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Artículo de método

Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados

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DOI:

10.3791/60315

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3 de diciembre de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

En este artículo

Resumen

Aquí se describen tres enfoques experimentales para estudiar la dinámica de la infección por VIH en ratones humanizados. El primero permite el estudio de eventos de infección crónica, mientras que los dos últimos permiten el estudio de eventos agudos después de una infección primaria o reactivación viral.

Resumen

Los ratonesnulos de cadena NOD/SCID/IL-2 humanizados recapitulan algunas características de la inmunidad humana, que pueden ser explotadas en la investigación básica y preclínica sobre enfermedades infecciosas. Aquí se describen tres modelos de ratones inmunodeficientes humanizados para estudiar la dinámica de la infección por VIH. La primera se basa en la inyección intrahepática de CD34+ células madre hematopoyéticas en ratones recién nacidos, lo que permite la reconstitución de varias células confinadas de sangre y tejido linfoide, seguida de una infección con una cepa de VIH de referencia. Este modelo permite la monitorización de hasta 36 semanas después de la infección y por lo tanto se llama el modelo crónico. El segundo y el tercer modelo se conocen como modelos agudos y de reactivación, en los que las células mononucleares de sangre periférica se inyectan por vía intraperitoneal en ratones adultos. En el modelo agudo, las células de un donante sano se injertan a través de la vía intraperitoneal, seguida de una infección con una cepa de VIH de referencia. Por último, en el modelo de reactivación, las células de un donante infectado por el VIH bajo tratamiento antirretroviral se injertan por vía intraperitoneal. En este caso, un entorno libre de drogas en el ratón permite la reactivación de virus y un aumento de la carga viral. Los protocolos proporcionados aquí describen el enfoque experimental convencional para los modelos de ratón humanizados e inmunodeficientes de la infección por VIH.

Introducción

El modelo de ratón humanizado NOD/SCID/interleukin (IL)-2-chain-chain null (en adelante, huNS -cadenanula)ha sido ampliamente utilizado para el estudio de la patogénesis de infecciones, autoinmunidad y cáncer, así como para estudios preclínicos de fármacos y terapias basadas en células humanas1,2. Estos ratones se basan en un fondo diabético no obeso (NOD), con la mutación scida y la mutación dirigida en el locus de cadena del receptor IL-2 (cadena común para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que inducen un deterioro grave en el desarrollo de células de ratón T-, B- y natural killer (NK)1. Por lo tanto, apoyan el injerto de tejido humano, humano CD34+ células madre hematopoyéticas (HSC), y células mononucleares de sangre periférica humana (PPBM)3,4,5. Además, la expresión transgénica de factores hematopoyéticos humanos, como el factor de células madre (SCF), el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrorófagos (GM-CSF), y la IL-3 promueve el injerto de las poblaciones mieloides humanas6,7,8.

Para los estudios sobre el VIH, se han descrito varios modelos de ratónnulo de cadena huNS, que difieren en la tensión del ratón, el tipo de células humanas utilizadas, el tipo de tejidos para el injerto y el origen de las células (es decir, sanos vs. Donante infectado por el VIH)9,10. La cepa original, sin embargo, es ampliamente utilizada debido a los altos niveles de injerto de células humanas y replicación viral después de la infección con una cepa de referencia del VIH11,12,13. Cepas similares de ratón inmunodeficientes con expresión transgénica de factores hematopoyéticos humanos (p. ej., NOG-EXL o NSG-SGM3) o con implantes de hígado humano y tejidos de timo (ratones de médula ósea-hígado-timo [BLT]) son útiles para evaluar el papel de las poblaciones mieloides en la respuesta inmune anti-VIH, los efectos del VIH en estos tejidos y su participación como reservorios virales14,15. Además, algunas cepas con expresión transgénica de moléculas de antígeno leucocito humano (HLA), así como ratones BLT, se pueden utilizar para estudiar la respuesta de las células T a la infección por VIH16,17.

