Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

Summary

Este protocolo analiza tanto la formación de la sinapsis inmunológica como el posterior tráfico secretor polarizado posterior hacia la sinapsis inmunológica. Se formaron conjugados celulares entre una célula Raji con pulso de superantígenos (que actúa como una célula que presenta antígenos) y un clon de Jurkat (actuando como un linfocito T auxiliar del efector).

Abstract

El propósito del método es generar una sinapsis inmunológica (IS), un ejemplo de conjugación de célula a célula formada por una célula que presenta antígenos (APC) y una célula de linfocitos T auxiliar es (Th) del efector, y registrar las imágenes correspondientes a las primeras etapas de la Formación de Is y los eventos de tráfico subsiguientes (que ocurren tanto en el APC como en la célula Th). Estos eventos eventualmente conducirán a la secreción polarizada en el EI. En este protocolo, las células Jurkat desafiaron con las células Raji pulsadas por la enterotoxina Staphylococcus E (SEE) como un modelo de sinapsis celular, debido a la cercanía de este sistema experimental a la realidad biológica (conjugados sinápticos Th cell-APC). El enfoque presentado aquí implica la conjugación de célula a célula, la adquisición de lapso de tiempo, la microscopía de fluorescencia de campo ancho (WFFM) seguida de procesamiento de imágenes (desconvolución posterior a la adquisición). Esto mejora la relación señal-ruido (SNR) de las imágenes, mejora la resolución temporal, permite la adquisición sincronizada de varios fluorocromos en conjugados sinápticos emergentes y disminuye el blanqueo de fluorescencia. Además, el protocolo está bien emparejado con los protocolos de fijación de células de punto final (paraformaldehído, acetona o metanol), lo que permitiría una mayor tinción y análisis de inmunofluorescencia. Este protocolo también es compatible con la microscopía confocal de escaneo láser (LSCM) y otras técnicas de microscopía de última generación. Como advertencia principal, sólo los límites de T cell-APC (llamados interfaces IS) que estaban en el ángulo correcto de 90o al plano de enfoque a lo largo del eje Z podrían ser correctamente imágenes y analizados. Existen otros modelos experimentales que simplifican la creación de imágenes en la dimensión Z y los siguientes análisis de imágenes, pero estos enfoques no emulan la superficie compleja e irregular de un APC, y pueden promover interacciones no fisiológicas en el IS. Por lo tanto, el enfoque experimental utilizado aquí es adecuado para reproducir y confrontar algunas complejidades biológicas que ocurren en el EI.

Introduction

El objetivo principal del método es generar conjugados de célula a célula de sinapsis inmunológica (IS) formados por una célula que presenta antígenos (APC) pulsada con superanógenos SEE y una célula Th efector, y registrar las imágenes correspondientes a las primeras etapas de la formación de sinapsis inmunológicas y los posteriores eventos de tráfico (que ocurren tanto en la APC como en la célula Th), que finalmente conducirán a la secreción polarizada en el IS. El establecimiento del IS por linfocitos T tras la unión de su receptor celular (TCR) a antígenos unidos a MHC-II en el APC organiza una instancia extremadamente dinámica, maleable y crítica implicada en las^respuestasinmunitarias específicas, humorales y celulares^1,2. El IS se define por la formación de un patrón especial de complejo de activación supramolecular (SMAC) caracterizado por un proceso de reorganización de actina³. Tras la construcción de EI por linfocitos T con un APC, la polarización de las vesículas secretoras hacia el EI parece estar implicada en la secreción polarizada en la brecha sináptica. Esta maquinaria enfocada parece suministrar inequívocamente al sistema inmunitario una estratagema magníficamente regulada para mejorar la eficacia de las funciones de los efectores secretores críticos de los linfocitos T, al tiempo que reduce la estimulación inespecífica y arbitrada de citoquinas de células transeúntes, la muerte de células diana irrelevantes y el suicidio apoptótico a través de la muerte celular inducida por activación (AICD)⁴.

La consecuencia del IS varía en la naturaleza tanto del linfocito T como del APC. El contacto sináptico de las células Th (típicamente células CD4+) con el APC que muestra antígeno asociado a MHC-II produce la activación de la célula T (secreción de citoquinas, proliferación, etc.) y, en algunos casos, apoptosis a través de AICD⁴. Para los linfocitos T citotóxicos (CTL) (principalmente células CD8+) que interactúan con APC presentando antígeno asociado a MHC-I, el resultado difiere en la preestimulación o no de los CTL con antígeno. Por lo tanto, los CTL ingenuos que identifican los complejos de antígeno-MHC-I en el APC están "preparados" para destruir las células diana y dividirlas. Los CTL de primed también establecen sinapsis con células diana (es decir, células infectadas por virus o células tumorales) produciendo exterminio celular específico de antígeno^{sinfines 5,6}.

La secreción polarizada de exosomas en la sinapsis inmunológica es un área de investigación en desarrollo y desafiante implicada en las respuestas inmunitarias relevantes⁷. Se ha demostrado que los cuerpos multivesiculares (MVB) que transportan vesículas intraluminales (ILV) experimentan transporte polarizado hacia el IS^8,9 (Video 1) con la estimulación TCR con antígeno. La fusión de estos MVB en la membrana sináptica induce su degranulación y la liberación de los ILVs como exosomas a la hendidura sináptica^8,10. Esto ocurre en el IS formado por células Jurkat de tipo Th que fueron desafiadas con células Raji recubiertas de superantígenos que actúan como APC^11,CD4⁺ linfoblastos estimuladas por TCR, y CTL cebados. Por lo tanto, las sinapsis hechas por las células de Jurkat constituyen un modelo valioso para estudiar el tráfico secretor polarizado de exosomas. Además, varias décadas de investigación han demostrado que muchos conocimientos fundamentales sobre la señalización TCR provienen de estudios con líneas de células T transformadas, y de hecho el más conocido de estos sistemas de modelos es la línea¹²de células T leucémicas Jurkat.

