de cómo los datos de omics pueden complementar los enfoques tradicionales para mejorar y ampliar la visión biológica, decidimos centrarnos en el empalme en el C-terminus de Mhc. Se inserta una línea de trampa proteica previamente caracterizada llamada weeP26 en el intrón final de Mhc43,44 (ver Métodos Suplementarios para la ubicación exacta). weeP26 contiene un aceptador de empalme fuerte y se incorpora en presumiblemente todas las transcripciones Mhc (Figura 5C). Sin embargo, la proteína etiquetada GFP en IFM se incorpora en dos "puntos" a cada lado de la línea M, mientras que en el músculo de la pierna, se incorpora uniformemente a través de la línea M y débilmente a través de los filamentos gruesos(Figura 5E). Orfanos y Sparrow mostraron estos "puntos" en forma de IFM debido a un interruptor isoforme Mhc de desarrollo: la isoforma Mhc expresada antes de 48 h APF está etiquetada como el exón weeP26 inserta en el marco de lectura abierto, mientras que el Mhc isoforma expresada después de 48 h APF no está etiquetada, ya que el exón weeP26 se incluye aguas abajo del codón de parada en el 3'-UTR44.

Nuestros datos de mRNA-Seq nos permitieron caracterizar con mayor detalle la expresión isoforme Mhc de C-terminal. Mientras que dos terminaciones Mhc diferentes se han reportado43,44, nuestros datos mRNA-Seq y la anotación actual De la base de vuelo (FB2019_02) sugieren que en realidad hay tres eventos de empalme alternativos posibles en el Mhc C-terminus (Exon 34-35, 34-36, o 34-37)(Figura 5C), que es confirmado por RT-PCR(Figura 5D). weeP26 GFP se inserta en el intrón entre Exon 36 y 37; por lo tanto, como las isoformas Exon 34-35 y Exon 34-36 contienen codones stop, GFP sólo puede traducirse en la isoforma Exon 34-37 (resultando en Exon 34-GFP-37). Además, podríamos ver la regulación temporal y espacial de todas las isoformas Mhc. En IFM, observamos un interruptor isoforme Mhc de Exon 34-37 a Exon 34-35 entre 30 h APF y 48 h APF(Figura 5C,D,F) a 27 oC, aunque esto aún no sea visible por inmunofluorescencia a 48 h APF(Figura 5E). Las patas ya expresan una mezcla de Exon 34-37 y Exon 34-35 a 30 h APF, y por 72 h APF expresan las tres isoformas Mhc (Figura 5D,F). El músculo de salto adulto (TDT) también expresa las tres isoformas de Mhc (Figura 5F),lo que sugiere que esto es generalmente cierto para los músculos somáticos tubulares. Por lo tanto, nuestros datos mRNA-Seq permiten la extensión de hallazgos anteriores al reducir el período de tiempo para el interruptor isoforme Mhc en IFM y caracterizar el uso isoforme de Mhc en músculos tubulares.

A continuación, se examinó la regulación isoforme de Mhc en la IFM mutante de salm y bru1. En ambos casos, vimos una regulación errónea de weeP26. Las LMM mutantes de Salm no pueden completar el interruptor de desarrollo en los patrones de empalme de piernas de isoforma Mhc y fenocopia en etapas posteriores, incluida la ganancia del evento Exon 34-36(Figura 5F). Esto está de acuerdo con los hallazgos anteriores de que la pérdida de Salm resulta en una transformación del destino casi completo de IFM al músculo tubular16. Bru1-IR y bru1 mutant IFM mutante, similar a salm-/- IFM, conserva el evento de empalme Exon 34-37 a través de etapas adultas(Figura 5E,F), dando como resultado un patrón de etiquetado weeP26 GFP que se asemeja al músculo de la pierna, pero no gana el evento Exon 34-36. Esto sugiere que Bruno1 es necesario en IFM para al menos parcialmente controlar el interruptor de desarrollo en el empalme alternativo Mhc, pero indica que los factores de empalme adicionales también están mal regulados en el contexto salm-/-. Además, este ejemplo ilustra cómo los datos RT-PCR y mRNA-Seq de IFM diseccionado pueden ser valiosos para obtener una comprensión más profunda de los mecanismos de empalme del desarrollo y los defectos morfológicos observados.

