Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Resumen

Este estudio describe el monitoreo microscópico de la adherencia del neumococo a las cadenas del factor von Willebrand producidas en la superficie de células endoteliales primarias humanas diferenciadas bajo tensión de cizallamiento en condiciones de flujo definidas. Este protocolo se puede extender a la visualización detallada de estructuras celulares específicas y cuantificación de bacterias mediante la aplicación de procedimientos de inmunoinso diferencial.

Resumen

La interacción de Streptococcus pneumoniae con la superficie de las células endoteliales se media en el flujo sanguíneo a través de proteínas sensibles al mecanosensible como el Factor Von Willebrand (VWF). Esta glicoproteína cambia su conformación molecular en respuesta al estrés de cizallamiento, exponiendo así sitios de unión para un amplio espectro de interacciones huésped-ligand. En general, el cultivo de células endoteliales primarias bajo un flujo de cizallamiento definido es conocido por promover la diferenciación celular específica y la formación de una capa endotelial estable y estrechamente vinculada que se asemeja a la fisiología del revestimiento interno de un vaso sanguíneo . Por lo tanto, el análisis funcional de las interacciones entre patógenos bacterianos y la vasculatura huésped que involucra proteínas mecanósensitiveas requiere el establecimiento de sistemas de bombeo que puedan simular las fuerzas de flujo fisiológico que se sabe que afectan a la superficie de células vasculares.

El dispositivo microfluídico utilizado en este estudio permite una recirculación continua y sin pulsos de fluidos con un caudal definido. El sistema de bomba de presión de aire controlado por ordenador aplica una tensión de cizallamiento definida en las superficies de células endoteliales mediante la generación de un flujo medio continuo, unidireccional y controlado. Los cambios morfológicos de las células y la unión bacteriana se pueden monitorear y cuantificar microscópicamente en el flujo mediante el uso de diapositivas de canal especiales que están diseñadas para la visualización microscópica. A diferencia de la infección por cultivo celular estático, que en general requiere una fijación de muestraantes antes del etiquetado inmune y los análisis microscópicos, las diapositivas microfluídicas permiten tanto la detección basada en fluorescencia de proteínas, bacterias y componentes celulares después de la fijación de la muestra; inmunofluorescencia en serie; y detección directa basada en fluorescencia en tiempo real. En combinación con bacterias fluorescentes y anticuerpos específicos etiquetados con fluorescencia, este procedimiento de infección proporciona un sistema de visualización de múltiples componentes eficiente para un gran espectro de aplicaciones científicas relacionadas con los procesos vasculares.

Introducción

La patogénesis de las infecciones por neumococo se caracteriza por una interacción multifacética con una diversidad de compuestos de matriz extracelular y componentes de la hemostasia humana, como el plasminógeno y el VWF^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. El VWF multidominio de glicoproteína sirve como regulador clave de una hemostasis equilibrada mediante la mediación del reclutamiento de trombocitos y la incorporación de fibrina en el sitio de formación de trombos vasculares^9. La importancia del VWF funcional y activo para el control del sangrado y la cicatrización de heridas se demuestra en la enfermedad de von Willebrand, un trastorno hemorrágico hereditario común^10.

Globular VWF circula en el sistema sanguíneo humano a una concentración de hasta 14,0 g/ml^11,10. En respuesta a la lesión vascular, la liberación local de FVW por parte de los cuerpos endoteliales de palademán de Weibel (WBP) se incrementa notablemente^11,12. Estudios anteriores muestran que la adherencia del neumococo a las células endoteliales humanas y su producción de la toxina formacional de poros neumolisina estimula significativamente la secreción luminal de VWF¹³. Las fuerzas hidrodinámicas del flujo sanguíneo inducen una apertura estructural de los dominios de VWF mecanoresponsive. A caudales de 10 dyn/cm² el VWF multimerizes a cadenas de proteínas largas de hasta varios cientos de micrómetros de longitud que permanecen unidos al subendotelio^10,12.

Para comprender la función de las cadenas multimerizadas de VWF generadas bajo tensión cortante en la interacción del neumococo con la superficie endotelial, se estableció un enfoque de infección del cultivo celular basado en microfluidos. Se utilizó un dispositivo microfluídico con un sistema de bomba de presión de aire controlado por software. Esto permitió una recirculación continua y unidireccional del medio de cultivo celular con un caudal definido. De este tipo, el sistema aplicó una tensión cortante definida en la superficie de las células endoteliales, que permanecía unida dentro de diapositivas de canal especializadas. Este enfoque permitió la simulación de la fuerza cortante dentro del torrente sanguíneo del sistema vascular humano, en el que las cadenas VWF se generan en células endoteliales diferenciadas en condiciones de flujo constante definidas. Para ello, las células endoteliales se cultivaron en diapositivas de canal específicas (ver Tabla de Materiales),que fueron adaptadas para análisis microscópicos durante el flujo. El sistema de bomba microfluídica proporcionó la situación de tensión de cizallamiento altamente definida y controlada necesaria para la formación de cadenas VWF extendidas en la capa de células endoteliales confluentes. Después de la estimulación de la secreción de VWF de las células endoteliales de venas umbilicales humanas cultivadas confluentes (HUVEC) por la suplementación con histamina, la formación de cuerdas fue inducida mediante la aplicación de una tensión de cizallamiento (o) de 10 dyn/cm². La tensión de cizallamiento se define como la fuerza que actúa sobre la capa de celda. Se calcula aproximadamente de acuerdo con Cornish et. al.¹⁴ con la ecuación 1:

En el caso de la tensión de cizallamiento en dyn/cm², á viscosidad en (dyn)/cm², h a la mitad de la altura del canal, a la mitad de la anchura del canal y a la velocidad de flujo en ml/min.