En general, en estos ratones, la humanización depende del origen celular, la vía de entrega (intraperitoneal, intrahepática, intravenosa, intracardiaca) y la edad del ratón en el momento del injerto18,19,20. En cuanto al origen celular, se puede inyectar en ratones recién nacidos o jóvenes CD34+ HSC derivados de la sangre del cordón umbilical, el hígado fetal o la sangre periférica movilizada3,21. Además, los ratonesnulos de cadena adulta pueden ser humanizados por la inyección de PBMC (en este caso, conocido como ratonesnulos de cadena hu-PBL-NS), permitiendo la circulación temporal de estas células en la sangre, órganos linfoides secundarios y tejidos inflamados22,23,24.

Aquí se describe un protocolo detallado para el establecimiento de modelos de ratónnulo de cadena huNS para el estudio de la infección por VIH. El primero es el modelo crónico, en el que los CD34+ HSC humanos derivados de la sangre del cordón umbilical de un donante sano se inyectan en ratones recién nacidos, seguido de una infección con una cepa de VIH de referencia después de 14 semanas de reconstitución del sistema inmunitario humano. Este modelo permite la monitorización de ratones durante un máximo de 36 semanas después de la infección. El segundo modelo es un modelo agudo, en el que los PMAC derivados de un donante sano se inyectan en ratonesnulos adultos de cadena NS, seguidos de una infección con una cepa de VIH de referencia después de 3 semanas de expansión de células T humanas en el ratón. Por último, el tercer modelo es el modelo de reactivación, en el que se inyectan PAPI derivados de un donante infectado por el VIH bajo terapia antirretroviral supresiva (TAR) en ratonesnulos adultos de cadena NS. En este caso, un entorno libre de drogas permite la reactivación viral y el aumento de la carga viral. Los dos últimos modelos permiten la monitorización hasta 9 semanas después del injerto.

En general, estos tres modelos son útiles para estudios virológicos, estudios preclínicos de nuevos fármacos y la evaluación de los efectos de la infección por VIH en la respuesta inmunitaria global. También es importante considerar que el uso de ratones humanizados infectados por el VIH requiere la revisión y aprobación por parte del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC), así como por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) antes de cualquier experimento. Esto garantiza que el estudio siga todas las regulaciones institucionales internas y externas para el uso de material biológico peligroso y el manejo humano de animales experimentales.

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Protocolo

En este trabajo, todos los cuidados y procedimientos de animales se realizaron de acuerdo con los protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de la Universidad de Maryland (números de protocolo 1018017, 1018018 y 0318009).

