Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.

Resumen

La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es una tecnología emergente en sistemas y biología sintética para la producción in vitro de proteínas. Sin embargo, si CFPS va a ir más allá del laboratorio y convertirse en una tecnología de fabricación generalizada y estándar justo a tiempo, debemos entender los límites de rendimiento de estos sistemas. Hacia esta pregunta, desarrollamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en la glucólisis, la vía del fosfato de pentosa, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo energético y la regeneración cofactorente en las reacciones de CFPS. El método utiliza estándares internos etiquetados con ¹³C-anilina, mientras que los compuestos en la muestra se derivacon ¹²C-anilina. Las normas internas y la muestra se mezclaron y analizaron mediante cromatografía líquida en fase inversa-espectrometría de masas (LC/MS). La co-elución de compuestos eliminó la supresión iónial, permitiendo la cuantificación precisa de las concentraciones de metabolitos sobre 2-3 órdenes de magnitud donde el coeficiente de correlación promedio fue de 0,988. Cinco de los cuarenta compuestos no fueron etiquetados con anilina, sin embargo, todavía se detectaron en la muestra de CFPS y cuantificados con un método de curva estándar. La carrera cromatográfica tarda aproximadamente 10 minutos en completarse. En conjunto, desarrollamos un método rápido y robusto para separar y cuantificar con precisión 40 compuestos involucrados en CFPS en una sola ejecución de LC/MS. El método es un enfoque integral y preciso para caracterizar el metabolismo libre de células, de modo que, en última instancia, podamos comprender y mejorar el rendimiento, la productividad y la eficiencia energética de los sistemas libres de células.

Introducción

La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es una plataforma prometedora para la fabricación de proteínas y productos químicos, una aplicación que tradicionalmente se ha reservado para células vivas. Los sistemas libres de células se derivan de extractos de células brutas y eliminan las complicaciones asociadas con el crecimiento celular¹. Además, CFPS permite el acceso directo a metabolitos y la maquinaria biosintética sin la interferencia de una pared celular. Sin embargo, se ha escaso una comprensión fundamental de los límites de rendimiento de los procesos sin células. Los métodos de alto rendimiento para la cuantificación de metabolitos son valiosos para la caracterización del metabolismo y son críticos para la construcción de modelos computacionales metabólicos^2,3,4. Los métodos comunes utilizados para determinar las concentraciones de metabolitos incluyen resonancia magnética nuclear (RMN), espectroscopia de infrarrojo sórdida transformación de Fourier (FT-IR), ensayos basados en enzimas y espectrometría de masas (MS)^{5,6,7 ,8}. Sin embargo, estos métodos a menudo están limitados por su incapacidad para medir eficientemente múltiples compuestos a la vez y a menudo requieren un tamaño de muestra mayor que las reacciones típicas libres de células. Por ejemplo, los ensayos basados en enzimas a menudo solo se pueden utilizar para cuantificar un solo compuesto en una carrera, y son limitados cuando el tamaño de la muestra es pequeño, como en las reacciones de síntesis de proteínas libres de células (normalmente se ejecutan en una escala de 10-15 l). Mientras tanto, la RMN requiere una gran abundancia de metabolitos para la detección y cuantificación⁵.  Hacia estas deficiencias, los métodos de cromatografía en conjunto con la espectrometría de masas (LC/MS) proporcionan varias ventajas, incluyendo alta sensibilidad y la capacidad de medir múltiples especies simultáneamente⁹; sin embargo, la complejidad analítica aumenta considerablemente con el número y la diversidad de especies que se miden. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos que se den cuenta plenamente del potencial de alto rendimiento de los sistemas LC/MS. Los compuestos de una muestra se separan mediante cromatografía líquida y se identifican mediante espectrometría de masas. La señal del compuesto depende de su concentración y eficiencia de ionización, donde la ionización puede variar entre compuestos y también puede depender de la matriz de muestra.

