Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Michael Vilkhovoy; David Dai; Sandra Vadhin; Abhinav Adhikari; Jeffrey D. Varner

doi:10.3791/60329

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Artículo de método

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

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DOI:

10.3791/60329

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25 de octubre de 2019

Michael Vilkhovoy¹ , David Dai¹ , Sandra Vadhin^*¹ , Abhinav Adhikari^*¹ , Jeffrey D. Varner¹

¹Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.

Resumen

La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es una tecnología emergente en sistemas y biología sintética para la producción in vitro de proteínas. Sin embargo, si CFPS va a ir más allá del laboratorio y convertirse en una tecnología de fabricación generalizada y estándar justo a tiempo, debemos entender los límites de rendimiento de estos sistemas. Hacia esta pregunta, desarrollamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en la glucólisis, la vía del fosfato de pentosa, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo energético y la regeneración cofactorente en las reacciones de CFPS. El método utiliza estándares internos etiquetados con ¹³C-anilina, mientras que los compuestos en la muestra se derivacon ¹²C-anilina. Las normas internas y la muestra se mezclaron y analizaron mediante cromatografía líquida en fase inversa-espectrometría de masas (LC/MS). La co-elución de compuestos eliminó la supresión iónial, permitiendo la cuantificación precisa de las concentraciones de metabolitos sobre 2-3 órdenes de magnitud donde el coeficiente de correlación promedio fue de 0,988. Cinco de los cuarenta compuestos no fueron etiquetados con anilina, sin embargo, todavía se detectaron en la muestra de CFPS y cuantificados con un método de curva estándar. La carrera cromatográfica tarda aproximadamente 10 minutos en completarse. En conjunto, desarrollamos un método rápido y robusto para separar y cuantificar con precisión 40 compuestos involucrados en CFPS en una sola ejecución de LC/MS. El método es un enfoque integral y preciso para caracterizar el metabolismo libre de células, de modo que, en última instancia, podamos comprender y mejorar el rendimiento, la productividad y la eficiencia energética de los sistemas libres de células.

Introducción

La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es una plataforma prometedora para la fabricación de proteínas y productos químicos, una aplicación que tradicionalmente se ha reservado para células vivas. Los sistemas libres de células se derivan de extractos de células brutas y eliminan las complicaciones asociadas con el crecimiento celular¹. Además, CFPS permite el acceso directo a metabolitos y la maquinaria biosintética sin la interferencia de una pared celular. Sin embargo, se ha escaso una comprensión fundamental de los límites de rendimiento de los procesos sin células. Los métodos de alto rendimiento para la cuantificación de metabolitos s....