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Figura 1: Desarrollo y puesta en escena de pusias ifM. (A) Esquema del desarrollo de IFM a 24 h APF, 32 h APF, 48 h APF, 72 h APF, y 1 d adultos que muestran la compactación de los músculos de vuelo (verde) a 32 h APF y el posterior crecimiento de fibra para llenar el tórax. Los tendones están en gris oscuro. (B) Imágenes confocales de IfM fijas de disecciones de libros abiertos (24 h, 32 h, 48 h)19 o hemisecciones del tórax (72 h, 1 día) teñidas para actina (rhodamine phalloidin, magenta) y GFP (verde). (C,D) Imágenes de fluorescencia gFP en pupas vivas que ilustran la morfología IFM intacta de la línea de mosca de la disección en el plano dorsal (C) o lateral (D). Los asteriscos marcan la ubicación de IFM. (E) Para prepararse para las disecciones, las existencias de mosca deben voltearse o las cruces se deben ajustar con 3 a 4 días de antelación. (F) Los prepupae se seleccionan por su color blanco (puntas de flecha amarillas) y se aíslan con un pincel humedecido (F',F''). (G) Las prepupas deben ser sexadas para separar a las hembras de los machos en función de la presencia de testículos que aparecen como bolas translúcidas localizadas posteriormente (asteriscos amarillos). (H) Las pupas envejecidas sobre papel de filtro humedecido en platos de 60 mm. Barras de escala a 100 m (B), 1 cm (C,D,E,H), 1 mm (F,F'',G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Disección de Las MFI antes de 48 h APF. (A) Adición de 1 búfer PBS a una placa de disección negra con una pipeta de transferencia. (B) Transferencia de pupupas escenificadas con un pincel. (C) Bajo un microscopio de disección fluorescente para visualizar GFP, empuje suave de la pupa hasta la parte inferior de una placa de disección utilizando #5 fórceps (esbozado en gris). La "X" en un círculo denota movimiento en la imagen. (D,E) Agarrado de las puas anteriores (D), luego asomando de las puas justo detrás del tórax (E). Dash en un círculo no denota movimiento. (F, G) Tirando con los fórceps anteriores (flecha) para quitar la caja pupal (F), luego la extracción del abdomen (G). (H) Repetición de C-G para varias pupas. Las líneas de puntos amarillas están numeradas que denotan puas contribuyentes. (I, J) Uso de los fórceps (I) para aislar las HFI del tejido circundante (J). Punto en un círculo denota movimiento fuera de la página. (K,L) Eliminación de contaminantes incluyendo grasa y salto (TDT) músculos (K) para generar una muestra de IFM limpia (L). TDT tiene una expresión GFP más baja y una forma diferente a las fibras IFM (K'). (M,N,O) Uso de una punta de pipeta recortada (M) para recoger EMM diseccionadas (N) y su transferencia a un tubo de microcentrífuga (O). Barras de escala a 1 cm (A,B,M,O), 1 mm (C-G), 500 m (H-L,N). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Disección de las MFI después de 48 h APF. (A) Alineación de pupupas en cinta adhesiva doble. (B) Eliminación de pupúas del caso pupal abriendo anteriormente (B), cortando el caso dorsalmente (B') y levantando la pupila (B'»). Los símbolos de círculo representaban lo mismo que la Figura 2. (C) Transferencia de pusias a tampón. (D) Extirpación del abdomen cortando con tijeras (flechas dobles amarillas) y separación de los tórtos (D'). (E, F) Adición de tampón limpio (E), luego corte de torcejes por la mitad longitudinalmente (F,F'). (G, H) Las disecciones se pueden realizar bajo luz blanca (G) o fluorescencia para visualizar el GFP (H); corte de las MFI por un lado (G'), luego el otro lado (G''); levantarse del tórax con fórceps (esbozados en gris) (G'''). (I,J,K) Recolección de HFI en tampón (I) y eliminación del cordón nervioso ventral contaminante (VNC), intestino y músculo de salto (TDT) (J) para generar una muestra de IFM limpia (K). TDT tiene una expresión GFP más baja y una forma diferente a las fibras IFM (J'', K'). (L,M) Uso de fórceps para transferir EII (L) a un tubo de microcentrífuga (M). Barras de escala de 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D',F-L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Detalles de preservación deIFM y aislamiento de ARN. (A) Las MFI se peletizan por centrifugación durante 5 min a 2000 x g. (B) pellet IFM (flecha) y pellet bajo fluorescencia (B'). (C) Eliminación de todo tampón con punta de pipeta. ( D ) Paralaextracción de ARN, resuspensión de pellets en tampón de aislamiento. Este paso se puede omitir a las EMAM diseccionadas por congelación seca. (E) Congelación de la muestra en nitrógeno líquido o en hielo seco y almacenamiento a -80 oC. Barras de escala a 10 cm (A), 1 mm (B,B'), 1 cm (C,D,E). (F) Nanogramas (ng) de ARN total de IFM diseccionado obtenidos por mosca a 16 h DePF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF y 1 d adulto. Barras de error : SD. (G) ARN total aislado de IFM diseccionado a partir de 50 1 d moscas adultas utilizando diferentes métodos de extracción. Barras de error: SD. (H) Seguimientos representativos para probar la integridad del ARN después de diferentes métodos de extracción. Las bandas ribosomales se ejecutan justo por debajo de 2000 nucleótidos (nt) y la banda marcadora a 25 nt. Trazas adicionales disponibles en la Figura Suplementaria 1. (I) Rastros representativos de una muestra de ARN recién aislada (arriba), una muestra congelada 25x sobre hielo seco (segunda gráfica), una muestra que queda durante 4 h en el banco (tercera parcela), y una muestra tratada con RNase A (parcela inferior). Tenga en cuenta la degradación completa del ARN tras la adición del gel RT-PCR RNase A. (J) de los kits etiquetados para bru1 y rp49. La intensidad relativa de la banda bru1 normalizada contra rp49 se traza a continuación. Barras de error: SEM (t-test no emparejado, p a 0,0119). