Este artículo describe un método para cultivar y analizar los crecimientos de células epiteliales parietales glollares de glomérulos encapsulados aislados del riñón de ratón. Este método se puede utilizar para estudiar las vías implicadas en la proliferación y migración de células epiteliales parietales.
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Artículo de método
Crecimiento glomerular como ensayo ex vivo para analizar las rutas involucradas en la activación de células epiteliales parietales
En este artículo
Resumen
Resumen
La activación de la célula epitelial parietal (PEC) es uno de los factores clave involucrados en el desarrollo y progresión de la glomerulosclerosis. Por lo tanto, la inhibición de las vías implicadas en la activación de células epiteliales parietales podría ser una herramienta para atenuar la progresión de las enfermedades glomerulares. Este artículo describe un método para cultivar y analizar el crecimiento de células epiteliales parietales de glomérulos encapsulados aislados del riñón de ratón. Después de diseccionar los riñones aislados de ratón, el tejido se pica, y los glomérulos se aíslan por tamizado. Se recogen glomérulos encapsulados, y se cultivan 6 días para obtener el crecimiento glomerular de células epiteliales parietales. Durante este período, la proliferación y migración de células epiteliales parietales se puede analizar determinando el número de célula o el área de superficie de las células que crecen. Por lo tanto, este ensayo puede utilizarse como herramienta para estudiar los efectos de una expresión génica alterada en ratones transgénicos o noqueadores o los efectos de las condiciones de cultivo en las características de crecimiento y señalización de células epiteliales parietales. Utilizando este método, se pueden estudiar vías importantes implicadas en el proceso de activación celular epitelial parietal y, en consecuencia, en la glomerulosclerosis.
Introducción
Las enfermedades glomerulares son un grupo importante de trastornos renales y representan una de las principales causas de la enfermedad renal terminal(ESRD). Desafortunadamente, las opciones de tratamiento específicas son limitadas y la progresión a la ESRD es inevitable. Las enfermedades glomerulares se definen por la presencia de lesiones glomerulares y pueden agruparse en enfermedades inflamatorias y no inflamatorias. Aunque el insulto inicial es diferente, estudios recientes han demostrado que un mecanismo celular común conduce a la hiperplasia celular epitelial glomerular y, en última instancia, a la glomerulosclerosis en todas las enfermedades glomerulares, independientemente de la causa subyacente1,,2,,3,4.
Específicamente, se demostró que las lesiones glomeruloscleróticas se componen principalmente de células epiteliales parietales activadas5,6. En condiciones fisiológicas, las células epiteliales parietales son células epiteliales en reposo planas que recubren la cápsula del Bowman del glomerulo. Sin embargo, cualquier lesión glomerular ya sea debido a mutaciones genéticas (por ejemplo, citopatías de podocitos específicos o mitocondriales), inflamación o hiperfiltración (por ejemplo, causada por la reducción de la masa renal, hipertensión, obesidad o mellitus diabético) puede desencadenar la activación de células epiteliales parietales. Las células epiteliales parietales activadas proliferan y depositan matriz extracelular que resulta en la formación de media lunas celulares o lesiones escleróticas5,7,8. La progresión de estos procesos da lugar a la pérdida de la función renal9. Por lo tanto, la activación celular epitelial parietal es un factor clave en el desarrollo y progresión de la glomerulosclerosis tanto en enfermedades glomerulares inflamatorias como no inflamatorias1,,2,,3,,4,,10.
Los procesos moleculares que median la activación de células epiteliales parietales son aún desconocidos en gran medida. Estudios recientes muestran que las células epiteliales parietales activadas de novo express CD44, un receptor que es importante para la activación de diferentes vías implicadas en la proliferación celular y la migración. Además, se demostró que la inhibición de CD44 inhibe la activación de células epiteliales parietales y atenúa la progresión de la formación de media luna y la glomerulosclerosis en modelos animales de enfermedades glomerulares inflamatorias y no inflamatorias11,12.