La formación de un IS completamente desarrollado produce varios resultados biológicos cruciales, incluyendo la activación de células Th, la activación de CTL ingenuos o la matanza de células diana por CTL cebados, aparte de la anergy o AICD⁵. Por lo tanto, hay dos tipos principales de secretor IS establecidos por linfocitos T que resultan en funciones muy diversas, pero igualmente críticas, efector inmune^1,6,13. Por un lado, el IS de linfocitos T citotóxicos cebados (CTL) induce la polarización rápida (que va de segundos a pocos minutos) de gránulos líticos (llamados "lisosomas secretores") hacia el EI. La degranulación de los gránulos líticos induce la secreción de perforina y granzimas a la hendidura sináptica^14,que son moléculas pro-apopóticas. La perforina secreta y los granzimas posteriormente inducen la matanza de las células objetivo^15,16. Las CTL desarrollan sinapsis temporales, que duran sólo unos minutos, ya que las células objetivo son asesinadas^3,17. Esto es probablemente debido a la circunstancia de que la tarea óptima CTL requiere un contacto rápido y temporal para distribuir tantos golpes letales como sea posible a numerosas células objetivo^3,17. Por el contrario, los linfocitos Th como las células jurkat generan IS estable y de larga data (de 10-30 min hasta horas), ya que esto parece ser necesario tanto para la secreción direccional como incesante de citoquinas estimulantes^3,17. Las citoquinas también están encerradas en vesículas secretoras y algunas de ellas (es decir, IL-2, IFN-o) experimentan transporte polarizado al IS¹⁷ y la secreción. Una característica esencial del IS es la formación de contactos exploratorios, débiles y transitorios entre la célula T y el APC (Video 1) que pueden producir una interacción más fuerte y el establecimiento de un IS maduro, siempre que el TCR identifique los complejos de antígeno-MHC cognado y que se establezcan conexiones coestimulantes apropiadas⁵. Tanto el inicio de los contactos iniciales como la fundación de un IS maduro y totalmente productivo, son procesos inherentemente estocásticos, rápidos y asincrónicos^5,18. Además, hay una frecuencia escasa en la creación de conjugados de célula a célula^19,lo que puede constituir un desafío para las técnicas de diagnóstico por imágenes (consulte las secciones Resultados y Discusión).

Otro desafío principal en el examen de la polarización del centro organizador de microtúbulos (MTOC) y gránulos secretores en linfocitos T es que todo el proceso es rápido (segundos a pocos minutos), particularmente en los CTL. Teniendo en cuenta estos hechos, la mayoría de los enfoques tempranos se enfrentaron a una estrategia de punto final en la que las células APC/target y los linfocitos T se mezclan conjuntamente y convergen por centrifugación a baja velocidad, para favorecer la creación conjugada de célula a célula, incubada durante varios minutos, fija y posteriormente evaluada para el reubicación de MTOC y/o vesículas secretoras hacia el IS²⁰. Este enfoque tiene dos limitaciones significativas: no se lograron datos animados sobre el tráfico y se obtuvieron altos niveles de polarización de MTOC/gránulos secretores de fondo, probablemente debido al carácter estocástico del establecimiento^{IS 18.} Además, cualquier correlación entre los eventos de señalización inicial estimulados por TCR (es decir, aumentos de calcio intracelular, reorganización de actinas) y polarización de vesículas secretas es problemática de investigar. Por lo tanto, las disposiciones imperativas para la toma de imágenes apropiadas del IS en las células vivas se combinan para mejorar la materialización conjugada de célula a célula, para sincronizar la generación del IS y, cuando sea posible, para garantizar el establecimiento de conjugados celulares en campos XY de microscopio definidos y posiciones Z. Se han desarrollado varias estrategias para evitar todos estos problemas. Está fuera del alcance de este documento explicar estos métodos, sus beneficios y debilidades. Consulte las reseñas publicadas anteriormente que abordan estos puntos importantes^1,4,5,21.

El hecho de que los linfocitos Th son de larga duración, y la circunstancia de que en los linfocitos Th el MTOC, gránulos secretores que contienen linfina y MVB tardan desde varios minutos hasta horas para moverse y acoplarse al IS²² hace que el Th-APC IS sea un candidato ideal para la toma de imágenes utilizando el protocolo descrito aquí.

Protocol

1. Preparación de diapositivas para adherir células Raji

1. Añadir 150 l de fibronectina (100 g/ml) por pocto a un portaobjetos de cámara de 8 micropozos (diapositiva de cámara de fondo plástico) e incubarlo durante 30 minutos a 1 h a 37 oC. Este sustrato de adhesión permitirá la unión de células Raji al fondo del pozo (Paso 2), la formación de conjugados vivos con células Jurkat (Paso 4) células, y captura de microscopía de lapso de tiempo (paso 6), y también es compatible después con la fijación opcional paraformaldehído (PFA) (paso 7).
   NOTA: Para la fijación de la acetona, utilice portaobjetos de cámara inferior de vidrio y poli-L-lisina (20 g/ml) en lugar de fibronectina, ya que la acetona disuelve el plástico. La corredera de cámara de 8 micropozos (1 cm² pozos, 300 ml de volumen máximo) o equivalente es un formato flexible y adecuado.
2. Aspirar la fibronectina con una pipeta automática de 200 ml y lavar cada pocaculo con 200 ml de PBS durante 2 min con un suave temblor. Repita este lavado una vez más. El portaobjetos de la cámara se puede almacenar en esta etapa con PBS durante 1-2 semanas a 4 oC.