1. Enjerción humana de CD34+ HSC de ratones recién nacidos

  1. Utilice siempre equipos de protección personal desechables (EPP), incluidos exfoliantes estériles, guantes, zapatos dedicados, fundas de zapatos, máscaras, gafas, sombrero de cabello/barba y abrigos de laboratorio estériles.
  2. Vuelva a suspender 1 x 106 de CD34 congelado+ HSCs (ver Tabla de Materiales)en 10 mL de RPMI 1640 medios 10% FBS bajo un gabinete de bioseguridad certificado y mantener condiciones estériles.
  3. Utilice 10 l de la suspensión para contar (para asegurar la presencia del número esperado de células) y compruebe la viabilidad celular mediante la tinción de exclusión azul trypan en un hemocitómetro.
  4. Centrífuga a 400 x g durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y resuspenda en frío 1x PBS a la concentración requerida (1,4 x 105 de CD34+ HSCs en 50 l). Mantenga las células en hielo hasta la inyección.
  5. Coloque los cachorros (pupsnulos de cadena NS de ambos sexos de 1 a 4 días de edad) en un plato estéril de 100 mm2 Petri junto con una pequeña cantidad de material de cama de la jaula del criador. Además, frote la ropa de cama limpia entre las manos para enmascarar aún más los olores extraños en los cachorros receptores.
    NOTA: Esto minimiza los olores extraños que se impregnan en los cachorros, mejorando así las posibilidades de que las madres acepten a sus cachorros de nuevo en las jaulas después del procedimiento.
  6. Coloque el plato Petri en una jaula de transporte limpia y coloque la jaula en una jaula de microisolator de ratón limpia para proteger a los cachorros del medio ambiente. Cubra la jaula de transporte con una almohadilla de cubierta para evitar la exposición de los animales a la luz externa mientras está en tránsito a la sala de irradiación.
  7. Irradiar cachorros con irradiación de cuerpo entero (WBI) de 100 cGy por exposición a una fuente de 137 Cs. Limpie el interior del irradiador con solución desinfectante, coloque ratones en el irradiador y encienda el plato giratorio para que todos los cachorros sean irradiados de forma homogénea. Cierre el irradiador y pulse el interruptor de encendido para iniciar el proceso de irradiación. Espere hasta que se complete el tiempo de irradiación y retire inmediatamente los ratones.
    NOTA: Dado que la irradiación no genera estrés en los ratones, no se requiere anestesia previa.
  8. 2-4 h después del procedimiento de irradiación, coloque los cachorros en un gabinete de bioseguridad dentro de un plato de Petri estéril refrigerado cubierto con gasa estéril sobre hielo, hasta que se anesteta (5-10 min). Se logra anestesia suficiente cuando cesan los movimientos brutos.
  9. Cargue la jeringa con una aguja conectada (29 G, 0,5") con 50 ml de la suspensión celular y 1,4 x 105 de CD34+ HSCs bajo el gabinete de bioseguridad certificado.
  10. Para el injerto a través de la inyección hepática, sujeta los cachorros con el pulgar y los dedos índice. Para minimizar la sujeción del ratón (30–45 s), deje que un investigador sostenga el cachorro y administre la inyección, y pida al segundo investigador que cargue la jeringa con la suspensión HSC. Limpie el lugar de inyección con un 70% de alcohol y entregue 50 ml de células directamente en el hígado. Utilice un ángulo de aguja poco profundo al inyectar para evitar perforar completamente el hígado. Como control, inyectar ratones con 50 s de 1x PBS en el hígado.
  11. Coloque los cachorros en un plato de Petri estéril precalentado cubierto con gasa estéril durante 1-5 minutos para permitir la recuperación. Precalienta el plato usando una almohadilla de calentamiento infrarroja para roedores a 20oC para asegurar que los cachorros no estén sobrecalentados.
  12. Inmediatamente antes de devolver los cachorros a sus padres, aplique una pequeña cantidad de pomada a base de mentol y eucalipto, usando el pulgar y los dedos índice, al hocico de ambos padres para evitar el canibalismo o el rechazo de los cachorros.
  13. Revise las jaulas todos los días, buscando cualquier signo de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) en los cachorros, como piel seca, sin alimentación, erupción cutánea y alopecia. Eutanasia a los animales si se observa alguno de estos signos.
  14. Desteta los ratones a las 3 semanas de edad, agrupándolos por género. No ponga más de 5 animales por jaula. Verifique el injerto en la sangre periférica por citometría de flujo a las 14 semanas de edad.
    NOTA: La tasa de éxito del injerto está entre el 80% y el 100%.