El resultado de la ecuación 1 depende de las diferentes alturas y anchuras de las diferentes diapositivas utilizadas (ver Tabla de Materiales). En este estudio se utilizó una diapositiva de canal Luer de 0,4 m que dio como resultado un factor de deslizamiento de cámara de 131,6 (ver fórmula 2).

La viscosidad del medio a 37oC es de 0,0072 dyns/cm2 y se utilizó una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2. Esto dio lugar a un caudal de 10,5 ml/min (véase la fórmula 3).

Aquí, la adaptación y el avance de un procedimiento de cultivo celular microfluídico utilizando un sistema de flujo laminar unidireccional para la investigación y visualización de los mecanismos de infección bacteriana en la vasculatura del huésped se describe en detalle. La generación de cadenas VWF en capas endoteliales también se puede estimular mediante el uso de otros sistemas de bomba que son capaces de aplicar una tensión de cizallamiento continua y constante¹⁵.

Después del cultivo de células endoteliales primarias para confluencia en el flujo y la estimulación de la formación de cuerdas DeVWF, se añadieron neumococos que expresan proteína de fluorescencia roja (RFP)¹⁶ a la capa de células endoteliales bajo control microscópico constante. La unión de bacterias a las cuerdas del VWF en la superficie de las células endoteliales se visualizó y monitorizó microscópicamente durante hasta tres horas en tiempo real mediante el uso de anticuerpos con etiquetas fluorescentes específicas de VWF. Con este enfoque, se determinó el papel del VWF como cofactor de adhesión que promueve el apego bacteriano al endotelio vascular^8.

Además de la visualización microscópica de la secreción de proteínas y los cambios de conformación, este método podría utilizarse para monitorear pasos individuales de los procesos de infección bacteriana en tiempo real y para cuantificar la cantidad de bacterias adheridas en diferentes puntos de tiempo de Infección. El sistema específico de bomba controlada por software también ofrece la posibilidad de cultivar las células endoteliales en condiciones de flujo constante definidas durante un máximo de varios días y permite una incubación de flujo medio pulsada definida. Además, este método se puede aplicar utilizando diferentes tipos de celda. La adaptación del protocolo de tinción también permite la detección y visualización de bacterias internalizadas en células eucariotas.

Este manuscrito describe este protocolo experimental avanzado que se puede utilizar como un enfoque definido, confiable y reproducible para una caracterización eficiente y versátil de los procesos fisiopatológicos.

Protocolo

El cultivo de células microfluidas se realizó con células endoteliales comerciales de venosas umbilicales humanas primarias (HUVEC). La compañía aisló las células con el consentimiento informado del donante. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Cámara de Médicos del Estado Federal de Baden-Wuerttemberg con el número de referencia 219-04.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener suministros de protocolo.

1. Precultivo de Células Endoteliales Primarias

1. Descongelar un vial de glicerol congelado que contiene 1 x 10⁵ HUVEC primario de tres donantes diferentes suavemente a 37 oC y sembrar las células en 7 ml de medio de crecimiento de células endoteliales precalentados (ECGM, listo para usar con suplementos) en un matraz de²⁵ cm 2 células.
   NOTA: Las células endoteliales primarias pierden capacidad de diferenciación después de más de 5 ciclos de proliferación. Por lo tanto, sólo se pueden utilizar celdas con menos de 5 pasajes si se requieren altos grados de diferenciación celular.
2. Cultivar las células a 37 oC en una atmósfera de CO₂ al 5% durante 60 minutos para permitir la fijación de la superficie e intercambiar el medio de cultivo celular ECGM para deshacerse de los residuos de la crioconservación.
3. Continúe el cultivo de las células a 37 oC en una atmósfera de CO₂ del 5% hasta que formen una capa celular de subconfluente.
   NOTA: El HUVEC no debe crecer a una capa de confluente ya que los contactos estrechos de las celdas celulares impiden la formación de una capa celular estable más adelante en el flujo.

2. Precultivo de Streptococcus pneumoniae

ADVERTENCIA: Streptococcus pneumoniae es un agente de nivel 2 de bioseguridad y solo se permite el cultivo en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad. Utilice un banco limpio clasificado para el nivel de seguridad 2 para todos los tratamientos bacterianos, evite estrictamente la formación de aerosoles y utilice una centrífuga con protección contra aerosoles para la sedimentación de bacterias.