2. Adhesión de las células Raji a los portaobjetos de cámara y etiquetado 7-amino-4-clorometilcoumarina (CMAC)

1. Transfiera 10 ml de un precultivo de 10 x 10⁶ células/ml de células Raji a un tubo inferior en V de 15 ml. Mezclar bien y utilizar 10 l para contar las células en la cámara Neubauer o equivalente.
2. Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspira y descarta el sobrenadante.
3. Resuspenda suavemente el pellet celular en un medio de cultivo completo cálido (RPMI 1640 complementado con 10% FCS, 2 mM de glutamina, 10 mM DE HEPES, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina) a una concentración de 10⁶ células/ml. Utilice la ecuación que se indica a continuación:
   ([ ]_{inicial x} V_inicial á [ ]_final x V_final), donde [ ]_inicial representa la concentración inicial de la célula, V_inicial - volumen inicial de la suspensión de la célula, [ ]_final - concentración final de la célula, V_final - volumen final de la suspensión de la célula.
   NOTA: Dependiendo de la concentración celular del cultivo inicial, es posible recoger más células de las necesarias, pero es importante mantener las células restantes en el cultivo (37 oC) hasta el final del experimento para evitar posibles problemas (ver Paso 2.6).
4. Etiquetar las células Raji para permitir su identificación durante la formación de conjugado sináptico. En este experimento, 7-amino-4-clorometilcoumarina (CMAC) etiquetado se realiza en el paso 2.4.2.
   1. Transfiera el número requerido de células Raji en el medio de cultivo a un tubo de 2 ml. Para el portaobjetos de cámara de 8 micropozos, se necesita un total de 1,6 ml de la suspensión celular (200 ml por poca).
   2. Añadir CMAC a una concentración final de 10 m. Mantenga las células en la oscuridad cubriendo el tubo con papel de aluminio ya que CMAC es sensible a la luz. Se necesitan 200 l que contengan 2 x 10⁵ células Raji por 1 cm² de pozo. Por lo tanto, si es necesario preparar 8 pozos, se requieren 1.6 x 10⁶ celdas Raji.
      NOTA: El etiquetado de células Raji con azul rastreador de células (CMAC, excitación UV y emisión azul) las distingue de las células Th cuando se forman los conjugados sinápticos. Este tinte es compatible con los fijadores de PFA y acetona y permite procedimientos de inmunofluorescencia adicionales. Trate de evitar la exposición ligera. El etiquetado de las células Raji en una piscina con CMAC seguido de la resuspensión antes de la adhesión de las células Raji a los portaobjetos recubiertos de fibronectina asegura el etiquetado homogéneo de las células Raji con CMAC entre diferentes pozos.
5. Resuspenda las células teñidas con CMAC y, después de la aspiración del PBS en la corredera de la cámara del paso 1.2., transfiera 200 l de la suspensión celular a cada pocal de los portaobjetos recubiertos con fibronectina preparados en el paso 1.1-1.2. Incubar el portaobjetos de la cámara a 37oC, 5%_CO2 durante 30 min-1 h.
   NOTA: La adhesión y el etiquetado CMAC se producirán simultáneamente en este paso y esto ahorra tiempo. Tenga en cuenta que las células Raji se sedimentarán rápidamente y se debe tener precaución para mantener una concentración homogénea en la suspensión celular antes de la sembrada. No es necesario lavar cMAC en esta etapa por centrifugación, ya que el lavado CMAC se realizará más fácilmente en el paso 2.7 (cuando las células Raji etiquetadas ya están adheridas a los portaobjetos de la cámara). Dado que la CMAC está presente en la suspensión celular en exceso grande, el fondo de fluorescencia azul es demasiado alto para distinguir las células teñidas de azul. Compruebe la fluorescencia CMAC de la célula en el paso 2.7 después del lavado de CMAC.
6. Asegúrese de que las células Raji se adhieren a la parte inferior de los pozos mediante un suave temblor de las diapositivas de la cámara en el microscopio. Asegúrese de que las celdas muestren huecos entre sí y no sean confluentes(Figura 1,panel central). 50-60% de la confluencia celular es apropiado.
   1. Si la mayoría de las células se adhieren eficientemente a la corredera de la cámara y no se observan huecos de celda, lave cada una con un medio caliente y completo y resuspenda el medio con un pipeta automático de 200 ol para separar el exceso celular. Compruebe la confluencia después de cada paso de resuspensión.
   2. Si las células no se adhieren, repita el paso de adhesión de nuevo y aumente el tiempo de adhesión y/o el número de celda.
      NOTA: Es posible parar aquí, incubar el tobogán de la cámara a 37 oC, 5% CO₂ durante la noche (O/N), y continuar con el protocolo al día siguiente. Confirme al día siguiente que las células Raji permanecen adheridas y etiquetadas con CMAC mediante microscopía de fluorescencia.
7. Lave cada poca de nuevo cuidadosamente con RPMI suplementada en caliente para eliminar el exceso de CMAC y comprobar la emisión azul con el microscopio de fluorescencia (Figura 1).
   NOTA: Para evitar el uso de aceite de inmersión (pegajoso y viscoso) y objetivos de aceite de apertura numérica alta, los objetivos de distancia extralarga (es decir, 20x o 40x) se pueden utilizar para comprobar rápidamente el etiquetado CMAC utilizando el microscopio de fluorescencia.

3. Pulso de CMAC — Células Raji etiquetadas con Enterotoxina Estafilocócica E

1. Añadir enterotoxina estafilocócica E (SEE, 1 g/ml) a cada pocto. SEE se puede diluir convenientemente en el medio de cultivo celular (solución de trabajo a 100 g/ml) de las existencias congeladas SEE (1 mg/ml en PBS). Utilice 2 l de la solución de trabajo de 100x por cada micropozo de 200 ml.
   PRECAUCION: Use guantes para este paso y deseche la punta usada en la caja de riesgo biológico.
2. Incubar el tobogán de la cámara a 37oC, 5% CO₂ durante al menos 30 min. El efecto SEE dura al menos 3-4 h.
   NOTA: SEE se puede agregar a los pozos en diferentes puntos de tiempo cuando sea necesario, si se planifican configuraciones de lapso de tiempo distintas (paso 5) y/o dependiendo del punto de tiempo de inicio para los experimentos de punto final (paso 6).

4. Preparación de células Jurkat

1. Utilice un cultivo de células Jurkat en crecimiento anterior (1-2 x 10⁶ células/ml) para este experimento. Utilice células de un matraz de cultivo estándar o de un transfecto anterior siguiendo los protocolos de electroporación estándar, como se describió anteriormente²³. La transfección de las células de Jurkat permitirá la visualización del lapso de tiempo del tráfico de gránulos secretores en células vivas. Por ejemplo, cuando se expresa GFP-CD63 (un marcador de MVB), se puede grabar el movimiento de las vesículas decoradas por GFP-CD63 (Video 1).
2. Observe las células bajo un microscopio de contraste de fase. Si un exceso de células muertas (>20-30%) se observan, realizar centrifugación de gradiente de densidad Decoll utilizando los protocolos estándar^24,para eliminar el exceso de células muertas (las células muertas presentan mayor densidad que las células muertas) antes de su uso (ver Discusión).
3. Transfiera las células a un tubo de 15 ml, tubo inferior en V y utilice 10 ml para contar con hemocitómetro.
4. Centrifugar las celdas restantes como se describe en el paso 2.2. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células a la misma concentración que las células Raji (1 x 10⁶/mL) utilizando un medio de cultivo fresco y cálido. Siga los pasos 2.2-2.3.
5. Mantener las células Jurkat en cultivo (37 oC, 5% CO₂) mientras espera el paso 4.
   NOTA: En la segunda opción (transfección), el número de células vivas va a ser mucho menor que en la primera. Por lo tanto, considere el uso de un volumen de cultivo de celda inicial más alto para tener suficientes celdas para el experimento. De 10 x 10⁶ células Jurkat por cubeta de electroporación y transfección, sólo 2-4 x 10⁶ células Jurkat sobrevivirán después de 48 h de transfección y algunas de estas células se perderán durante el paso Ficoll. Por lo tanto, una cubeta de electroporación es generalmente suficiente para desafiar las células Raji adheridas con pulso SEE de 8 micro pozos (1.6 x 10⁶ células Jurkat transinfectadas necesarias).