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Aplicación de disecciones IFM para investigar la función Bruno1 en empalme alternativo. (A) Gráfica volcánica de datos mRNA-Seq (unidad genética) de EMM diseccionadas a 72 h DePF. Los genes que están significativamente regulados diferencialmente entre bru1-IR y IFM de tipo salvaje (padj < 0.05, abs(log2FC) >1.5) se muestran en azul, y los genes no significativos en gris. Las proteínas Sarcomere se resaltan en rojo, y se etiquetan genes selectos. (B) La gráfica volcánica de la espectrometría de masas proteome entera resulta de 1 d EMM adultas. Las proteínas significativamente diferentes entre los mutantes bruM2y el tipo silvestre (FDR < 0.05) se muestran en azul, proteínas no significativas en gris. Las proteínas sarcomericas se resaltan en rojo. Los péptidos correspondientes a genes en (A) están etiquetados en rojo. Los conjuntos de péptidos que se asignan a diferentes isoformas de la misma proteína se etiquetan en el mismo color. (C) Esquema del Término C de Mhc que ilustra isoformas de transcripción distintas y ubicación de inserción de la trampa genética weeP26 (ver Métodos Suplementarios para el punto de inserción). Las imprimaciones RT-PCR se indican como líneas negras por encima de las transcripciones. Los recuentos de lectura por kilobase por millón de bases (RPKM) de mRNA-Seq se muestran para las IFM diseccionadas de tipo silvestre a 30 h APF (naranja) y 72 h APF (rojo), de bru1-IR (azul) y salm-/- (cian) a 72 h APF y de pierna entera (verde) a 72 h APF . (D) RT-PCR con imprimaciones contra Mhc que muestren el interruptor isoformente en IFM entre 30 h APF y puntos de tiempo posteriores. El evento de empalme Exon 34-35 sólo se observa débilmente en la IFM mutante bru M3o en la pierna adulta. (E) Imágenes confocales de la localización weeP26 GFP en sarcomeres IFM de tipo salvaje a 48 h APF y 90 h APF en comparación con 90 h APF pierna. Barras de escala a 1 m. (F) Cuantificación de unión de empalme a partir de datos mRNA-Seq para genotipos y puntos de tiempo tal como se etiquetan. Las lecturas de unión se presentan como la relación entre un evento de empalme específico (Exon 34 a 35 en gris, 34 a 36 en púrpura y 34 a 37 en verde) con el número total de eventos que comparten el donante de empalme exón 34. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura suplementaria 1: (A,B,C) el ARN produce a partir de muestras del mismo genotipo diseccionadas por el mismo investigador en la misma semana. Después de diseccionar todas las muestras, el ARN se aisló y se midió el mismo día. (A) Nanogramas (ng) del ARN total obtenido de disecciones IFM por 1 d mosca adulta. Barras de error: SEM. (B) ARN total obtenido de IFM diseccionado por vuelo a 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF y 1 d adulto. (C) ARN total aislado de IFM diseccionado a partir de 50 1 d moscas adultas utilizando diferentes métodos de extracción. (D) Concentraciones totales de ARN por mosca de piernas diseccionadas, músculo de salto (TDT) e IFM. Se obtiene más ARN de las MFI más grandes. Barras de error: SD. (E) Concentraciones totales de ARN por mosca de IFM diseccionadas de controles en comparación con RNAi o muestras mutantes a 30 h de APF, 72 h APF y 1 d adulto. Para los mutantes, w1118 se utilizó como control de tipo salvaje. Los datos mutantes se compilan a partir de bru1-IR, salm-/- y otro mutante de proteína sunión de ARN. Tenga en cuenta que para estas manipulaciones, los rendimientos de ARN se reducen en 1 d adulto debido a la atrofia muscular y la pérdida, por lo que es necesario diseccionar más moscas para obtener cantidades suficientes para los enfoques de omics. Barras de errores - SD. (F) Seguimientos adicionales que muestran la integridad del ARN para los métodos de aislamiento de ARN mostrados en la Figura 4G y en la Figura Suplementaria 1C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Métodos Suplementarios: Una descripción detallada de los métodos y reactivos utilizados en todo el texto y, en particular, para generar los datos mostrados en la Figura 1A-D, Figura 4F-K, Figura 5,Tabla Suplementaria 1y Tabla Complementaria 2. Estos datos motivan el protocolo de disección y demuestran su utilidad para el aislamiento de ARN, mRNA-Seq, RT-PCR y proteómica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Relacionado con la Figura 5 y los párrafos asociados en el texto principal
Nombre de la pestañaResumen de datos
Proteínas SarcomereElife 2018; Aquí enumeramos el FBgn actual y el nombre del gen.
Unidades genéticas SP_DESeq2_72hEmbO Rep 2015, analizamos específicamente los genes sarcomere en los datos de ARNm-Seq a 72 h APF. Esto es del análisis DESeq2 que detecta la expresión diferencial en el nivel de la unidad génica entre el control (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma cruzado a w1118) y Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Las filas resaltadas en amarillo son genes regulados de forma señalitada hacia arriba o hacia abajo (por encima/por debajo de un umbral de log2FC-abs(1.5)). Estos datos son la superposición de puntos rojos en la Figura 5A. Para cada gen sarcomere, proporcionamos información de identificador, el log2FC de DESeq2, el valor P y el valor P ajustado, así como los recuentos de expresiones normalizadas DESeq2.
SP exon_DEXSeq_72hEmbO Rep 2015, analizamos específicamente el uso del gen sarcomere exon en los datos de mRNA-Seq a 72 h APF. Esto es del análisis DEXSeq que detecta el uso diferencial de exón entre el control (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma cruzado a w1118) y Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Las filas resaltadas en amarillo son exons regulados hacia arriba o hacia abajo (por encima/por debajo de un umbral de log2FC-abs(1.5)). Proporcionamos información de exón y identificador de genes, el log2FC de DEXSeq, el valor P y el valor P ajustado, así como una lista de transcripciones asociadas.
Tenga en cuenta que muchos genes muestran la regulación de uno o más exones en el análisis DEXSeq, a menudo con valores de log2FC altos y valores p bajos/ajustan valores P, mientras que una lista limitada de genes muestra cambios a 72 h APF. Esto apoya un fuerte efecto de la pérdida de Bruno en la regulación del empalme alternativo.