Lograr la misma eficiencia de ionización entre la muestra y los estándares es un desafío cuando se utiliza LC/MS para cuantificar analitos. Además, la cuantificación se vuelve más difícil con la diversidad de metabolitos debido a la división de señales y la heterogeneidad en la afinidad de protones y la polaridad^10. Por último, la matriz de co-elución de la muestra también puede afectar a las eficiencias de ionización de los compuestos. Para abordar estos problemas, los metabolitos pueden ser derivados químicamente, aumentando la resolución de separación y la sensibilidad de los sistemas LC/MS, al mismo tiempo que disminuyen la división de señal en algunos casos^10,11. La derivación química funciona etiquetando grupos funcionales específicos de metabolitos para ajustar sus propiedades físicas como la carga o la hidrofobicidad para aumentar la eficiencia de la ionización¹¹. Se pueden utilizar varios agentes de etiquetado para dirigirse a diferentes grupos funcionales (por ejemplo, aminas, hidroxilo, fosfatos, ácidos carboxílicos, etc.). Aniline, uno de estos agentes de derivación, se dirige a múltiples grupos funcionales a la vez, y añade un componente hidrófobo en moléculas hidrófilas, aumentando así su resolución de separación y señal¹². Para abordar el efecto de supresión de iones de matriz de elución conjunta, Yang y sus compañeros de trabajo desarrollaron una técnica basada en el etiquetado de la Tecnología Estándar Interna Específica del Grupo (GSIST) donde los estándares están etiquetados con ¹³isótopos de anilina C y se mezclan con la muestra ^12,13. El metabolito y el estándar interno correspondiente tienen la misma eficiencia de ionización, ya que co-eluto, y su relación de intensidad se puede utilizar para cuantificar la concentración en la muestra experimental.

En este estudio, desarrollamos un protocolo para detectar y cuantificar 40 compuestos involucrados en la glucólisis, la vía del fosfato de pentosa, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo energético y la regeneración cofactorente en las reacciones de CFPS. El método se basa en el enfoque GSIST, donde usamos ¹²C-anilina y ¹³C-anilina para etiquetar, detectar y cuantificar metabolitos utilizando LC/MS de fase inversa. El rango lineal de todos los compuestos abarcó 2-3 órdenes de magnitud con un coeficiente de correlación promedio de 0.988. Por lo tanto, el método es un enfoque robusto y preciso para interrogar el metabolismo libre de células, y posiblemente extractos de células enteras.

Protocolo

1. Preparación de reactivos para el etiquetado de anilina

1. Prepare una solución de anilina de 6 M a pH 4.5. Trabajando en una campana, combine 550 ml de anilina con 337,5 ml de agua de grado LCMS y 112,5 ml de ácido clorhídrico de 12 M (HCl) en un tubo de centrífuga. Vórtice bien y almacenar a 4oC.
   NOTA: La anilina se puede almacenar a 4 oC durante 2 meses.
   ADVERTENCIA: La anilina es altamente tóxica y debe trabajarse con ella en una campana de humos. El ácido clorhídrico es altamente corrosivo
2. Preparar una solución de anilina de 6 M ¹³C a pH 4.5. Combinar 250 mg de ¹³C₆-anilina con 132 ml de agua y 44 ml de 12 M HCl. Vortex bien y almacenar a 4 oC.
3. Preparar 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-etilcarbodiimide solución de clorhidrato (EDC). Disolver 2 mg de EDC en 10 ml de agua para cada muestra a etiquetar y vórtice bien.
   NOTA: La solución edC debe prepararse el mismo día de la reacción. EdC actúa como catalizador para la derivación de compuestos con anilina¹².

2. Preparación de normas

1. Hacer soluciones de stock separadas de todos los compuestos disueltos en agua de grado LC/MS (Tabla 1).
2. Preparación de la solución estándar interna
   1. Combine todos los compuestos excepto nicotinamida adenina dinucleótida (NAD), nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP), flavina adenina dinucleótido (FAD), coenzima aacetil A (ACA) y glicerol 3-fosfato (Gly3P), con los volúmenes adecuados para crear una solución de stock de 2 mM de todos los compuestos.
3. Combine NAD, NADP, FAD, ACA y Gly3P con los volúmenes adecuados para crear una solución de stock de 2 mM.