Como la activación de células epiteliales parietales es un actor clave para el desarrollo de la glomerulosclerosis y la formación de media luna, la inhibición de estas células podría ralentizar la progresión de las enfermedades glomerulares. La elucidación de las vías moleculares que impulsan la activación celular epitelial parietal puede conducir al desarrollo de intervenciones terapéuticas específicas que atenúen la formación de lesiones hiperplásicas y glomeruloscleróticas en la enfermedad glomerular.
En modelos animales experimentales, con frecuencia es difícil proporcionar evidencia para un efecto directo de una expresión génica alterada (modelos de eliminación o modelos de ratón transgénicos) o tratamiento farmacológico en las células epiteliales parietales. En un ratón noqueado convencional, los cambios in vivo observados podrían explicarse por cambios directos en las células epiteliales parietales. Sin embargo, dado que la expresión génica también se altera en otros tipos de células dentro del ratón, no se pueden excluir los efectos indirectos mediados por otros tipos de células. El desarrollo de ratones cre-lox condicionales impulsados por promotores principalmente activos en células epiteliales parietales ha proporcionado una solución en algunos casos13. Sin embargo, los modelos transgénicos condicionales son complejos y aunque hay más líneas condicionales disponibles, para muchas de las líneas convencionales de ratón noqueado o transgénico aún no hay un sustituto condicional.
Para estudiar los efectos directos sobre las células epiteliales parietales, nuestro grupo ha desarrollado un ensayo ex vivo utilizando glomérulos encapsulados aislados de los riñones de ratón para medir y analizar la proliferación y migración de células epiteliales parietales. Este método nos permitirá determinar los efectos específicos de las células epiteliales parietales y encontrar vías responsables para la activación de células epiteliales parietales y probar opciones de tratamiento para inhibir esta activación.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Etica Animal de la Universidad Radboud Nijmegen.
NOTA: Los ratones no tratados de tipo salvaje sano (WT) (n.o 4) y los ratones cd44-/- (n x 4) fueron sacrificados a la edad de 12 a 16 semanas. Se utilizaron ratones machos y hembras. Todos los ratones estaban en el fondo C57Bl/6.
1. Disección renal de ratón
- Sacrificar ratones WT sanos o ratones genéticamente alterados por luxación cervical.
- Diseccione los riñones enteros del ratón directamente después de sacrificar los ratones. Para ello, realizar una laparotomía mediana usando tijeras abdominales, cortando la piel y luego los músculos abdominales. Retire el intestino y colóquelo junto al ratón.
- Libera los riñones del tejido de conexión y extrae el riñón usando fórceps quirúrgicos, cortando la arteria renal, la vena renal y el uréter con tijeras.
- Retire las cápsulas renales de los riñones sosteniendo el riñón con fórceps quirúrgicos y tire de la cápsula usando otro par de fórceps.
- Coloque los riñones en una placa de cultivo celular de 6 pozos (2 riñones/pozo) preparada con 2 ml de solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS) por pozo y colóquela en hielo.
2. Aislamiento de glomérulos por riñón de ratón
- Transfiera los riñones a una placa Petri de 100 mm y pica los riñones en trozos pequeños de 1 x 2 mm usando dos bisturíes. Mantenga las piezas renales picadas húmedas usando 1 x 2 ml de HBSS.
- Coloque las piezas renales picadas en la parte superior de un tamiz metálico de 300 m y presione el riñón a través del tamiz con un émbolo de una jeringa de 20 ml. Enjuague repetidamente el tamiz con HBSS en el medio y recoja el flujo a través en un plato limpio de Petri usando un pipeteo serológico. Recoger también todo lo que queda / se pega a la parte inferior del tamiz raspándolo con el bisturí y transferirlo al flujo recogido a través (homogeneizar riñón).
- Enjuagar el color de los riñones a través de un tamiz de 75 m con HBSS. Recoger el flujo a través y posteriormente enjuagar este flujo a través de un tamiz de 53 m. Lave ambos tamices con HBSS para eliminar todas las estructuras más pequeñas.