1. Inocular una placa de agar en sangre de Columbia con aislado clínico de Streptococcus pneumoniae ATCC11733 derivado de un stock de glicerol almacenado constantemente a -80 oC y cultivar la placa de agar durante la noche a 37 oC y 5% de CO_2.
2. Preparar 40 ml de caldo líquido Todd Hewitt complementado con 1% de extracto de levadura (THY) y 15 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) pH 7.4, para pasos de cultivo y lavado bacterianos.
3. Utilice un tubo estéril para el cultivo bacteriano e inocular el caldo de cultivo líquido con masa bacteriana. Controlar la cantidad de inoculación mediante medición fotométrica de alícuotas de 1 ml a 600 nm contra caldo líquido no inoculado como referencia. Rellene la masa bacteriana en el caldo líquido hasta que alcance una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀₎de 0,15.
4. Incubar el caldo líquido inoculado sin agitar a 37 oC y 5% de CO₂ y determinar la_{DoS 600} cada 30 min midiendo alícuotas de 1 ml utilizando cubetas de plástico.
5. Tan pronto como el cultivo bacteriano ha alcanzado una DoP₆₀₀ de 0.4, que corresponde a la fase de crecimiento exponencial, centrifugar la suspensión del cultivo bacteriano durante 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: No permita que un cultivo de neumococo alcance una OD₆₀₀ de más de 1,0, porque se sabe que una alta densidad de cultivo de neumococo desencadena la autolisis bacteriana, que podría afectar la aptitud bacteriana general.
6. Resuspenda el sedimento bacteriano suavemente con 10 ml de PBS y vuelva a sedimentar durante 10 min a 1.000 x g a RT.
7. Resuspenda el sedimento bacteriano lavado suavemente en 1 ml de PBS y determine el OD₆₀₀ de 10 l de la suspensión bacteriana utilizando 1 ml de PBS como referencia.
8. Ajuste la cantidad de bacterias en PBS a una DoP₆₀₀ de 2.0. Según el conteo bacteriano previamente determinado, una OD₆₀₀ de 2.0 corresponde a 2 x 10⁹ unidades formadoras de colonias (CFU). Proceder inmediatamente con el procedimiento de infección para prevenir la autolisis bacteriana.