5. Co-sembrado de Raji y Jurkat Cells

1. Saque las diapositivas de la cámara que contienen las células Raji adheridas con la etiqueta CMAC y las células Raji adheridas del paso 3.2. No es necesario lavar el CMAC en esta etapa ya que esto se hizo previamente en el paso 2.7.
2. Aspirar cuidadosamente el medio de cultivo de cada poca, uno por uno, de una esquina del pozo utilizando una pipeta automática de 200 ml. No deje que el medio en el pozo se seque por completo.
3. Sustituya inmediatamente el medio por 200 ml de células Jurkat resuspendidas en el medio de cultivo celular (1 x 10⁶/mL) preparado en el paso 4.5. Si se realizan imágenes de lapso de tiempo, vaya al paso 6 inmediatamente después de este paso, ya que las células de Jurkat tienden a sedimentar y formar conjugados sinápticos muy rápidamente. Para mayor comodidad, los micropozos que contienen células Raji adheridas con pulso SEE que no reciben sembrado con células Jurkat en esta etapa deben mantenerse con medio de cultivo celular hasta el desafío posterior con las células Jurkat. Esto permitirá de manera flexible el desafío posterior con las células Jurkat para enfoques experimentales de lapso de tiempo adicional o cinéticos inversos.
4. Si se va a realizar un lapso de tiempo, proceda rápidamente al paso 6. Esto implica el cocultivo durante 1-2 h en la incubadora de etapa del microscopio o equivalente a 37 oC, 5% CO₂ para permitir la formación conjugada sináptica y la adquisición simultánea de imágenes. Si se prevé el análisis de punto final, pero sin lapso de tiempo, se prevé la formación de conjugados de comprobación después del período de cocultivo utilizando el microscopio (como en la Figura 1) antes de fijar las células (paso 7).

6. Imágenes de lapso de tiempo de conjugados sinápticos emergentes

1. Prepare el microscopio y la cámara de incubación antes de la toma de imágenes. Para el ejemplo que se muestra en el vídeo 1, los ajustes detallados de la microscopía se muestran en la figura 2.
   NOTA: Si se planifica un experimento de lapso de tiempo, todos los ajustes y complementos del microscopio (cámara de cultivo celular ambiente, etc.) deben prepararse antes de agregar la suspensión Jurkat a la corredera de la cámara con células Raji adheridas. Se describen los siguientes pasos para un microscopio comercial (Tabla de materiales). Sin embargo, se puede utilizar cualquier microscopio de fluorescencia invertido equipado con una incubadora de cultivo celular.
   1. Utilice un microscopio con una inmersión en aceite de 60x, alta apertura numérica cuando se imagina el tráfico polarizado.
   2. Asegúrese de que el sistema de enfoque automático esté activado y ajuste el desplazamiento para enfocar las celdas Raji enlazadas a la superficie inferior. Consulte la Figura 1, Vídeo 1 y Vídeo 2.
2. Después de la adición de Jurkat a cada pozo que contiene las células Raji adheridas en el paso 5.3, localice rápidamente la corredera de la cámara de micropozo en la incubadora de etapa del microscopio precalentada (1-2 h) (es decir, OKOlab) y seleccione algunas posiciones XY con el microscopio, campos en los que se encuentra probable que registre una formación emergente de EI hecha por, por ejemplo, una célula transtrótica por Jurkat que cae en el foco del microscopio.
3. Utilice una incubadora de etapa de microscopio precalentada ya que se observó que una etapa estabilizada por temperatura mantiene posiciones Estables X,Y,Z. Los criterios para un campo XY conveniente son: células Raji bien enfocadas y no confluentes (es decir, mostrando huecos entre las células) y la presencia de células Jurkat transinfectadas (esto se puede comprobar combinando transmitancia y canales UV o GFP). Las células de Jurkat se sedimentarán muy rápidamente (pocos minutos) en el tobogán de la cámara, y las posibilidades de tomar imágenes de las sinapsis emergentes disminuirán con el tiempo(Figura 1). Es posible terminar el experimento después del lapso de tiempo definido o proceder al Paso 7 y fijar los conjugados para la posterior inmunofluorescencia y análisis.
   NOTA: Es posible seleccionar hasta 16 campos de microscopio diferentes de hasta 4 micropozos diferentes para la adquisición simultánea de lapso de tiempo multipozo con la resolución temporal adecuada (1-2 min por fotograma). La limitación se basa tanto en el número como en la intensidad (que afecta a la exposición de la cámara) de los diversos fluorocromos a tomar imágenes (dependiendo del número de proteínas fluorescentes expresadas, aparte de CMAC). Una manera de aumentar la velocidad de fotogramas es la grabación para el canal CMAC en solo uno de cada "n" marcos de tiempo para GFP (es decir, n x 8, como se muestra en la Figura 2),ya que las células Raji se adhieren al fondo del pozo y no se mueven fácilmente como celdas Jurkat. Además, esto beneficia la viabilidad celular, ya que la exposición frecuente a la luz UV puede dañar las células. Intente ajustar la velocidad de fotogramas de tiempo a 1 fotograma cada 1 minuto o menos (es decir, 20 s por fotograma en Video 1, Figura 2) ya que la polarización de MVB tarda unos minutos en horas en completarse. Un microscopio equipado con una torreta de epifluorescencia motorizada y filtros de fluorescencia de paso de banda apropiados o equivalentes son necesarios para realizar esta captura multicanal.