NOTA: En este paso, el flujo-aunque sólo se enjuaga pero no se presiona a través del tamiz de 75 y 53 m. El lavado con HBSS es necesario para eliminar los desechos y las estructuras más pequeñas en los tamices. Por lo tanto, normalmente se utilizan 200 a 300 ml de HBSS en total. - Recoger las estructuras/materiales renales que permanecen en el tamiz de 75 y 53 m lavando la superficie superior de los tamices con el medio de Aguirute modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 20% de suero de ternero fetal (FCS) y transferir el material a una microplaca de unión ultrabajo de 6 pocillos.
NOTA: Para lavar la superficie superior del tamiz, enjuague el tamiz en una posición inclinada (>45o) y recoja el material renal en el borde del tamiz. El material recogido se enriquece para glomérulos encapsulados y decapsulados, mostrando sólo unos pocos fragmentos tubulares. Los glomérulos encapsulados son muy pegajosos. Por lo tanto, para recoger glomérulos individuales, es importante evitar que los glomérulos se adhieran a la superficie de un plato o plato de pozo De Petri. Para evitar la adherencia, utilice el medio con 20% FCS y utilice placas de fijación ultrabajos para este paso.
3. Cultivo del crecimiento glomerular
- Lleve la microplaca de fijación ultrabajo a un microscopio de luz invertido y recoja glomérulos encapsulados y/o decapsulados con una pipeta de 20 l. Evite pipetear otras estructuras y escombros. Después de recoger un solo glomerulo en la punta de la pipeta, agregue un medio DMEM fresco sin material renal recogido en la misma punta de pipeta a un volumen de 20 l.
- Transfiera el glomerulo único con el medio DMEM de 20 l al centro de un pocero de una placa de cultivo celular de 24 pocillos e incubar durante 3 h a 37 oC y 5% (v/v) CO2 para permitir la fijación del glomerero al centro del pozo. Mueva cuidadosamente la placa para evitar flotar del glomérulo a los embarques del pozo.
- Después de 3 h de incubación, el glomérulo se une al centro del pozo. Agregue cuidadosamente 500 l de medio basal endotelial (EBM) complementado con un kit de factor de crecimiento que contenga hidrocortisona, factor de crecimiento endotelial humano, extracto cerebral bovino y gentamicina sulfato-anfotericina B(Tabla de Materiales)y 5% (v/v) adicional FBS y 1% (v/v) penicilina/estreptocecina (pluma/estreptocipto) a cada pozo.
- Cultivar los glomérulos individuales durante 6 días a 37oC, 5% (v/v) CO2.
NOTA: Dentro de 6 días se forma el crecimiento que consiste en células epiteliales parietales. Si uno tiene como objetivo probar los efectos de compuestos específicos o fármacos en las células epiteliales parietales se debe añadir al medio dentro de este período de seis días.
4. Análisis de la proliferación de células epiteliales parietales
- Analice el crecimiento glomerular después de 6 días. Tome imágenes microscópicas con un microscopio de luz digital invertido.
- Utilice un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ/FIJI) para determinar el área de superficie y el diámetro del crecimiento glomerular, y el número de células que crecen o glomérulos.
- Para determinar el área de superficie del crecimiento glomerular, abra el tif. archivo del crecimiento glomerular con la barra de escala en ImageJ. Dibuje una línea recta en la barra de escala y determine la distancia en píxeles haciendo clic en analizar y medir (por ejemplo, 1 mm a 460 píxeles).
- Determine la escala haciendo clic en analizar,establecer escala y escribir la distancia conocida en píxeles (por ejemplo, 460), también escriba la distancia conocida (por ejemplo, 1) y la unidad de longitud (por ejemplo, 1 mm). Haga clic en Aceptar.
- Determine qué resultados se mostrarán en la tabla de resultados haciendo clic en analizar y, a continuación, establecer las mediciones. Para determinar el área de superficie del crecimiento glomerular, active el área de opciones y la etiqueta de visualización. Haga clic en Aceptar.
- Para determinar el área de superficie del crecimiento glomerular, dibuje una selección a mano alzada alrededor del crecimiento glomerular. Haga clic en analizar y luego medir, aparecerá una tabla de resultados en ImageJ que muestra el área de superficie del crecimiento en la escala determinada anteriormente (consulte el paso 4.4, por ejemplo, mm2).