3. Cultivo celular endotelial de HUVEC bajo condiciones microfluídicas

1. Separe las células endoteliales primarias del matraz del cultivo celular por proteólisis controlada. Realice los siguientes pasos en un entorno estéril utilizando un banco limpio. Preparar un volumen de 15 ml de PBS estéril para los pasos de lavado.
   1. Retire el ECGM de una capa HUVEC de subconfluente y lave la capa celular con PBS de 10 ml utilizando una pipeta serológica para deshacerse del medio de cultivo celular.
   2. Incubar el HUVEC lavado con 3 ml de solución de disociación celular precalentada de 37oC para desprendimiento celular durante 5 min a 37oC. Observe el desprendimiento de células proteolíticas mediante la monitorización microscópica cada minuto.
   3. Pipetear la suspensión de celda separada en un tubo que contenga 7 ml de ECGM complementado con 2% de suero de ternero fetal (FCS) para detener la proteólisis y sedimentar las células durante 3 min a 220 x g en RT.
   4. Retire el sobrenadante y resuspenda el HUVEC en 250 l de ECGM complementado con 5% de FCS y 1 mM MgSO₄. Utilice 10 l de la suspensión celular para el recuento celular utilizando una cámara de recuento de células Neubauer y ajuste el recuento de células a 4 x 10⁶ células/ml ECGM complementado con 5% de FCS y 1 mM MgSO₄.
      NOTA: Para cada experimento de flujo se requerirán 30 mL de medio ECGM complementado con 5% FCS y con 1 mM MgSO_4. A partir de aquí, esta composición media se denomina ECGMS-medium. El aumento de la concentración de FCS en el medio de cultivo de 2% a 5% apoya la fijación celular y la viabilidad celular de HUVEC sembrada en la diapositiva del canal. El medio complementa FCS y MgSO₄ estabiliza sustancialmente la unión celular de HUVEC en condiciones de tensión cortante.
2. Semilla y cultiva el HUVEC en una diapositiva de canal. Trabaje en un ambiente estéril utilizando un banco limpio. Las células se cultivarán bajo estrés de cizallamiento durante 2 días seguido de infección con bacterias y monitoreo microscópico para otras 2 h.
   1. Equilibrar una diapositiva de canal, un conjunto de perfusión de 1,6 mm de diámetro y 50 cm de longitud, una alícuota del medio ECGMS y una diapositiva de canal Luer de 0,4 m de altura, durante 24 horas en una incubadora con una atmósfera de_CO2 del 5% a 37 oC para reducir el número de burbujas de aire.
      NOTA: Este procedimiento se recomienda para desgasificar el equipo plástico y precalentar el medio, los tubos de perfusión y los depósitos. Si se han almacenado materiales o líquidos en RT o en el refrigerador, los gases disueltos en el plástico y los líquidos se liberarán cuando se calientan en la incubadora durante el experimento. A continuación, aparecerán burbujas de gas. Desgasificar todos los componentes plásticos antes del experimento eliminará este efecto. Cada vez que el sistema es sacado de la incubadora, el proceso de absorción de gas comienza de nuevo. Por lo tanto, trabaje rápidamente en RT y nunca deje la unidad fluida fuera de la incubadora durante períodos de tiempo más largos.
   2. Utilice una pipeta para inyectar 100 ml de una solución de gelatina porcina filtrada estéril al 2% en una solución de PBS en uno de los depósitos de una diapositiva de canal equilibrado a temperatura. Incubar la gelatina-solución durante 1 h a 37 oC y enjuagar el canal de la corredera con 1 ml de PBS en condiciones estériles utilizando una jeringa Luer de 1 ml.
   3. Coloque el portaobjetos recubierto de gelatina sobre una fina placa de poliestireno o espuma de poliestireno para evitar una caída en la temperatura del deslizamiento. Añadir 100 l de la suspensión HUVEC de 4 x 10⁶ml con una jeringa Luer de 1 ml en la corredera.
      NOTA: Colocar la corredera de canal en la superficie de metal frío del banco limpio podría disminuir la temperatura del fondo de la diapositiva, generando así tensión fría a las células endoteliales. Durante el pipeteo celular mantenga la diapositiva un poco hacia arriba para dejar que las burbujas de aire se eleven y desaparezcan del interior de la diapositiva.
   4. Incubar la diapositiva del canal con el HUVEC durante 60 min a 37 oC y 5% co₂ y llenar los depósitos medios en ambos extremos de la diapositiva del canal con un medio ECGMS de 60 ol cada uno. Incubar durante 1 h a 37oC y 5% CO₂.
3. Ajuste la bomba microfluídica y los ajustes del software.
   1. Conecte el conjunto de perfusión equilibrada a la unidad de bomba, llene con 13,6 ml de ECGMS-medio e inicie el software de control de la bomba. Seleccione el conjunto de perfusión adecuado y el tipo de diapositiva de cámara utilizando las ventanas de desplazamiento hacia abajo en el menú de la unidad fluida configurada. Elija 0.007 (dyns/cm²) en el software para la viscosidad media. (Consulte los ajustes del software de la bomba de presión marcados con flechas rojas en la Figura suplementaria 1).
   2. Fuera de la incubadora, conecte una botella de vidrio llena de perlas de sílice de secado al tubo de presión de aire (consulte la Figura 1, Inset 3). El aire de la bomba de presión circula entre los depósitos de perfusión y la bomba y debe estar seco antes de volver a entrar en el dispositivo de la bomba. Seleccione Parámetros de flujo en el menú de software, ajuste la presión a 40 mbar y enjuague los tubos de la bomba con el medio líquido iniciando el flujo medio continuo. (Estos ajustes también se indican mediante flechas rojas en la Figura Suplementaria 1).
   3. Programe los ciclos de tensión de cizallamiento deseados del cultivo de flujo. Comience con 5 dyn/cm², controle el bombeo de depósito equilibrado y asegúrese de que no haya burbujas de aire circulando en el sistema de la bomba.