Tabla suplementaria 1: Tabla de datos mRNA-Seq de 72 h APF para proteínas sarcomeres que identifican genes expresados diferencialmente (vía DESeq2) y exons (vía DEXSeq) en bru1-IR vs.

Relacionado con la Figura 5B y los párrafos asociados en el texto principal
Nombre de la pestañaResumen de datos
Salida De PerseoSe trata de una hoja de cálculo de datos procesados que presenta los datos de espectrometría de masas utilizados para generar la Figura 5B. Las muestras de IFM son de 1 d de control adulto (w1118) y moscas mutantes (bruno1-M2). Las columnas importantes son los valores de intensidad transformados para cada una de las 4 réplicas para cada muestra, la estadística y la significancia de la prueba t, los identificaciones de péptidos y los nombres de genes correspondientes y los documentos de identidad Flybase. La significancia se calculó utilizando la configuración estándar en Perseo (FDR<.05). Se han detectado 1859 proteínas/péptidos, de los cuales 524 (28%) son significativamente diferentes entre las muestras.
DownregulatedEstas son TODAS las 252 proteínas/péptidos de la salida de Perseus que están regulados en BRUNO1-M2 mutant IFM mutante. Como los ID de Flybase y los nombres de los genes están obsoletos, además proporcionamos el ID de gen Y el nombre genético actuales de Flybase.
UpregulatedEstas son TODAS las 272 proteínas/péptidos de la salida de Perseus que están regulados en BRUNO1-M2 mutant IFM mutante. Como los ID de Flybase y los nombres de los genes están obsoletos, además proporcionamos el ID de gen Y el nombre genético actuales de Flybase.
Tenga en cuenta que las proteínas sarcomere resaltadas en rojo en la Figura 5B están presentes en las listas anteriores. La lista de genes considerados parte del sarcomere está disponible en una de las pestañas de la Tabla Suplementaria 1.