5. Caracterización del crecimiento celular glomerular
NOTA: Para evaluar la composición celular del crecimiento, la tinción de inmunofluorescencia para marcadores específicos de la célula se realiza en los crecimientos glomerulares en t a 6 días.
- Retire cuidadosamente el medio y lave suavemente los glomérulos dos veces con solución salina tamponada por fosfato (PBS).
- Fijar durante 10 min a temperatura ambiente usando 2% (p/v) paraformaldehído (PFA) complementado con sacarosa del 4% (p/v) en PBS y lavar cuidadosamente 2x usando PBS.
- Incubar con el anticuerpo primario con la concentración adecuada(Tabla de materiales)diluido en albúmina sérica PBS-ovina (BSA) 1% (v/v) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Retire la solución de anticuerpos y lave cuidadosamente 3x con PBS.
- Incubar con anticuerpos secundarios (Tabla de Materiales) diluidos en PBS-BSA 1% (v/v) en la oscuridad durante 45 min a temperatura ambiente.
- Lave cuidadosamente 3x con PBS y monte usando 1 x 2 gotas de medio de montaje acuoso con 4o,6-diamidino-2-fenilindondole (DAPI) para visualizar los núcleos y cubrir el pozo con un resbalón redondo de la cubierta.
- Tome imágenes microscópicas con un microscopio fluorescente.
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Resultados
En la Figura 1se muestra un diagrama sistemático del método para realizar el ensayo de crecimiento glomerular. La Figura 2A-D muestra los crecimientos glomerulares de glomérulos encapsulados en diferentes puntos de tiempo como se observa mediante microscopía de luz. Los crecimientos se muestran en los días 2, 4 y 6(Figura 2B-D) en el cultivo después del aislamiento d...
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Discusión
Usando el protocolo descrito en este artículo, se puede utilizar glomérulos encapsulados individuales para evaluar la proliferación de células epiteliales parietales que es una consecuencia de la activación de células epiteliales parietales. Este modelo ex vivo nos permitirá estudiar en detalle las vías moleculares, que intervienen en la activación de células epiteliales parietales. El método descrito se basa en el concepto simple de disección renal y tamizado para aislar y cultivar glomérulos encapsulados y comparar la ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por la Fundación Riñón Holandesa (concesión 14A3D104) y la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (subvención NWO VIDI: 016.156.363).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo celular de 24 pocillos | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Marcador de células endoteliales (concentración utilizada 1:200) | |
| pollo-anti-ratas Alexa 647 | Thermo Fisher | ( concentración utilizada 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Medio de montaje que contiene DAPI | |
| Microscopio de luz invertida digital | Westburg, EVOS microscopio | ||
| burro-anti-cabra Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentración utilizada 1:200) | |
| burro-anti-conejo Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentración utilizada 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit Lonza | que contiene hidrocortisona, hEGF, GA-1000, FBS y BBE | ||
| Suero fetal bovino | Lonza | ||
| Suero fetal de ternero | Lonza | ||
| Microscopio fluorescente | Leica Microsystems GmbH | ||
| cabra-anti-sinaptopodina | Santa Cruz | Marcador de podocitos (concentración utilizada 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| placa de Petri | Sarstedt | tamaño 100 | |
| conejo-anti-claudina1 | Abcam | Marcador de células epiteliales parietales (concentración utilizada 1:100) | |
| conejo-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, EE. UU | . amablemente proporcionado por el Dr. E. Gelman, Marcador | |
| rata-anti-CD44 | BD Pharmingen | Marcador de células epiteliales parietales (concentración utilizada 1:200) | |
| bisturí | Dahlhausen | tamaño 10 | |
| Tamices | Endecotts Ltd | tamaño 300 y micro; m, 75 y micro; m, 53 y micro; m, | |
| BD Plastipak | tamaño: 20 ml | ||
| Microplacas de fijación ultrabaja | Placas Corning Costar | de 6 pocillos |
Referencias
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