      NOTA: La tensión de cizallamiento de pared en una diapositiva de canal depende del caudal y la viscosidad del medio de perfusión. Si utiliza otro sistema de bomba, consulte las ecuaciones descritas en la introducción para establecer un caudal que genere el nivel de tensión de cizallamiento deseado. Los ajustes descritos corresponden a un caudal de 5,42 ml/min. (Una captura de pantalla ejemplar que muestra los ajustes de parámetros de flujo adecuados en el software de la bomba de presión se muestra en la Figura suplementaria 2).
   4. Detenga la circulación del flujo en el software de control de la bomba y mantenga el flujo medio en el tubo de perfusión sujetando los tubos cerca de las conexiones Luer. Conecte la diapositiva del canal, evitando así las burbujas de aire, y coloque la unidad fluida con la diapositiva del canal conectado en una incubadora de CO₂ a 37 oC y 5% de CO_2. Inicie la tensión de cizallamiento a 5 dyn/cm² durante 30 minutos para adaptar suavemente las células a las fuerzas generadas por la tensión de cizallamiento antes de acelerar el nivel de tensión de cizallamiento (consulte la Figura suplementaria 3).
      NOTA: Tenga cuidado de que no queden burbujas de aire en el sistema de tubos o en el portaobjetos después de conectarlo al sistema de tubos porque el movimiento de las burbujas de aire en el flujo podría conducir al desprendimiento de la célula.
   5. Acelere la tensión de cizallamiento a 10 dyn/cm² (que corresponden a 10,86 ml/min en este ajuste de flujo) e incubar la corredera de canal en tensión de cizallamiento continua durante 48 h en una pequeña incubadora de CO₂ a 37 oC y 5% de CO₂ para permitir la diferenciación celular ( los settinngs de software respectivos se indican con flechas rojas en la Figura Suplementaria 4).
      NOTA: Las células HUVEC tienden a desprenderse de la superficie del canal si el cultivo del flujo se inicia directamente a 10 dyn/cm². Las células permanecen unidas a la superficie de la cámara si el cultivo de flujo se inicia con menos tensión de cizallamiento utilizando 5 din/cm² durante un mínimo de 30 minutos seguido de aumentar la tensión de cizallamiento lentamente hasta los 10 diques/cm²deseados. Una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm² es el valor mínimo en este ajuste de perfusión requerido para la formación de cuerdas VWF.
   6. Después de 24 h de cultivo de células microfluídicas, detenga el flujo medio con el software de control de la bomba exactamente cuando se alcanza un nivel medio equilibrado en ambos depósitos medios. Colocar la unidad fluida en un banco limpio y retirar 10 ml del medio de cultivo circulado de los depósitos de perfusión utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Añadir 10 ml de ECGMS-medio a los depósitos para renovar el medio, volver a colocar la unidad fluida en la incubadora de CO₂ a 37oC y 5% de_CO2,y reiniciar el cultivo fluido utilizando el software de control de la bomba.
      NOTA: La función de la bomba de presión puede ser interrumpida repentinamente por máquinas de laboratorio como grandes centrífugas, lo que podría crear una fuerte perturbación del campo magnético. Esta interrupción repentina podría conducir al desprendimiento celular. Tenga cuidado de que estas máquinas no estén activas cerca de la bomba de presión durante el experimento.
   7. Iniciar el precalentamiento de la cámara de incubación de temperatura que cubre la etapa del microscopio de fluorescencia a 37 oC para el equilibrio de temperatura 24 h antes de la visualización microscópica. Después de precalentar el microscopio, inicie el control del software del microscopio y ajuste los ajustes principales para la monitorización microscópica de fluorescencia seleccionando los ajustes de filtro adecuados (540 nm/590 nm para la detección de las bacterias y bacterias que expresan RFP y 470 nm/515 nm para la detección de la emisión de fluoresceína de los anticuerpos específicos para FVW conjugados por el FITC). Precalentar una cámara de calentamiento adicional para la incubación de la unidad fluida a 37 oC.
      NOTA: Durante los análisis de infección y la monitorización microscópica la temperatura de la diapositiva del canal y el medio circulante no deben disminuir sustancialmente, ya que esto generaría estrés frío en las células. En general, el tamaño de las cámaras de temperatura que cubren la etapa del microscopio no es suficiente para cubrir toda la unidad fluida. Por lo tanto, se recomienda el uso de una cámara de calentamiento adicional precalentada a 37 oC.
   8. Para la visualización microscópica, coloque la unidad fluida en la cámara de calentamiento precalentada de 37 oC y coloque la diapositiva del canal en una etapa del microscopio precalentado de 37 oC.
      NOTA: Para la visualización microscópica, la unidad fluida y la corredera de canal debían retirarse de la incubadora de CO₂ debido a la longitud limitada del tubo de perfusión. Si se requieren tiempos de infección y monitorización microscópica superior a 180 min fuera de la atmósfera del 5% de_CO2 para el amortiguamiento del pH, se debe utilizar un medio con pH amortiguado para el cultivo microfluídico.
   9. Controlar la morfología celular y la integridad de la capa HUVEC antes de la inyección de histamina y bacterias a la circulación de flujo durante todo el momento del experimento de flujo y después de terminar el experimento de flujo utilizando el modo de campo brillante del microscopio.