Tabla suplementaria 2: Tabla de datos completos de espectrometría de masas proteome de 1 d adulto que identifican proteínas expresadas diferencialmente e isoformas de proteínas en bruM2mutant es decir. EFI de tipo salvaje.

Discusión

En este protocolo, presentamos la técnica básica para diseccionar las IfM drosofílicas de pupas tempranas y tardías para el aislamiento posterior de proteínas, ADN, ARN u otras macromoléculas. El protocolo se puede adaptar fácilmente para diseccionar IFM de moscas adultas. Demostramos la utilidad de nuestro protocolo de disección para aplicaciones mRNA-Seq, proteómica y RT-PCR. Con la mejora continua de las tecnologías omics para permitir el análisis de muestras con menos material de partida y menores concentraciones de entrada, estas disecciones probablemente se volverán valiosas para muchas aplicaciones adicionales. Como las MFI son un modelo establecido para las miopatías humanas4,24 y desarrollo específico de tipo muscular9,12, imaginamos, por ejemplo, metabolómica enriquecida con IFM, investigaciones de conformación de cromatina a través de 3C o 4C, analizando la evaluación de la red a través de interacciones CLiP o fosfo-proteómica de miofibrillogénesis.

Es importante tener en cuenta que estas disecciones producen una muestra enriquecida para IFM en lugar de una muestra de IFM pura. Esto es inevitable debido a la inervación de la neurona motora, apegos tendinosos y invasión traqueal de las fibras musculares. El análisis bioinformático se puede utilizar para identificar genes o proteínas enriquecidos con IFM, pero se requieren más experimentos para demostrar que en realidad son específicos de IFM. La pureza de la muestra se puede analizar utilizando marcadores específicos de tejido publicados como Stripe45 (tendón), Act79B4,44 (músculo tubular), Act88F15 (IFM) o syb46 (específico neuronal). Puede ser posible utilizar estos marcadores para normalizar conjuntos de datos en el contenido específico de IFM, pero se advierte a los usuarios que los cambios temporales en la expresión de genes utilizados para la normalización, por ejemplo de genes específicos de IFM o tubulina, pueden sesgar tal enfoque.

En los últimos años se han desarrollado métodos de etiquetado específicos de tejidos genéticamente codificados, por ejemplo, el etiquetado CE47,48 o el etiquetado PABP49,50 para el ARN aislante, lo que puede ayudar a obtener una muestra de ARN específico del tejido. Sin embargo, el etiquetado EC requiere una alimentación constante de las moscas47 y, por lo tanto, no es aplicable durante las etapas pupal. La sensibilidad y la integridad de los transcriptomas etiquetados con PABP pueden tener limitaciones51. Los enfoques FACS para aislar las fibras musculares individuales se complican por el gran tamaño y la naturaleza sincitial de las MFI. INTACT52,53 enfoques de estilo se pueden aplicar para aislar compartimentos subcelulares específicos de las MFI, lo que puede resultar útil para aislar poblaciones puras de núcleos o mitocondrias IFM. Las disecciones manuales siguen siendo el estándar actual para obtener tejido IFM intacto para la mayoría de las aplicaciones posteriores.

La calidad de la muestra depende de varios pasos críticos en el proceso de disección. Las disecciones son técnicamente exigentes, con la velocidad de disección y la pureza de la muestra aumentando con la experiencia. La disección durante períodos cortos de tiempo (20-30 min) en tampón refrigerado sin detergente y la congelación inmediata ayuda a preservar la integridad de la muestra, como se ha observado anteriormente para el aislamiento del tendón del ratón54. Las EFI se pueden congelar con éxito después de eliminar todo el tampón del pellet, pero específicamente para el aislamiento de ARN, la congelación de muestras en búfer de aislamiento tiende a producir mejores resultados. Las IfM de hasta 20 disecciones separadas se combinan antes del aislamiento de ARN o proteínas, lo que permite escalar y recolectar suficiente material, incluso desde los primeros horarios o mutantes16,32,para el análisis posterior.