2. Injerto de PBMC humano de ratones juveniles

  1. Para los modelos agudos y de reactivación, inyecte ratonesnulos de cadena NS de 6 a 8 semanas por vía intraperitoneal con PMAC humanos derivados de un donante sano o un paciente infectado por el VIH que estaba bajo ART, respectivamente. En ambos modelos, incluya ratones inyectados con PBB de un donante sano sin infección por VIH (sham) como controles.
  2. Capa 15 ml de sangre entera en 5 ml de medio gradiente de densidad estéril en un tubo cónico de 50 ml.
  3. Centrífuga a 400 x g durante 30 min en RT, sin frenos, para evitar que la capa buffy se mezcle con el medio de gradiente de densidad.
  4. Recoger cuidadosamente la fracción de las células mononucleares (entre el medio de gradiente de densidad y el sobrenadante) y transferir la capa de color buffy a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 10 ml de 1x PBS. Centrífuga a 300 x g durante 10 min a RT.
  5. Deseche el sobrenadante y retire los glóbulos rojos restantes lysing con 5 ml de tampón de confirmación añadido a las células peletadas. Incubar durante 4 min a RT.
  6. Centrífuga a 300 x g durante 10 min en RT. Deseche el sobrenadante y resuspenda en 10 ml de 1x pbS o RPMI 1640 medio.
  7. Utilice 10 l de la suspensión celular para contar las células y comprobar la viabilidad mediante la tinción de exclusión azul trypan en un hemocitómetro. Típicamente, 1–2 x 106 células se obtienen por cada 1 ml de sangre, con más del 95% de viabilidad.
  8. Centrífuga a 300 x g durante 10 minutos en RT. Deseche el sobrenadante y ajuste el número de celda a la concentración requerida (en este caso, 3,5 x 106 células en 200 éL de 1x PBS).
  9. Cargue la jeringa con una aguja conectada (28 G, 0,5") con 3,5 x 106 de PMAC en 200 oL de 1 pbS en un gabinete de bioseguridad certificado.
  10. Retire el ratón de la jaula y sosténgalo por la cola para que pueda agarrar la malla, aplicando una tracción suave hacia atrás. Luego, coloca el índice y los dedos del pulgar sobre los hombros del animal, agarrando la piel suelta del cuello y usando el dedo medio para estabilizar su espalda.
  11. Deslice la cabeza del ratón hacia atrás para que su espalda esté por encima de la cabeza. Esto permite que las vísceras de la cavidad abdominal se desplacen hacia atrás y reduce el riesgo de puntuar los órganos internos durante la inyección.
  12. Limpie el lugar de inyección con un 70% de alcohol.
  13. Penetra rinde la jeringa utilizada en el paso 2.9 a través de la pared abdominal y aspira antes de inyectar las células, si se aspira algún material, retira la jeringa y deséchala. De lo contrario, inyecte las células lentamente en la cavidad intraperitoneal, retire la jeringa y deséchela. Inyectar 1x PBS para controlar ratones.
  14. Devuelva al animal a su jaula.
  15. Verifique el injerto en sangre periférica por citometría de flujo a las 3 semanas después de la inyección.

3. Cuidado post-injerto

  1. Identifique a los ratones mediante el etiquetado de oídos.
  2. Observe los ratones utilizados en estos experimentos de cerca 2 veces al día después de cada procedimiento para los signos clínicos de angustia.
  3. Después del trasplante de células humanas, monitoree ratones para la EICH. Para monitorear los síntomas de la EICH en ratones recién nacidos, juveniles y adultos, evalúe a los animales para la aparición de la enfermedad de la piel (es decir, color, sequedad, erupción cutánea, alopecia), además de la medida de peso corporal. Evaluar a los animales que muestran estos signos por un veterinario para considerar la eutanasia temprana.

4. Procedimiento de infección por VIH y procedimiento de infección falsa

NOTA: Para los modelos crónicos y agudos, los ratones están infectados con la cepa de referencia del VIH BaL en la semana 14 y la semana 3 después del injerto, respectivamente. Las inyecciones con VIH se administran por vía intraperitoneal en los cuadrantes abdominales inferiores.

  1. Realice el proceso de carga del virus/PBS en jeringas, utilizando una aguja de 28 G 0,5", en gabinetes BSL2 siguiendo los procedimientos de ABSL2. La cantidad total de virus inyectados es de 15.000 dosis infecciosas de cultivo de tejido medio (TCID50) en 200 l de RPMI 1640 estéril.
  2. Retire el ratón de la jaula y sosténgalo por su cola para que pueda agarrar la malla, aplicando una tracción suave hacia atrás. Luego, coloca el dedo índice y el pulgar sobre los hombros del animal, agarrando la piel suelta del cuello y usando el dedo medio para estabilizar la espalda.
  3. Deslice la cabeza del ratón hacia atrás para que su espalda esté por encima de su cabeza. Esto permite que las vísceras de la cavidad abdominal se desplacen hacia atrás y reduce el riesgo de punción de órganos internos durante la inyección.
  4. Limpie los ratones con una almohadilla de alcohol previamente humedecido en el cuadrante inferior izquierdo/derecho del abdomen. Inyectar 15.000 TCID50 del virus del VIH BaL contenido en 200 l de RPMI 1640 estéril.
  5. Después de la inyección, devuelva el ratón a su jaula de origen.

5. Recolección de sangre por punción retroorbital

NOTA: El sangrado retroorbital permite la rápida acumulación de sangre, reduciendo así el tiempo total de recolección y aumentando la estabilidad de los marcadores de linfocitos humanos. Use tubos EDTA para recolectar sangre de ratones.