4. Inducción de la liberación de VWF y visualización de cadenas DeV Multimerizadas

1. Mantenga el ajuste de flujo, ya que se requiere una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm² para desencadenar la multimerización de VWF a cadenas largas de hasta 200 MDa. Induzca la liberación de VWF de WPB endotelial inyectando 136 ml de una solución de hetamina de 100 mM en el medio ECGMS que circula en el tubo de perfusión utilizando un puerto de inyección. La concentración final de histamina en el medio de flujo será de 1 mM. Si no hay puerto de inyección disponible, la histamina se puede añadir alternativamente mediante pipeteo en el medio de los depósitos de la bomba.
2. Para la detección de inmunofluorescencia de cuerdas VWF multimerizadas, detenga el flujo cuando se alcance un nivel medio equilibrado en los depósitos e inyecte 20 g de un anticuerpo conjugado FITC específico para VWF en un volumen de 200 ml de PBS (pH 7.4) en la circulación de 13,6 ml de ECGMS-medio utilizando un puerto de inyección. Si no hay puerto de inyección disponible, el anticuerpo se puede añadir alternativamente pipeteando en el medio de los depósitos de la bomba. Esto da como resultado una concentración final de anticuerpos de 1,3 g/ml.
3. Para el escaneo microscópico de varios campos de visión en poco tiempo, utilice la unidad de fluorescencia del microscopio con un dispositivo de fluorescencia de xenón a una potencia del 30% y una cámara de epifluorescencia. Supervise la forma y la morfología de la capa HUVEC con el modo de campo brillante para seleccionar celdas representativas adecuadas para la visualización de cadenas VWF.
4. Para la visualización de cadenas VWF fluorescentes verdes, seleccione un objetivo de aceite de 63x/1.40 y un filtro de detección de 470 nm en el menú de la unidad de fluorescencia del software del microscopio (LasX). Cree instantáneas de pilas Z de al menos 50 vistas de campo representativas, cada una de las cuales contiene aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactos. Para la cuantificación de las cadenas VWF fluorescentes verdes en diferentes puntos de tiempo, escanee varios campos de visión.

