Este artículo describe un método para cultivar y analizar los crecimientos de células epiteliales parietales glollares de glomérulos encapsulados aislados del riñón de ratón. Este método se puede utilizar para estudiar las vías implicadas en la proliferación y migración de células epiteliales parietales.
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Artículo de método
Crecimiento glomerular como ensayo ex vivo para analizar las rutas involucradas en la activación de células epiteliales parietales
En este artículo
Resumen
Resumen
La activación de la célula epitelial parietal (PEC) es uno de los factores clave involucrados en el desarrollo y progresión de la glomerulosclerosis. Por lo tanto, la inhibición de las vías implicadas en la activación de células epiteliales parietales podría ser una herramienta para atenuar la progresión de las enfermedades glomerulares. Este artículo describe un método para cultivar y analizar el crecimiento de células epiteliales parietales de glomérulos encapsulados aislados del riñón de ratón. Después de diseccionar los riñones aislados de ratón, el tejido se pica, y los glomérulos se aíslan por tamizado. Se recogen glomérulos encapsulados, y se cultivan 6 días para obtener el crecimiento glomerular de células epiteliales parietales. Durante este período, la proliferación y migración de células epiteliales parietales se puede analizar determinando el número de célula o el área de superficie de las células que crecen. Por lo tanto, este ensayo puede utilizarse como herramienta para estudiar los efectos de una expresión génica alterada en ratones transgénicos o noqueadores o los efectos de las condiciones de cultivo en las características de crecimiento y señalización de células epiteliales parietales. Utilizando este método, se pueden estudiar vías importantes implicadas en el proceso de activación celular epitelial parietal y, en consecuencia, en la glomerulosclerosis.
Introducción
Las enfermedades glomerulares son un grupo importante de trastornos renales y representan una de las principales causas de la enfermedad renal terminal(ESRD). Desafortunadamente, las opciones de tratamiento específicas son limitadas y la progresión a la ESRD es inevitable. Las enfermedades glomerulares se definen por la presencia de lesiones glomerulares y pueden agruparse en enfermedades inflamatorias y no inflamatorias. Aunque el insulto inicial es diferente, estudios recientes han demostrado que un mecanismo celular común conduce a la hiperplasia celular epitelial glomerular y, en última instancia, a la glomerulosclerosis en todas las enfermedades glomerulares, ind....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Etica Animal de la Universidad Radboud Nijmegen.
NOTA: Los ratones no tratados de tipo salvaje sano (WT) (n.o 4) y los ratones cd44-/- (n x 4) fueron sacrificados a la edad de 12 a 16 semanas. Se utilizaron ratones machos y hembras. Todos los ratones estaban en el fondo C57Bl/6.
1. Disección renal de ratón
- Sacrificar ratones WT sanos o ratones genéticamente alterados por luxación cervical.
- Diseccione los riñones enteros del ratón directamente después de sacrificar los ratones. Para ello, rea....
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Resultados
En la Figura 1se muestra un diagrama sistemático del método para realizar el ensayo de crecimiento glomerular. La Figura 2A-D muestra los crecimientos glomerulares de glomérulos encapsulados en diferentes puntos de tiempo como se observa mediante microscopía de luz. Los crecimientos se muestran en los días 2, 4 y 6(Figura 2B-D) en el cultivo después del aislamiento d.......
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Discusión
Usando el protocolo descrito en este artículo, se puede utilizar glomérulos encapsulados individuales para evaluar la proliferación de células epiteliales parietales que es una consecuencia de la activación de células epiteliales parietales. Este modelo ex vivo nos permitirá estudiar en detalle las vías moleculares, que intervienen en la activación de células epiteliales parietales. El método descrito se basa en el concepto simple de disección renal y tamizado para aislar y cultivar glomérulos encapsulados y comparar la .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por la Fundación Riñón Holandesa (concesión 14A3D104) y la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (subvención NWO VIDI: 016.156.363).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo celular de 24 pocillos | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Marcador de células endoteliales (concentración utilizada 1:200) | |
| pollo-anti-ratas Alexa 647 | Thermo Fisher | ( concentración utilizada 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Medio de montaje que contiene DAPI | |
| Microscopio de luz invertida digital | Westburg, EVOS microscopio | ||
| burro-anti-cabra Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentración utilizada 1:200) | |
| burro-anti-conejo Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentración utilizada 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit Lonza | que contiene hidrocortisona, hEGF, GA-1000, FBS y BBE | ||
| Suero fetal bovino | Lonza | ||
| Suero fetal de ternero | Lonza | ||
| Microscopio fluorescente | Leica Microsystems GmbH | ||
| cabra-anti-sinaptopodina | Santa Cruz | Marcador de podocitos (concentración utilizada 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| placa de Petri | Sarstedt | tamaño 100 | |
| conejo-anti-claudina1 | Abcam | Marcador de células epiteliales parietales (concentración utilizada 1:100) | |
| conejo-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, EE. UU | . amablemente proporcionado por el Dr. E. Gelman, Marcador | |
| rata-anti-CD44 | BD Pharmingen | Marcador de células epiteliales parietales (concentración utilizada 1:200) | |
| bisturí | Dahlhausen | tamaño 10 | |
| Tamices | Endecotts Ltd | tamaño 300 y micro; m, 75 y micro; m, 53 y micro; m, | |
| BD Plastipak | tamaño: 20 ml | ||
| Microplacas de fijación ultrabaja | Placas Corning Costar | de 6 pocillos |
Referencias
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al.
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Reimpresiones y permisos