  1. En el modelo crónico, a las 14 semanas después de la inyección de HSC, recoger la sangre a través de la vena retroorbital. En los modelos agudos y de reactivación, realice este procedimiento a las 3 semanas de inyección post-PBMC.
  2. Anestetizar a los animales utilizando 250 l de inhalación de isoflurano antes de la recolección de sangre en una campana de bioseguridad clase B2 que se canaliza externamente.
  3. Dispensar el Isoflurano en almohadillas de algodón debajo de una malla de alambre en un frasco transparente de 1 L en un gabinete de bioseguridad ventilado fuera del edificio. El uso de la malla asegura que los animales no entren en contacto con la almohadilla empapada de isoflurano, que puede causar irritación de la piel y posible sobredosis ya que el isoflurano también se absorbe a través de la piel. Además, coloca una toalla de papel suave entre la malla y el animal para evitar lesiones en las extremidades.
  4. Una vez que el frasco está saturado con isoflurano (aproximadamente 1 min después de añadirlo), introducir el animal y observar la frecuencia respiratoria, que aumentará y luego disminuir. Compruebe la indicación clínica de un plano profundo de la anestesia, que incluye la falta de un reflejo de retorcimiento (al inclinar suavemente el frasco) y la falta de movimientos brutos. Inicie el procedimiento de sangrado tan pronto como el animal esté completamente relajado y carente del reflejo de pellizcar del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo.
    NOTA: Dado que el isoflurano se evapora, dispensar más medicamentos si no se observan signos de anestesia.
  5. Para el sangrado retroorbital, presione el caudal de la vena yugular externa del ratón a la mandíbula con el pulgar, y con la misma mano, levante suavemente el párpado superior con el dedo índice.
  6. Inserte un tubo de hematocrito en el canthus medial del ojo y dirijalo en dirección ventrolateral hasta que la sangre comience a funderse.
  7. Recoger al menos 100 l de sangre. Una vez obtenido el volumen deseado de sangre (un volumen no superior al 1% del peso corporal del animal), interrumpa la presión yugular externa y retire el tubo de hematocrito.
  8. Asegúrese de que la hemostásis está completa aplicando la presión directa sobre el ojo utilizando una gasa estéril durante un mínimo de 30 s.
  9. Aplique gotas de tetracaína en el ojo. Monitoree al animal hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia y colóquelo de nuevo en la jaula.
    NOTA: Los 100 l de sangre recogida se utilizan para la evaluación del nivel de injerto de CD45+ humano y otras poblaciones de células sanguíneas, así como para la evaluación de la carga viral plasmática.

6. Examen del nivel de injerto y análisis de citometría de flujo

  1. Siga un protocolo de tinción de citometría de flujo convencional para sangre entera, que incluye la incubación de anticuerpos antihumanos etiquetados con fluorocromo (para el panel de flujo sugerido, véase Tabla de materiales), seguido de la lisis de los glóbulos rojos y los pasos de lavado13,15.
    NOTA: Para el cribado del nivel de injerto, incluya un anticuerpo CD45 antihumano. Para la comparación, también se puede utilizar un anticuerpo CD45 antiratón. Incluya controles de compensación, así como una muestra de sangre humana manchada con la misma mezcla de anticuerpos, muestras de ratón y sangre humana no manchadas, y control no humanizado para probar la reactividad cruzada de los reactivos. Después de la tinción, siempre hay alguna señal de fondo; sin embargo, todas las señales positivas se distinguen claramente de los controles negativos y reactivos cruzados.
  2. En un citómetro de flujo apropiado, adquiera al menos 10.000 eventos en la puerta del linfocito (FSC-A vs. Para el análisis de citometría de flujo, después de la exclusión duplicada, determinar el porcentaje de CD45+ células humanas, así como otras poblaciones celulares de interés.

7. Evaluación de la carga viral plasmática

  1. Evaluar la carga viral en animales infectados por el VIH 1 veces por semana después de la infección.
  2. Después del sangrado retroorbital (aproximadamente 100 l), obtener plasma mediante la recolección del sobrenadante después de la centrifugación de la sangre anticoagulada a 3.500 x g durante 3 minutos en una microcentrífuga. El pellet se utiliza para el fenotipado de células sanguíneas.
  3. Utilice un kit comercial de extracción de ARN viral (ver Tabla de Materiales)para obtener ARN a partir de 40 ml de plasma.
  4. Convierta el ARN en CDNA utilizando la primera mezcla de síntesis de deformación unitaria (ver Tabla de Materiales)y imprimación de mordaza VIH SK431.
  5. Realizar PCR cuantitativo en tiempo real utilizando imprimaciones de medición de VIH SK38/SK39 y colorantes verdes fluorescentes (por ejemplo, SYBR green) como se describe en estudios anteriores13,25.