5. Evaluación microscópica del apego bacteriano a las cuerdas VWF en el flujo en tiempo real

1. Cuantifique la unión neumocócica a las cadenas VWF generadas en superficies celulares HUVEC mediante la detección de inmunofluorescencia.
   1. Sostenga el flujo e inyecte 1,35 x 10⁸ CFU/mL RFP-expressing neumococci en un volumen máximo de 1 ml en el medio ECGMS utilizando el puerto de inyección. Alternativamente, pipetear las bacterias en el medio en el depósito de la bomba. Reinicie la tensión de cizallamiento a 10 dyn/cm² para dejar que las bacterias circulen dentro del sistema de la bomba.
   2. Seleccione un objetivo de inmersión en aceite de 63x para el aumento del microscopio y ajuste los ajustes del filtro de fluorescencia en el software del microscopio al canal RFP (filtro de detección de 540 nm) para la detección de neumococos que expresan RFP.
   3. Para la cuantificación de la fijación bacteriana a las cadenas VWF, detenga el flujo y cree instantáneas de pilas Z de al menos 30 vistas de campo representativas, cada una con aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactas, y cuente la cantidad de neumococos.
   4. Utilice el algoritmo de estadísticas unifactoriales de ANOVA para evaluar los datos, seguido de una prueba de muestra no emparejada de dos colas post hoc para una comparación estadística detallada. Los valores P de <0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

6. Evaluación microscópica del apego bacteriano a las cuerdas VWF después de la fijación de la muestra

1. Muestree la fijación antes de la tinción de inmunofluorescencia.
   1. Detenga el flujo, retire 10 ml de ECGMS-medio de los depósitos de la bomba, y agregue 10 mL de PBS complementado con 5% de paraformaldehído (PFA). Deje que la solución pfA circule durante 10 minutos a una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm².
   2. Desconecte la diapositiva del canal de la unidad de bomba.
2. Bloquear sitios de unión inespecíficos en la superficie celular y realizar la inmunodetección de las cuerdas del VWF y las bacterias unidas.
   1. Preparar 4 ml de una solución de lavado que contenga 100 mM Na₂CO₃ (pH 9.2) suplementada con 4% de sacarosa para todos los pasos de lavado. Preparar 1 ml de una solución de bloqueo que contenga 100 mM Na₂CO₃ (pH 9.2) complementada con 4% de sacarosa y 2% de albúmina sérica bovina (BSA) para el bloqueo de sitios de unión inespecíficos.
   2. Lave la corredera de canal incubada por PFA 3x utilizando una jeringa Luer de 1 ml para inyectar 200 ml de la solución de lavado e incubar la corredera durante 120 minutos a RT con una solución de bloqueo de 200 ml.
   3. Preparar 4 ml de otra solución de bloqueo que contenga 100 mM Na₂CO₃, (pH 9.2) complementado con 4% de sacarosa y 0,5% de BSA para la dilución de los anticuerpos. Utilice 200 l de esta solución de bloqueo para diluir el antisuero de conejo específico del neumococo 1:100. Utilice 200 ml de esta solución de bloqueo para diluir el anticuerpo de ratón específico de VWF 1:50 para realizar una concentración de anticuerpos específica de VWF de 4 g/ml. Diluir el anticuerpo secundario conjugado AlexaFluor488 a partir de una solución de 2 mg/ml 1:100 en 200 ml de PBS (pH 7.4) para generar una concentración final de 20 g/ml.
      NOTA: En los ajustes de inmunofluorescencia descritos, la detección de anticuerpos proporcionó resultados óptimos cuando los anticuerpos se diluyeron en el tampón de carbonato alcalino antes mencionado. Según los resultados anteriores, las soluciones de bloqueo recomendadas y la cantidad de anticuerpos son adecuadas para muchas aplicaciones. Sin embargo, diferentes experimentos pueden requerir la optimización individual de la combinación de anticuerpos, la concentración de anticuerpos, el tiempo de incubación y la constitución del búfer de bloqueo. Como alternativa, un sistema con búfer de fosfato con un rango de pH neutro podría ser adecuado o incluso preferir como tampón de incubación. En caso de señales de fluorescencia débiles, se debe aumentar la concentración de anticuerpos secundarios. Si se detecta demasiado ruido de fondo de fluorescencia inespecífico, se debe aumentar la cantidad de sustancias de bloqueo.
   4. Para la tinción de VWF-inmunofluorescencia, lave el portaobjetos con una jeringa Luer de 1 ml inyectando 200 ml de la solución de lavado 3x e incubar el portaobjetos con el anticuerpo específico para VWF diluido de 1:50 durante 30 minutos a RT. L de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con el anticuerpo específico del ratón conjugado AlexaFluor488 diluido de 1:100 durante 30 min a RT. Por último, lave la corredera de nuevo 3x con 200 sl de la solución de lavado.
      NOTA: Los fluoróforos AlexaFluor son sensibles al blanqueo. Por lo tanto, la diapositiva debe protegerse manteniéndola en una cámara oscura durante los pasos de incubación con los anticuerpos conjugados con fluoróforo.
   5. Para la inmunodetección de los neumococos, incubar el portaobjetos con un anticuerpo de conejo específico para neumococo diluido de 1:100 durante 30 min a RT. Después, lave el portaobjetos 3x con 200 ml de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con 1:100 diluido AlexaFluor568 conjugado anticuerpo específico de conejo durante 30 minutos en RT. Lavar la diapositiva del canal de nuevo 3x con 200 l de la solución de lavado.
   6. Para manchar el citoesqueleto de actina celular con faloidina fluorescente, permeabilizar el HUVEC por incubación con 120 ol de 0,1% Triton X-100 durante 5 min en RT. Lavar la diapositiva del canal 3x con 200 ol de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con 120 ol de 1:1.000 diluido AlexaFluor350-faloidin conjugado. Este paso de incubación visualizará el citoesqueleto de actina polimerizada y permitirá el monitoreo de la forma celular y posibles cambios morfológicos inducidos por el estrés.
   7. Lavar la corredera de canal 3x con 200 sL de la solución de lavado. Por último, lave la corredera 4x con 200 l ddH₂O y visualice las cuerdas fluorescentes verdes VWF, las bacterias fluorescentes rojas y el citoesqueleto de actina fluorescente azul utilizando los ajustes de filtro adecuados en el microscopio de fluorescencia.