7. Formación de punto final de conjugados sinápticos y fijación

1. Si sólo se planifica un experimento de punto final (1-2 horas de incubación para permitir la formación conjugada sináptica es apropiado), incubar el tobogán de la cámara a 37 oC, 5% CO₂ para 1-2 h. Compruebe la formación de conjugados después del período de cultivo (como en la Figura 1) y, posteriormente, fije los conjugados con acetona o PFA (la fijación dependerá de los antigens y anticuerpos que se utilizarán en la posterior En este caso, la incubación no requiere una incubadora de etapa de microscopio. Consulte el vídeo 3 para obtener un ejemplo.
2. Para fijar las células, lave el pozo agitando suavemente con un medio de RPMI caliente (37 oC) sin FCS (la albúmina del suero puede precipitarse con la fijación de la acetona). Aspira y añade 200 s de PFA o acetona pre-enfriada a cada pocal. Incubar el tobogán de la cámara a temperatura ambiente (RT) o sobre hielo, respectivamente, durante 20 minutos.
   NOTA: Para la fijación de la acetona, enfríe previamente la acetona a -20 oC y enfríe previamente el deslizamiento de la cámara a 4 oC. Retire las tapas de plástico cuando se utilice acetona para fijar las células cultivadas en las 8 diapositivas de la cámara inferior de vidrio del pozo.
3. Lavar cada pocato dos veces con PBS y añadir 200 l de solución de temple (PBS, 50 mM NH₄Cl). Incubar el tobogán de la cámara a 4oC.
   NOTA: En esta etapa, el portaobjetos de la cámara puede permanecer al menos un mes a 4 oC antes de realizar el protocolo de inmunofluorescencia, como se describe⁸. La tapa evita la evaporación.

8. Procesamiento de imágenes

1. Realizar desconvolución de imagen posterior a la adquisición (es decir, desconvolución de Huygens o equivalente, Tabla de materiales)de series de lapso de tiempo y/o fotos fijas de celdas fijas. Desconvolución mediante el empleo de un software adecuado (es decir, utilizando la opción óptica de "campo ancho" en Huygens) y los parámetros ópticos correctos. La desconvolución requiere el procesamiento de imágenes de la función de dispersión de punto medido (PSF) del microscopio^4.
2. Alternativamente, utilice el software para calcular el PSF idealizado mediante la carga automática de los parámetros ópticos incluidos entre los metadatos de los archivos del microscopio. Estos parámetros ópticos comprenden la longitud de onda fluorocromo, el índice de refracción, la apertura numérica del objetivo y la técnica de imagen (confocal, de campo ancho, etc.) ⁴.
3. Posteriormente, el software de imágenes utiliza el PSF y diversos algoritmos de desconvolución (es decir, QMLE y CMLE en el software Huygens) en un proceso de cálculo acumulativo paso a paso, cuyos resultados que se pueden visualizar y detener continuamente (o reanudar) cuando lo requiera el usuario. En esta etapa el usuario puede cambiar el número de convoluciones y/o la relación señal-ruido y reanudar la desconvolución. El software de desconvolución funciona bien con series de lapso de tiempo (X,Y,T) (Video 2) y pilas Z (X,Y,Z) (Video 3). Los canales desconvenedos se fusionaron posteriormente con el Canal CMAC, crudo, ya que los fluorocromos difusos citosólicos no mejoran por desconvolución^4,9.

Results

Hemos seguido el protocolo descrito con el fin de generar conjugados de sinapsis inmune Jurkat-Raji e imagen adecuada de las primeras etapas de la formación de EI. Nuestro objetivo era mejorar los primeros acercamientos²⁰ previamente seguidos para estudiar la polarización del MTOC y la maquinaria secretoras hacia el EI. Estos enfoques se basaron en una estrategia de punto final que no permitía la toma de imágenes de la formación de IS o los primeros eventos sinápticos, ya que en estas estrategias la formación de IS se produjo obligatoriamente en el pellet de células mixtas centrifugadas, pero no en un microscopio. Nuestro protocolo fue diseñado para evitar esta advertencia principal, ya que el enfoque se basó en el uso de una concentración celular apropiada (Pasos 2 y 3), para favorecer la formación de los conjugados IS de célula a célula en los propios portaobjetos de cámara de microscopio (8 diapositivas de cámara micro pozo), montados en la incubadora de etapa sin microscopio precalentada (en el paso 4). Esta estrategia induce la formación de IS, simultáneamente a la captura de imágenes de lapso de tiempo (Video 1).

La Figura 1 representa los conjugados sinápticos de Jurkat-Raji que se obtuvieron siguiendo el protocolo (paso 5.2). La imagen representa el primer fotograma de un experimento representativo de lapso de tiempo. 2 x 10⁵ células Raji y 2 x 10⁵ células Jurkat se añadieron a un pozo de 1 cm^2. El panel superior muestra el canal de transmisión, el panel central consta de canal CMAC (azul) (células Raji), y el panel inferior muestra tanto la transmisión más los canales combinados CMAC. Las flechas amarillas etiquetan algunos conjugados sinápticos, como referencia, mientras que las flechas verdes indican conjugados sinápticos hechos por una célula de Jurkat y varias células Raji (conjugados complejos). Disminuir las concentraciones celulares (10⁵ o menos células en el pozo de 1 cm²⁾ eludirá la formación de conjugados celulares complejos, pero puede que no haya suficientes conjugados celulares para el análisis posterior del tráfico polarizado (ver más abajo), que a su vez disminuirá también las posibilidades de encontrar y de imaginar conjugados sinápticos emergentes.

La Figura 2 representa capturas de pantalla correspondientes a los parámetros de imagen utilizados para la captura simultánea de los dos fluorocromos diferentes (CMAC y GFP-CD63) utilizando el software adecuado (es decir, NIKON NIS_AR) en un experimento representativo de lapso de tiempo correspondiente al vídeo 1.

El video 1 (Sinapsis inmunológicas, crudas) representa un linfocito T Jurkat que expresa GFP-CD63 (un marcador de cuerpos multivesiculares-MVB, vesículas verdes) y la formación de una doble sinapsis entre 1 célula Jurkat y 2 células Raji etiquetadas con CMAC, en azul (una de ellas sufre engullido). Se registró el movimiento simultáneo de MVB dentro de la célula Jurkat hacia las áreas de sinapsis (velocidad de fotogramas de captura de 1 fotograma cada 20 segundos para GFP-CD63; velocidad de reproducción de vídeo de 2 fotogramas por s). Los conjugados sinápticos fueron obtenidos e representados siguiendo el protocolo descrito anteriormente (Paso 6.2), que permitía la toma de imágenes de sinapsis emergentes (Video 1). La captura simultánea de los canales de fluorescencia GFP-CD63 y CMAC se realizó utilizando un software adecuado (es decir, NIS-AR, Tabla de materiales). El vídeo representa los datos sin procesar de un experimento representativo de lapso de tiempo. El sistema de enfoque automático se definió con un desplazamiento adecuado con respecto a las células Raji unidas al fondo de vidrio, para asegurar un enfoque estable a lo largo del experimento.