8. Administración de terapia antirretroviral

  1. Administrar ART oral al menos 3 semanas después de la infección, cuando se observa una alta carga viral, en los modelos crónicos, agudos y de reactivación.
  2. Calcular las dosis de tenofovir disoproxilo fumarato (TDF), emtricitabina (FTC) y raltegravir (RAL), según los valores de Km de 37 y 3 para humanos y ratones, respectivamente26. Típicamente, las dosis equivalentes humanas de TDF, FTC y RAL son 61,7 mg/kg/día, 40,7 mg/kg/día y 164 mg/kg/día, respectivamente.
  3. Para la administración en agua potable, triturar los comprimidos de drogas y añadir la cantidad respectiva en la botella de agua, asegurando que cada ratón en la jaula adquiere su dosis diaria. Dado que el medicamento en polvo puede formar sedimentos en la botella, agitar periódicamente la botella de agua para lograr una suspensión homogénea.
  4. Cambie la botella de agua cada semana con medicamentos recién disueltos.
  5. Recoger la sangre a través de la vena retroorbital cada semana o cada 2 semanas después de la iniciación del TAR para evaluar los cambios en la carga viral y la relación CD4:CD8.

9. Eutanasia de ratón, acumulación de órganos linfoides secundarios y aislamiento de células mononucleares

  1. La eutanasia se realiza en los tres modelos de ratón humanizados, periódicamente a lo largo del tiempo de infección, o al final del experimento.
  2. Realizar la eutanasia de ratones adultos mediante asfixia porCO2, seguida de la luxación cervical. Para la asfixia, utilice una cámara no precargada, dispensar CO2 de un cilindro comercial con regulador de presión fija y en línea restricdor controlando el flujo de gas dentro del 20%-30% del volumen de la cámara / minuto para cumplir con las directrices de 2013 AVMA.
  3. Mantener el flujo deCO2 para >60 s monitoreo de paro respiratorio (que puede tardar hasta 5 min), seguido de la luxación cervical para asegurar la eutanasia.
  4. Eutanasia sinneatos <7 días de edad por un método físico (es decir, usando tijeras afiladas).
  5. Visualice los ganglios linfáticos axilares, mediastinales y mesentéricos (que normalmente se observan) y extráigalos con pinzas y tijeras afiladas. También extraer el bazo, situado en la parte superior izquierda de la cavidad peritoneal.
  6. Depositar los tejidos linfoides en tubos centrífugos de 1,5 ml que contengan un medio estéril RPMI 1640.
  7. Procesa inmediatamente los tejidos linfoides en un colador de células de nylon del tamaño de un poro de 70 mm, recogiendo las células en un tubo de 50 ml. No aspirar los tejidos.
  8. Lavar las células con 5 ml de rpm 1640 medio complementado con 1% FBS para facilitar el filtrado de las células.
  9. Después de la desagregación del tejido, centrifugar la suspensión de las células a 3.500 x g durante 10 minutos en una microcentrífuga.
  10. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con 500 s de 1pbS.
  11. Transfiera la suspensión de las células a un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga 500 ml de medio de gradiente de densidad estéril.
  12. Centrífuga a 3.500 x g durante 3 min en una microcentrífuga, sin freno, para evitar que la capa buffy se mezcle con el medio de gradiente de densidad
  13. Recoger cuidadosamente la fracción de las células mononucleares (entre el medio de gradiente de densidad y el sobrenadante) y transferir la capa de buffy a un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contiene 500 l de 1 x PBS. Centrífuga a 3.000 x g durante 3 min.
  14. Retire los glóbulos rojos restantes lysing con 500 l de tampón de aCK, incubando durante 4 minutos a RT.
  15. Centrífuga a 3.000 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda en 1 ml de 1x PBS o medio.