Resultados

El cultivo de HUVEC primario en un flujo unidireccional constante da como resultado la formación de una capa celular confluente y estrechamente embalada que promueve la generación de WPB celulares llenos del VWF^{13mecanosensible,14}. Este protocolo describe el uso de un sistema de recirculación sin pulso basado en bomba de presión de aire para el análisis de infecciones que requiere imitar la situación de tensión de cizallamiento en el flujo sanguíneo humano.

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Discusión

La simulación de la interacción bacteriana con proteínas huésped sensibles al mecanosensible como el VWF requiere un sistema de cultivo celular perfundible que permita la generación de un flujo definido, unidireccional y continuo de líquidos, generando así un flujo confiable de tensión de cizallamiento . Ya se han descrito varios sistemas de bombas microfluídicas. Una revisión exhaustiva de Bergmann et al. resume los aspectos clave de los diferentes modelos de cultivo celular bidimensional y tridimensional

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL de jeringa Luer	Fisher Scientific 10303002		con un volumen de 1 mL para inyección de gelatina mediante la conexión Luer de los portaobjetos
mL de jeringa Luer	Sarstedt	9077136	Para el desprendimiento/inyección de fluidos en las conexiones luer de los portaobjetos de la cámara de canales
Accutase	eBioscience ahora Thermo Fisher	00-4555-56	Mezcla de proteasas utilizada para el desprendimiento suave de células endoteliales
AlexaFluor350-faloidina conjugada	Abcam	ab176751	sin concentración disponible del fabricante, la solución madre es suficiente para 300 tets, la compañía recomienda usar 100 µ L de una dilución 1:1.000, fluorescencia azul (ajustes de filtro DAPI)
Anticuerpo anti-ratón derivado de cabra conjugado con AlexaFluor488	Thermo Fisher Sientific	A11001	: 2 mg/mL para la inmunotinción de VWF humano en portaobjetos microfluídicos después de la fijación de PFA, fluorescencia verde
AlexaFluor568-anticuerpo anti-conejo derivado de cabra conjugado	Thermo Fisher Scientific	A-11011	concentración de existencias: 2 mg/mL para la inmunotinción de neumococos en portaobjetos microfluídicos después de la fijación de pFA, fluorescencia roja
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	medio de cultivo bacteriano complejo
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilizado, para la preparación de tampón de bloqueo
Matraces de cultivo celular con filtro	TPP	90026	subcultivo de HUVEC en matraces de cultivo celular no recubiertos de 25 cm2
Centrífuga Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	centrifugado de bacterias (volúmenes de >2mL)
Centrífuga Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	centrifugado de células eucariotas
Centrífuga Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	centrifugación de bacterias (volúmenes inferiores a 2 mL)
Cloranfenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	utilizado en una concentración de 0,2 mg/mL para el cultivo de neumococos transformados con una construcción genética portadora de proteína fluorescente roja y casete de resistencia al cloranfenicol
Abrazadera para tubo de perfusión	ibidi	10821	para retener el líquido en el tubo antes de conectar la corredera al sistema de bombeo
Incubadora 2	Fisher Scientific	MIDI 40	se adapta perfectamente al tamaño de la unidad de fluidos con corredera de canal conectada y se utilizó para el cultivo de flujo a 37 &° C y 5% CO2
CO2 Incubadora	Sanyo	MCO-18 AIC	para la incubación de bacterias y células en una atmósfera definida al 5% de CO2 y 37 & grados;
Placas de agar sangre C Colombia	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	medio de cultivo complejo a base de agar para S. pneumoniae suplementado con un 7% de sangre de oveja
Ordenador	Dell Latitude	3440	Comuter con software de bomba
de presión Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)	Leica	DMi8	Un microscopio inverso con una platina cubierta por una cámara calefactable y con una unidad de fluorescencia equipada con filtro de fluorescencia, fuente de luz de xenón (SP8, DMi8) y DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 megapíxeles)
Di Fosfato de hidrógeno de potasio (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	utilizado para el tampón PBS
Material de secado	Merck	101969	perlas de sílice de naranja para el secado utilizadas en una botella de vidrio con un adaptador de tubo
Mezcla de suplemento ECGM	Promocell	C-39215	mezcla de suplementos para ECGM -medio, requerido para el precultivo de células endoteliales: 0,02 mL/mL Suero fetal de ternero, 0,004 mL/mL suplemento de crecimiento de células endoteliales, 0,1 ng/mL factor de crecimiento epidérmico, 1 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos, 90 y micro; g/mL de heparina, 1 y micro; g/mL de hidrocortisona
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM suplementado con 5 % [p/p] de FCS y 1 mM de MgSO4 para aumentar la adhesión celular
Medio de crecimiento de células endoteliales (ECGM, listo para usar)	Promocell	C-22010	medio de cultivo de HUVECs, ya complementado con todos los componentes de la mezcla de suplementos
Suero de ternero fetal (FCS)	biocromo ahora Merck	S 0415	Suplemento para cultivo celular, utilizado para análisis de infecciones
conjugada por FITC anticuerpo anti-FWW humano	Abcam	ab8822	concentración de existencias: 10 mg/mL, para la inmunodetección de FVW globular y multimerizado en flujo
Unidad de fluidos	ibidi	10903	unidad de fluidos para cultivo de flujo Gelatina
(porcina)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	para el prerecubrimiento de la superficie del canal de microdeslizamiento
Dihidrocloruro de histamina	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	para la inducción de la secreción de VWF de los cuerpos endoteliales de Weibel Palade
Cell Célula endotelial de la vena umbilical humana (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lote-Nr. 396Z042	células endoteliales primarias de un donante agrupado, almacenadas criconservadas en nitrógeno líquido
Anticuerpo humano específico contra el FVW derivado de ratón (monoclonal)	Santa Cruz	SC73268	concentración de existencias: 200 y micro; g/mL para la inmunotinción de VWF en portaobjetos microfluídicos después de la fijación de PFA
Puerto de inyección	ibidi	10820	para la inyección de histamina o bacterias en el tubo del depósito durante la circulación de flujo
Microscopio óptico	Zeiss	Axiovert 35M	Microscopio óptico inverso para el control de la eliminación y recuento de células eucariotas utilizando un objetivo de agua de 40x que permite un aumento
de 400xLuer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	portaobjetos modificados físicamente para el cultivo fludic (μ – Corredera I0,4Luer con una altura de canal de 0,4 mm, un volumen de canal de 100 μ L, un área de crecimiento de 2,5 cm y un área de recubrimiento de 25,4 cm2) Adecuado para todo tipo de ensayos de flujo, el tratamiento físico genera una superficie hidrófila y adhesiva.
Sulfato de magnesio (MgSO4, sin hidratar)	Sigma Aldrich	M7506-500G	Para la preparación del medio ECGMS
Bomba microfluídica	ibidi	10905	bomba de presión de aire
celdas Neubauer	Karl Hecht GmbH& Co KG	40442002	cámara de recuento microscópica para HUVEC
Paraformaldehído 16% (PFA)	Microscopía electrónica Sciences	15710-S	para la reticulación de muestras
Set de perfusión	ibidi	10964	El Set de Perfusión Amarillo/Verde tiene un diámetro de tubo de 1,6 mm, una longitud de tubo de 50 cm, un volumen total de trabajo de 13,6 mL, un volumen de tubo muerto de 2,8 mL y un tamaño de depósito de 10 mL. combinado con el µ-slide L0.4Luer, a 37 ° C y una viscosidad de 0,0072 dyn x s/cm2 se puede alcanzar un rango de caudal de 3,8 mL/min hasta 33,9 mL/min y un esfuerzo cortante entre 3,5 dyn/cm2 y 31,2 dyn/cm2. con una longitud de 50 cm para
solución salina tamponada con fosfato microfluídico (PBS),			la solución se preparó utilizando los siguientes productos químicos: 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 , pH 7,4
Cubetas de plástico	Sarstedt	67.741	(2 x ópticas) para la medición de OD a 600 nm
Antisuero específico contra el neumococo	Pineda		criado en conejo utilizando Streptococcus pneumoniae NCTC10319 y D39 inactivados por calor, purificados con IgG utilizando la columna de proteína-sepharose.
		poliestireno o espuma de poliestireno	: esta es una medida de precaución para evitar el estrés por frío en las células sembradas en los portaobjetos del canal. Se puede utilizar cualquier tipo de espuma de poliestireno, como el material de la caja de embalaje. El plato puede tener un grosor de 0,5 cm y debe tener un tamaño de 20 cm2.
Cloruro de potasio (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	utilizado para el tampón PBS
Software de control de bombas (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Software informático para el control de la bomba de presión, el ajuste de las condiciones de caudal y el inicio/fin del caudal
Tubos de reacción 1,5/2,0 mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	necesarios para diluciones de anticuerpos
Tubos de reacción con 50 mL volumen	Sarstedt	6,25,48,004
Neumococos que expresan RFP	Colección Nacional de Cultivos Tipo, Salud Pública Inglaterra	10,319	Streptococcus pneumoniae serotipo 47 que expresa RFP fusionado con una proteína similar a la ahistona integrada en el genoma
Pipetas serológicas 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	para pipetear volúmenes
más grandesCarbonato de sodio (Na2CO3, sin agua)	Sigma Aldrich	451614-25G	para la preparación de 100 mM tampón de carbonato de sodio
Dihidrógeno fosfato (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	utilizado para el tampón PBS
Fotómetro espectral Libra S22	Biochrom	80-2115-20	medición de la densidad óptica (OD) de la suspensión bacteriana a 600 nm
Sacarosa	Sigma Aldrich	S0389-500G	para la preparación de tampón de bloqueo
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Utilizado en una concentración final del 0,1% diluido en dH20 para la permeabilización de células eucariotas después de la fijación de PFA
Extracto de levadura	oxoide	LP0021	las bacterias se cultivan en el suplemento THB con 1% [p/p] de extracto de levadura = medio de cultivo bacteriano completo THY