Para las aplicaciones de ARN, el paso más crítico puede ser el aislamiento del propio ARN. Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform isolation (método 1 arriba) supera a la mayoría de los kits comerciales probados y, como se ha señalado anteriormente, es considerablemente menos costoso55. La variabilidad observada en los rendimientos de aislamiento de ARN con kits comerciales está de acuerdo con las observaciones anteriores56,57. Añadimos glucógeno durante la precipitación de isopropanol para ayudar a recuperar todo el ARN. Más allá del rendimiento del ARN, es importante verificar la integridad del ARN para asegurarse de que la muestra no se ha fragmentado o degradado durante los procesos de disección y aislamiento. También es esencial trabajar sin RNase. Por último, la elección del RT-kit puede afectar la sensibilidad del proceso de transcripción inversa. Aunque no se discuten a menudo en detalle, todos estos puntos influyen en la calidad de la muestra IFM y los datos obtenidos de aplicaciones posteriores.

Varias modificaciones importantes diferencian el protocolo de los protocolos de disección IFM existentes. Aunque existe un protocolo de disección detallada para la inmunofluorescencia IFM19,este protocolo presenta un enfoque diferente a las disecciones pupal que permite un aislamiento más rápido del tejido IFM. Esto permite la recolección de grandes cantidades de tejido IFM (relativamente hablando) con tiempos de disección limitados para prevenir cambios de proteome o transcriptoma. Otros protocolos describen la disección de IFM para adultos para visualizar la tinción GFP en miofifines individuales39 o para la tinción de los músculos larvales de la pared del cuerpo58,pero no abordan la disección en etapas pupal o para el aislamiento de ARN o proteína. Este enfoque también es distinto del protocolo existente para la microdisección de las IfM pupal de las criosecciones38,que pueden generar una muestra de IFM más pura pero requiere más mano de obra y produce menos material. En comparación con otros protocolos de disección IFM para adultos rápidos38,39, las EIF se aíslan en el tampón PBS sin detergente para limitar la inducción de tensión y otros cambios importantes en las expresiones.

El avance clave en este protocolo es la inclusión de un reportero fluorescente en vivo, que permite el aislamiento de las EFI en las primeras etapas pupal. Utilizamos estándarme2-GAL459 conduciendo ya sea UAS-CD8::GFP o UAS-GFP::Gma60. Esto permite el etiquetado diferencial de IFM (los músculos de vuelo están más fuertemente etiquetados y con una forma diferente que otros músculos pupales), así como el rendimiento de las manipulaciones basadas en GAL4-UAS, por ejemplo, experimentos de rescate o RNAi. También es posible combinar Mef2-GAL4 con bañera-GAL80ts para evitar la letalidad temprana asociada al ARNi o con UAS-Dcr2 para aumentar la eficiencia de RNAi40.

Hay controladores GAL4 adicionales o líneas GFP disponibles que varían en especificidad de tipo muscular, patrón de expresión temporal y fuerza del controlador19,61 que se pueden utilizar en lugar de Mef2-GAL4. Por ejemplo, Act88F-GAL4 se expresa primero alrededor de 24 h APF, por lo que no se puede utilizar para puntos de tiempo anteriores; sin embargo, etiqueta fuertemente IFM y puede ser útil para evitar la letalidad temprana asociada al ARNi. El-GFP o Act88F-GFP etiqueta IFM, de nuevo con restricciones temporales, pero evitan la dependencia GAL4 de la expresión de marcador y pueden ser útiles en combinación con un fondo mutante de interés. Las listas de otras líneas de marcadores posibles están disponibles19. También debe tenerse en cuenta que el uso de transgenes y el sistema GAL4/UAS puede causar artefactos de expresión génica, por lo que es importante utilizar controles adecuados, por ejemplo, la línea del conductor cruzada a la cepa de fondo de tipo salvaje, de modo que dichos artefactos son presumiblemente lo mismo en todas las muestras.