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Resultados

Como se describió anteriormente, a las 14 semanas después de la inyección de HSC (modelo crónico) o a las 3 semanas de inyección post-PBMC (modelos agudos y de reactivación), los ratones se desangran para detectar el nivel de injerto de células humanas por citometría de flujo. En la Figura 1Ase muestra una estrategia representativa de gating para la evaluación de 1) CD45humano + reconstitución de células y 2) porcentaje de células CD4+ y CD8+...

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Discusión

Se han logrado importantes avances en el desarrollo de cepas de ratón inmunodeficientes para la humanización, con una serie de opciones diferentes que se pueden utilizar según el interés de la investigación1. Aquí se proporciona un protocolo general para la humanización de ratonesnulos de cadena NS y cepas genéticamente similares que se emplearán en tres modelos diferentes para el estudio de la infección por VIH. En el primer enfoque experimental, los ratones recién nacidos irradiados s...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los fondos internos de la división clínica del IHV a JCZ.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0. Tubos de microcentrífuga de 5 mlNeptune3735.S.X
1. Tubos de microcentrífuga de 5 mlNeptune3745.S.X
10 ml Pipetas serológicasstellar sceintificVL-4090-0010
Tubos cónicos de 15 ml StellarscientificT15-600
25 ml Pipetas serológicasstellar sceintificVL-4090-0025
5 ml Pipetas serológicasstellar sceintificVL-4090-0005
Tubos cónicos de 50 mlTampón de lisis Stellar scientific T50-600
ACKCalidad biológica118-156-101
Almohadillas de preparación de alcoholFisher scientific06-669-62Clon estéril
de CD3 antihumano UCHT1Biolegend300439APC clon conjugado
antihumano CD4 OKT4Biolegend317420AF488 conjugado
clon antihumano CD45 2D1Biolegend368522BV421 conjugado
clon CD8 antihumano SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 conjugado
Gabinete Biosafaty nivel 2Si es posible conectado a un quimeny exauste cuando se manipula Isoflurano
Bonnet Fisher scientific17-100-900Tapón de un solo uso para protección básica
CavicideMetrex13-1000Desinfectante de superficies
CD34+ células Lonza2C-101Tantos viales disponibles de un solo donante
CentrífugaBeckman65-6KR
Tarro transparenteAmazon77977
Almohadillade gasa de algodónFisher scientific22-415-468Batas
de laboratorio desechables estérilesFisher scientific19-472-422
Microtubos de EDTAGreiner bio-one450480
MascarillaFisher scientific17-100-897
FACS solución de lisisBD340202
FBS premium HIAtlanta biologicals S1115OH
FicollGE health one17-1440-02
Citómetrode flujo FACS Aria II
Falcon3520545 ml de poliestireno y BaL
Preparado en nuestras instalaciones centrales uQUANT
PBMCVoluntarios VIH positivos y negativos
Infrarrojos almohadilla térmicaVenet scientificDCT-25Almohadilla térmica temporal para animales pequeños
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Medicamento antirretroviral para tratar el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-Inhibidor de la integrasa
IsofluranoHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I IrradiadorEquipo perteneciente a la Universidad de
Maryland Micropipetas
MicrocentrífugaEppendorf
Etiquetas de oreja de ratónNational Band & Etiqueta empresa1005-1L1
Tubos de extracción de sangre NatelsonFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
Ratones NSGJackson5557Tiempo hembras preñadas para el injerto de CD34 y juveniles para el injerto de PBMCs
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldehído 16%Ciencias de la microscopía electrónica15710
PBS 1X pH 7.4Gibco100-10-023
Placas de PetriFisher scientific08-757-28
Quantistudio Máquina qPCRThermoQS3
Reservorios de reactivosCostar4870
RPMI media 1640 1XGibco11875-093
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Truvada (Emtricitabina y TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Medicamento antirretroviral para tratar el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-Inhibidor de la transcriptasa análoga nicleósido
Azul de tripanoSigmaT8154Recuento de células y viabilidad
Vick VaporubSalud escolar43214Pomada a base de mentol y eucalipto
Grado de biología molecular del aguaCalidad biológica351-029-131
de flujo Utilizamos tubos de citometría VIH de fondo redondo humanos

Referencias

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