El vídeo 2 (sinapsis inmunológicas, después de la desconvolución) corresponde al vídeo 1, pero la desconvolución de las imágenes del canal de fluorescencia GFP-CD63 se realizó empleando un software de desconvolución adecuado (es decir, Huygens), utilizando la opción óptica de "campo ancho" y los parámetros ópticos adecuados (paso 8). Este canal desconvoluted se fusionó posteriormente con el Canal CMAC, raw. La mejora tanto de la relación señal-ruido como de la nitidez de la imagen es evidente. La desconvolución se realizó después de la adquisición, como se describió anteriormente. Para obtener detalles específicos sobre el software de desconvolución, consulte⁴.

El vídeo 3 (sinapsis inmunológica, después de la fijación y la tinción de inmunofluorescencia) representa una pila Z (tamaño del paso z a 0,8 m, 5 fotogramas) de un conjugado IS fijo después del paso 6 del protocolo (fijación de acetona). Después de la fijación, la inmunofluorescencia se realizó siguiendo los protocolos estándar²⁵ mediante el uso de Phalloidin para visualizar la F-actina (verde), anti-CD63 para visualizar MVB (magenta), anti-tubulina para visualizar MTOC (rojo). CMAC (azul) etiqueta la celda Raji. Posteriormente, el conjugado fue fotodo por epifluorescencia y varios canales desconvolucionados utilizando la opción óptica de "campo ancho" y los parámetros ópticos adecuados (paso 7). Los canales desconvenededos se fusionaron posteriormente con el canal BMAC, sin formato, como se indica en los diferentes paneles (CMAC más Transmitance-TRANS, CMAC más Phallodin, CMAC más anti-CD63 y CMAC más anti--tubulina, respectivamente). La flecha blanca etiqueta la sinapsis, mientras que la flecha verde etiqueta el MVB y la flecha amarilla etiqueta el MTOC. La cuantificación detallada de la polarización MVB y MTOC se ha explicado en otros lugares^25.

El enfoque presentado aquí implica la formación de conjugados de célula a célula y, simultáneamente, la adquisición de lapso de tiempo mediante microscopía de fluorescencia de campo ancho (WFFM) seguida de procesamiento de imágenes (desconvolución posterior a la adquisición). Esta táctica mejoró la relación señal-ruido (SNR) de las imágenes, mejoró su resolución temporal y permitió la adquisición sincronizada de varios fluorocromos en conjugados sinápticos emergentes⁴. Además, el protocolo está bien emparejado con los métodos de fijación de células de punto final subsiguientes (paraformaldehído, acetona o metanol), lo que permitiría una mayor tinción de inmunofluorescencia y análisis²⁵ (Video 3). Este protocolo también es compatible con la microscopía confocal de escaneo láser y otras técnicas de microscopía de última generación.

Figura 1: Campo representativo de microscopía de doble tamaño de conjugados sinápticos. La imagen representa el primer fotograma de un experimento representativo de lapso de tiempo que sigue al protocolo. El panel superior muestra el canal de transmisión, el canal CMAC del panel medio (células Raji) y el panel inferior ambos canales combinados. Las flechas amarillas etiquetan algunos conjugados sinápticos, como referencia. Las flechas verdes indican conjugados sinápticos complejos (es decir, una célula de Jurkat que establece sinapsis con más de una célula Raji). Capturado con un objetivo de 40x EWD (0.6 NA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ajustes del microscopio de lapso de tiempo. La imagen corresponde a varias capturas de pantalla correspondientes a los parámetros de imagen utilizados para la captura simultánea de los dos fluorocromos diferentes (CMAC y GFP-CD63) utilizando el software adecuado (es decir, NIKON NIS_AR) en un experimento representativo de lapso de tiempo correspondiente al vídeo 1. Cada trama para el canal GFP-CD63 fue capturada cada 20 s. Solo se capturó una trama para un canal UV de ocho tramas para el canal GFP para mantener la viabilidad celular a lo largo del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Sinapsis inmunológicas hechas por una célula de Jurkat que expresa GFP-CD63, datos sin procesar. Las células Raji B etiquetadas con azul rastreador celular (CMAC, azul) fueron pulsadas con SEE durante 30 minutos y se formaron sinapsis con células Jurkat que expresaban GFP-CD63^8. Se capturaron los lapsos de tiempo correspondientes a los canales GFP-CD63 y CMAC (20 s por fotograma; velocidad de reproducción de vídeo 2 fotogramas por s) y se muestra un ejemplo representativo. Capturado con un objetivo plan APO 60x (1,4 NA). Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Video 2: Sinapsis inmunológicas hechas por una célula de Jurkat que expresa GFP-CD63, después de la desconvolución. Igual que Video 1, pero las imágenes se desconvieron utilizando un software de desconvolución. La mejor relación señal-ruido y la nitidez mejorada, debido a la eliminación de contaminantes fuera de foco fluorescencia, es evidente. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Vídeo 3: Sinapsis inmunológica fija e inmunostecada. La imagen muestra un conjugado sináptico fijo representativo después del paso 7 del Protocolo y la posterior inmunofluorescencia. CMAC (azul) etiqueta las células raji, la transmitancia (TRANS) para mostrar las etiquetas conjugadas sinápticas (flecha blanca), Phalloidin F-actin (verde), anti-CD63 etiquetas MVB (magenta, flecha verde) y anti-o-tubulina MTOC (flecha roja, amarilla), respectivamente. Estos canales fueron imágenes de epifluorescencia, desconvolucionados y fusionados como se indica. El vídeo incluye una pila Z (tamaño del paso z a 0,8 m, 5 fotogramas). La flecha blanca etiqueta el área de contacto sináptica, mientras que la flecha verde etiqueta el MVB y la flecha amarilla etiqueta el MTOC. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Discussion

Una limitación de este protocolo es que no todas las sinapsis estarán orientadas idealmente perpendiculares al eje óptico. Usando esta técnica, no hay manera de predecir y/o influir en la orientación ideal para la toma de imágenes de sinapsis inmune. Para solucionar este problema, excluimos de los análisis posteriores todas las sinapsis capturadas aleatoriamente que finalmente no cumplen con los criterios ideales. Estas sinapsis, oportunamente suficientes, no son muy frecuentes. Sin embargo, es posible eludir esta limitación utilizando varios enfoques experimentales⁴.