Con el vídeo adjunto, este protocolo detallado tiene como objetivo hacer que la disección PUpal IFM sea más accesible y promover el uso de enfoques omics para estudiar el desarrollo muscular. El acoplamiento del poder de la genética Drosophila y la biología celular con los ensayos de bioquímica y omics accesibles a través de IFM diseccionado tiene el potencial de avanzar en la comprensión mecanicista de la miogénesis y la función muscular. Estudios futuros que vinculan las observaciones a nivel de sistemas del transcriptoma y la regulación del proteome con los resultados metabólicos y funcionales proporcionarán una comprensión más profunda del desarrollo específico de tipo muscular y la patogénesis de los trastornos musculares.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Andreas Ladurner y Frank Schnorrer el generoso apoyo. Agradecemos a Sandra Esser por su excelente asistencia técnica y a Akanksha Roy por generar los datos de espectrometría de masas. Reconocemos los centros de valores de Bloomington y Viena por proporcionar moscas. Agradecemos a la Bioimagen de Core Facility por su ayuda con la imagen confocal y el Zentrallabor f'r Proteinanalytik para el análisis de muestras de espectrometría de masas, ambos en el Centro Biomédico LMU (Martinsried, DE). Nuestro trabajo contó con el apoyo de la Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), el Centro de Ciencia Integrada de Proteínas de Múnich (CIPSM) en la Ludwig-Maximilians-University de Múnich (MLS), el Frederich-Bauer Stiftung (MLS) y el International Max Max Escuela de Investigación De Planck (ES).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5x Tampón de alta fidelidad (HF)Thermo FisherF518L
Placas de cultivo de 60 mmSigma-AldrichZ643084-600EAPlacas Greiner, 60 mm x 15 mM, ventiladas
Plato de disección negro (vidrio)Augusta Laborbedarf42021010Lymphbecken, vidrio negro, 4 cm x 4 cm
Placas de disección de silicona negra: polvo de carbón activadoSigma-AldrichC9157También disponible en la mayoría de las farmacias
Placas de disección de silicona negra: Sylgard 184Sigma-Aldrich761036Las placas se elaboran mezclando el Sylgard (~50 g) con polvo de carbón activado (200 mg) y curándolo en placas de Petri (~ 4 placas de 60 mm).
Maja azulSigma-AldrichZ359947-100EACualquier mortero de pellets que se pueda esterilizar, también se puede usar con un molinillo accionado por motor
Cámara de teléfono celular, Samsung Galaxy S9SamsungSM-G960F/DSutilizado para fotos no tomadas bajo un microscopio
CloroformoPanReac AppliChemA3691,0500
Microscopio confocal, Leica SP8X confocal verticalLeicawww.leica-microsystems.com
Microscopio confocal, Zeiss LSM 780 confocal invertidoZeisswww.zeiss.com
Cinta adhesiva dobleScotch/3M 3M ID 70005108587Cinta adhesiva de doble cara, disponible en la mayoría de los manipuladores de suministros de oficina
Pinzas Dumont #5Fine Science Tools11252-20Pinza de acero inoxidable de punta recta de 11 cm, grado biológico con punta de 0,05 mm x 0,02 mm
EtOH (100%, RNasa CámaraSigma-Aldrich32205-M
, cámara Leica DFC310 FXfluorescente Leica
, Leica Application Suite (LAS) versión 4.0.0fluorescente Leica
www.leica-microsystems.com, Leica M165 FCLeicawww.leica-microsystems.com
Mosca: Bru1[M2]Culata de mosca; Este papel
Mosca: Bru1[M3]Mosca; Este artículo
Mosca: Mef2-GAL4Bloomington Stock CenterBDSC:27390Culata
mosca: salm[1]Bloomington Stock Center3274Culata
: salm[FRT]Culata mosca; véase Spletter et al., Elife, 2018
Mosca: UAS-Bru1IRViena Centro de Investigación de DrosophilaGD41568Culata de mosca, horquilla de ARNi
Mosca: UAS-GFP::GmaBloomington Stock CenterBDSC:31776Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFPBloomington Stock CenterBDSC:5130Fly stock
Fly: w[1118]Bloomington Stock Center3605Fly stock
Fly: weeP26Fly stock; véase Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-BoosterChromoTekgba488-100
GlycogenInvitrogen10814-010
Software de procesamiento de imágenes, Photoshop CS6Adobewww.adobe.com
IsopropanolSigma-AldrichI9516-25ML2-propanol
Método 1 (aislamiento de ARN): TRIzolLife Technologies15596018Solución monofásica de isotiocianato de guanidinio y fenol
Método 2 (aislamiento de ARN): Método 1 + TURBO Kit sin ADNInvitrogenAM1907Aislamiento de TRIzol seguido de tratamiento con un kit para eliminar el ADN
Método 3 (aislamiento de ARN): Kit de ARN Miniprep Plus de zol directo ZymoResearchR2070SAislamiento de ARN en TRIzol, pero sobre columnas comerciales en lugar de utilizar la separación de fases. Tratamiento recomendado con DNasa realizado con Monarch Dnase I en tampón de reacción de Monarch DNasa I.
Método 4 (aislamiento de ARN): RNeasy Plus Mini KitQiagen74134Utilizamos el tratamiento de DNasa proporcionado. Los gránulos de IFM se homogeneizaron en tampón RTL como se sugiere para tejidos animales.
Método 5 (aislamiento de ARN): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep SystemPromegaZ6110Aplicamos el protocolo para ' Purificación de ARN a partir de tejidos fibrosos'.
Método 6 (aislamiento de ARN): Monarch Total RNA Miniprep KitNew England BiolabsT2010GAplicamos el protocolo para tejidos/leucocitos y lisamos en 300 μ L de reactivo de protección de ARN.
Tubos de microcentrífugaThermo FisherAM12400sin ARNasa Tubos de microfuga, 1,5
mL Portaobjetos de microscopioThermo Fisher12342108 Standard, sin carga, 1 mm
Cuchillas de micrótomoPFM Medical207500003C35 pluma 80 mm
Monarch DNase INew England BiolabsT2004-21
Tampón de reacción Monarch DNasa INuevo England BiolabsT2005-21
Suero de cabra normalThermo Fisher16210072
OneTaq PolymeraseNew England BiolabsM0480X
PincelMarabu19100000000Marabu Fino Round No. 0, o pincel similar de cualquier fuente de arte
ParaformaldehídoSigma-Aldrich158127
tampón PBS (1x)Sigma-AldrichP4417Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato para soluciones de 1 L, pH 7,4
PFA Puntas de pipeta PureTipElemental ScientificES-7000-0101Sustituto opcional de las puntas de pipeta estándar para reducir la pérdida de muestra; 100 mL, orificio de 0,8 mm
Phusion Polimerasa de alta fidelidadThermo FisherF-530XL
Puntas de pipetaSigma-AldrichP5161Pipeta universal de 200 ml Kit
Preomics iST 8xPreomicsP.O.00001Kit de preparación de péptidos para espectrometría de masas
Q Espectrómetro de masas exactivoThermo Fisher725500se realizó en la Unidad de Análisis de Proteínas del Centro Biomédico de la LMU Kit de ensayo de
ARN Qubit LifeTechnologiesQ32855
Rodamina-faloidinaInvitrogen, Sondas Moleculares
Enfoque de concentración de ARN 1 & Trazas de integridad de ARN, BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BA
concentración de ARN Enfoque 2, NanodropThermo FisherND-2000
Concentración de ARN Enfoque 3, Qubit 4 FluorómetroInvitrogenQ33238
ARN Pico ChipsAgilent Technologies5067-1513
ARNasa APromegaA7937
Agua libre de RNasa, pirocarbonato de dietilo (DEPC)Sigma-AldrichD5758DEPC trata el agua durante la noche y luego en autoclave, para eliminar toda la RNasa.
RT Kit #1: Super Script III Kit de transcripción inversaInvitrogen18080-044kit de transcripción inversa
RT Kit #2: LunaScriptNew England BiolabsE3010S
kit RT #3: Kit de transcripción inversa QuantiNovaQiagen205410de transcripción inversa
Búfer de montaje deslizante, VectashieldVector LaboratoriesH-1200que contiene DAPI
Software estadístico: GraphPad PrismGraphPad Prismwww.graphpad.com
Software estadístico: Microscoft ExcelMicrosoftComprado como parte del paquete: Office Home & Estudiante 2019
Centrífuga de sobremesaEppendorf5405000760Centrífuga Eppendorf 5425 o equivalente
Pañuelos de papel/KimwipesSigma-AldrichZ188956Toallitas de papel tisú estándar
Pipetade transferencia Sigma-AldrichZ350796Pipeta de plástico
Triton-X100Sigma-AldrichT9284-500ML
Tijeras de resorteVannasFine Science Tools15000-00Filo de corte de 3 mm, diámetro de la punta 0,05 mm, longitud 8 cm
Papel WhatmanSigma-Aldrich1004-070 Círculos de papel defiltro, Grado 4, 70 mm
Placas de cultivo de microscopio de disección fluorescente Software de microscopio de disección www.leica-microsystems.comMicroscopio de disección mosca La espectrometría de masas 10063052 kit

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