La liberación polarizada CD63 (desgranulación) se puede cuantificar mediante otras técnicas complementarias como la tinción de la superficie celular de CD63 (relocalización cd63 a la superficie celular) en células vivas (no fijas y no permeabilizadas), después del paso 6, y posterior lavado y fijación, como se ha demostrado anteriormente^8. Además, se puede realizar la liberación de CD63 en exosomas^8,9 y la cuantificación de exosomas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas^9,25. Estos enfoques son ciertamente compatibles con nuestro protocolo, siempre que la fijación se está realizando después de la inmunofluorescencia de la superficie celular de las células vivas.

Hemos encontrado el número ideal de células (para un pozo de 1 cm² en el portaobjetos de cámara de 8 pozos) es 4 x 10⁵ células (2 x 10⁵ células Raji y 2 x 10⁵ células Jurkat) ya que se adhieren eficientemente a la parte inferior del pozo. La eficiencia de unión a los microtobogiles de plástico (usando fibronectina), o fondo de vidrio (usando poli-L-lisina) no suele ser un problema. Los números de celda más altos pueden no producir brechas entre las células adheridas y, posteriormente, conjugados sinápticos complejos(Figura 1); ambas situaciones no son deseables cuando los conjugados de una sola célula a célula necesitan ser imágenes en, por ejemplo, experimentos de polarización de gránulos mTOC o secretor. Un menor número de células puede disminuir las posibilidades de encontrar conjugados, especialmente cuando las células Jurkat transinfectadas son desafiadas con APC para generar sinapsis. Tenga en cuenta que hemos observado que una incubadora de etapa estabilizada por temperatura en su lugar en la etapa X/Y del microscopio antes del inicio del protocolo (es decir, 1-2 h de antemano para estabilizar la configuración del escenario/microscopio) mantiene los parámetros estables De,Y,Z, que es crucial para la toma de imágenes adecuada. El sistema de enfoque automático eventualmente compensará pequeñas variaciones Z.

Cuando ciertas técnicas de transducción de genes, como la electroporación, se utilizan para expresar proteínas quiméricas fluorescentes (es decir, GFP-CD63) en los clones de Jurkat (Video 1), una fracción considerable de las células puede morir después de la electroporación. Esto puede ser un problema ya que aunque las células muertas no forman sinapsis, cuando están en exceso sobre las células vivas y transinfectadas, pueden interferir con la formación de conjugados hechos por células Th vivas. Hemos encontrado que la eliminación cuidadosa de las células muertas de los cultivos transfectóte mediante el uso de un medio de gradiente de densidad siguiendo protocolos estándar antes de la etapa de formación conjugada puede aumentar las posibilidades de crear una imagen adecuada de los conjugados. Además, las bajas eficiencias de transfección (<20%) puede ser una advertencia importante ya que esto, combinado con una eficiencia de formación conjugada moderada (alrededor del 60%)²⁵, disminuirá la probabilidad de encontrar conjugados hechos por células transinfectadas. Esto no es un problema cuando se utilizan células no transtrofadas para obtener conjugados en experimentos de punto final y posterior fijación. Los 8 portaobjetos de cámara de microrwell son compatibles con los protocolos de inmunofluorescencia convencionales. Esto aumenta la flexibilidad del protocolo anterior con diferentes propósitos. La fijación con acetona puede ser un problema a tener en cuenta al usar diapositivas de cámara con pozos de fondo de plástico. Sin embargo, hay disponibles comercialmente 8 diapositivas de cámara de microscopio de micropozo que contienen fondos de vidrio, que son compatibles con la fijación de acetona. Retire las tapas de plástico cuando se utilice acetona para fijar las células cultivadas en 8 diapositivas de cámara de fondo de vidrio de micropozo.

Se recomienda que el microscopio esté equipado con una etapa XY motorizada, una torreta de epifluorescencia motorizada y un sistema de enfoque automático (por ejemplo, Perfect Focus System) o suplementos equivalentes. Cuando se requiere una adquisición de varios pozos^25,el sistema de enfoque automático garantizará un enfoque estable a lo largo del experimento. La experiencia previa indica que al establecer un desplazamiento de enfoque adecuado en las células Raji, tanto el movimiento de las células T (Video 1) como los movimientos de diapositivas de etapa/cámara del microscopio en experimentos multipunto XY, pueden ser compensados. Esto es realmente conveniente para la captura de lapso de tiempo multipozo.

Se utilizó una cámara de dispositivo acoplado (CDD) en blanco y negro, pancromática y enfriada, pero es deseable una cámara de semiconductores de óxido metálico complementario científico de fluorescencia científica (sCMOS) de alta sensibilidad, ya que esto disminuirá los tiempos de exposición de la cámara y mejorará la resolución temporal. Los cortos tiempos de exposición de la cámara que hemos utilizado (clasificación de 100 ms a 500 ms) combinados con el obturador automático de fluorescencia permiten una captura prolongada del lapso de tiempo (hasta 24 h) con una resolución de tiempo adecuada (1 fotograma por minuto o menos, para hasta 16 posiciones XY) sin blanqueo de fluorescencia significativo y/o pérdida de viabilidad celular. La etapa motorizada permite la captura multipunto (XY) y aumenta la posibilidad de encontrar e imaginar las sinapsis emergentes y en desarrollo en la orientación ideal, pero también permite la adquisición de imágenes en diapositivas multipozo cuando diferentes clones de Jurkat necesitan ser simultáneamente conjugados^25. Es necesaria una alta apertura numérica del objetivo (es decir, 60x, 1.4) para obtener los mejores resultados al analizar el tráfico de gránulos secretores.

El RAJI-SEE-Jurkat constituye un modelo de sinapsis inmunológica bien establecido que ha sido utilizado por una miríada de investigadores desde que fue descrito originalmente¹¹. Hemos adaptado nuestro protocolo a este modelo para visualizar adecuadamente las primeras etapas de la formación de IS. Nuestro objetivo era mejorar los primeros acercamientos²⁰ previamente seguidos para estudiar la polarización del MTOC y la maquinaria secretoras hacia el EI. Es notable que los conjugados realizados con este protocolo produzcan reorganización F-actin a la sinapsis, configurando un SMAC canónico, concomitantemente al tráfico polarizado MVB^25. Estos eventos cruciales también han sido analizados y validados por microscopía confocal^25.

Existen diferencias cinéticas en el tráfico polarizado entre los diferentes tipos de EI. Por ejemplo, el transporte polarizado de gránulos líticos desde los CTL tiene lugar en segundos o muy pocos minutos, mientras que varias vesículas que contienen citoquinas de los linfocitos Th tardan desde minutos hasta varias horas en terminar. Estas diferencias temporales deben tenerse en cuenta de antemano, con el fin de diseñar la mejor estrategia y seleccionar el enfoque experimental y de imagen más adecuado, ya que para algunas estratagemas de imágenes (es decir, microscopía confocal de escaneo láser (LSCM)), el tiempo puede ser un factor limitante ya que el tiempo de captura es mucho mayor que la resolución de tiempo adecuada (1 min o menos)⁴. Esto no es una limitación cuando la microscopía de fluorescencia de campo ancho (WFFM) se utiliza como se describe en el protocolo anterior. Dado que en los CTL, la polarización de MTOC hacia la sinapsis dura sólo unos minutos^3,6,17, diversos enfoques de microscopía de última generación diferentes a los descritos aquí (pero que albergan una resolución espacial y temporal más alta) son necesarios para la imagen adecuada de estas sinapsis^26,27, principalmente cuando se utilizan varias imágenes de campos de microscopio (captura multipunto). Estos nuevos enfoques de alta resolución también se pueden utilizar para tomar imágenes de las sinapsis hechas por los linfocitos Th, aunque razones económicas y/o logísticas (es decir, el equipo central necesario para algunas de estas técnicas de imagen cuesta 6-7 veces más que la descrita aquí) sin duda podría constituir una limitación para estos métodos de imagen de última generación⁴. El hecho de que los linfocitos Th son de larga duración, y la circunstancia de que en los linfocitos Th el MTOC, las vesículas secretoras que contienen linfina y MVB tardan desde varios minutos hasta horas para transportar y acoplarse al IS^22,hace de este protocolo un enfoque ideal y asequible para la toma de imágenes del Th-APC IS.

WfFM en combinación con la desconvolución de la imagen posterior a la adquisición constituye un enfoque interesante y no sólo las razones económicas apoyan esta estrategia. La mala resolución intrínseca en el eje Z (la advertencia más importante de la técnica) se puede mejorar mediante el uso de la desconvolución de imagen posterior a la adquisición⁴ (comparar vídeo 1 con vídeo 2). La deconvolución utiliza un enfoque de procesamiento de imágenes basado en cálculos que puede mejorar la relación señal-ruido y la resolución de la imagen y el contraste²⁷ hasta 2 veces, hasta 150-100 nm en el eje XY y 500 nm en el eje Z^4.

El uso de alta sensibilidad, alta velocidad de lectura y amplio rango dinámico, nuevas cámaras sCMOS de fluorescencia mejorará la calidad de las imágenes y reducirá el blanqueo de fluorescencia. La flexibilidad ofrecida por el protocolo de conjugación de célula a célula descrito aquí permite la combinación del enfoque celular descrito con varias técnicas de microscopía de última generación, tanto en células vivas como en células fijas, y el resultado esperado mejorará nuestro conocimiento de la sinapsis inmunológica.

Aunque hemos implementado y validado el protocolo mediante el uso de líneas celulares fáciles de manejar y bien establecidas, el potencial que el enfoque puede permitir la visualización de más interacciones fisiológicas cuando^seutilizan células T primarias y diferentes tipos de células que presentan antígenos (como células dendríticas de macrófagos). En este contexto, este protocolo también se ha ampliado y validado mediante el uso de superanógeno (SEB) ratón pulsado LÍNEA celular EL-4 utilizado como un APC, para desafiar el ratón primario Linfoblasts T⁹. De hecho, los linfocitos T primarios, los CTL en particular, prestaron contactos sinápticos más efímeros y dinámicos (véase El vídeo suplementario 8 en la referencia⁹⁾a los observados con el modelo SEE-Raji y Jurkat. La mejor manera de ver la variabilidad de los modos de contacto sináptico para las interacciones primarias de células T con células dendríticas o células B en equivalentes de tejido in vitro bidimensionales que también se pueden registrar y analizar mediante este protocolo. Además, aparte de los superanógenos, la técnica se puede utilizar para crear imágenes de otros tipos de sinapsis. Por ejemplo, podría utilizarse en un modelo de célulata T transgénica transgénica tingeno, por ejemplo, utilizando el sistema murine OT1/OT2 específico de ovalbumina o mediante la transfección de células T con receptores de células T específicos de antígenos. Esto abre un sinfín de posibilidades experimentales para el futuro inmediato.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cámara Nikon DS-QI1MC	Nikon	MQA11550	Cabezal de cámara refrigerado
CMAC	ThermoFisher Scientific	C2110	Cell tracker azul
Células JURKAT	ATCC	ATCC TIB-152	Efector Linfocitos T
μ-Diapositiva 8 pocillo ibiTreat, μ-Diapositiva 8 pocillo Fondo de cristal	IBIDI	Cat.No: 80826, 80827	Soportes de cultivo celular e imagen celular
Microscopio NIKON Eclipse Ti-E	Nikon	NIKON Eclipse Ti-E	Microscopio de fluorescencia de campo amplio, totalmente motorizado equipado con la opción Perfect Focus System (PFS)
Incubadora de etapa de microscopio con mezclador de gas manual de 3 canales y módulo de humedad / burbujeador de gas	OKOLAB	H201-NIKON-TI-S-ER Atmósfera de	cultivo celular
Células Raji	ATCC	ATCC CCL-86	APC
RPMI medio GIBCO	ThermoFisher Scientific 21875034		Medio de cultivo
Streptococcus Enterotoxina E (SEE)	Toxin Technology, Inc	EP404	Software de toxina bacteriana
Huygens Essential	SVI	Huygens Essential	Image Software de deconvolución
Software ImageJ	NIH	Image J	Software
de imagen Nikon NIS-AR	Nikon	NIS-Elements AR	Software de captura y análisis de imágenes