3. Preparación de la muestra(Figura 1)

1. Quench y precipitar las proteínas en una reacción de síntesis de proteínas libre de células mediante la adición de un volumen igual de etanol 100% helado a la reacción. Centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 15 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo.
   NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -80 oC en este punto y analizarse en un momento posterior

4. Reacción de etiquetado

1. Muestra de etiquetado con ¹²solución C-anilina
   1. Transfiera 6 l de muestra a un nuevo tubo centrífugo y lleve el volumen a 50 l conagua.
      NOTA: El tamaño de la muestra de volumen puede depender de la reacción específica de CFPS.
   2. Añadir 5 l de solución EDC de 200 mg/ml.
   3. Añadir 5 l de solución de ¹²C-anilina.
      NOTA: La solución de anilina se separa en dos fases. Mezclar bien antes de añadir a la reacción.
   4. Vórtice la reacción con agitación suave durante 2 h a temperatura ambiente.
   5. Después de 2 h, retire los tubos de la coctelera y agregue 1,5 ml de trietilamina (TEA) a la reacción en una campana de humo.
      NOTA: La trietilamina aumenta el pH de la solución que detiene la reacción de etiquetado de anilina y estabiliza los compuestos.
      ADVERTENCIA: La trietilamina es tóxica y causa irritación de los ojos y las vías respiratorias.
   6. Centrífuga a 13.500 x g durante 3 min.
2. Etiquetado de normas internas con ¹³solución C-aniline
   1. Diluir la solución de material interno a 80 m con un volumen final de 50 l.
      NOTA: La concentración de las normas internas se puede ajustar a niveles cercanos a la muestra experimental.
   2. Añadir 5 l de solución EDC de 200 mg/ml.
   3. Añadir 5 l de solución de ¹³C-anilina.
   4. Vórtice la reacción con agitación suave durante 2 h a temperatura ambiente.
   5. Después de 2 h, retire los tubos de la coctelera y agregue 1,5 ml de TEA a la reacción en una campana de humo.
   6. Centrífuga a 13.500 x g durante 3 min.
3. Combinación de estándar interno etiquetado y muestra etiquetada
   1. Mezclar 25 ml de muestra etiquetada con ¹²C-anilina con 25 ml de ¹³C-anilina etiquetada estándar.
   2. Transfiera a un vial de toma de muestras automático y analice mediante el procedimiento LC/MS.
4. Creación de una curva estándar para metabolitos sin etiquetar
   1. Solución en stock diluido de metabolitos sin etiquetar (NAD, NADP, FAD, ACA y Gly3P) a concentraciones finales de 320 m, 80 m, 20 m y 5 m con un volumen de 50 ml.
   2. Añadir 5 l de solución EDC de 200 mg/ml.
   3. Añadir 5 l de solución de ¹²C-anilina.
   4. Vórtice la reacción con agitación suave durante 2 h a temperatura ambiente.
   5. Después de 2 h, retire los tubos de la coctelera y agregue 1,5 ml de TEA a la reacción en una campana de humo.
   6. Centrífuga a 13.500 x g durante 3 min.
   7. Transfiera el sobrenadante a un vial de toma de muestras automático y analice mediante el procedimiento LC/MS.
      NOTA: Los metabolitos sin etiquetar siguen el mismo procedimiento que la muestra para replicar la matriz de muestra sin tener que mantener una eficiencia de ionización similar.

5. Configuración del procedimiento LC/MS

1. Preparación de disolventes
   1. Preparar 5 mM de tributilamina (TBA) solución acuosa ajustada a pH 4.75 con ácido acético.
      NOTA: TBA en la fase móvil ayuda a los analitos a lograr una buena resolución y separación^14.
   2. Preparar 5 mM TBA en acetonitrilo (ACN).
   3. Prepare el disolvente de lavado con 5% de agua y 95% de ACN.
   4. Prepare el disolvente de purga con 95% de agua y 5% de ACN.
2. Configuración de las condiciones de la EM
   1. Ajuste el espectrómetro de masas al modo iónico negativo con una temperatura de sonda de 520 oC, tensión capilar negativa de -0,8 kV, tensión capilar positiva de 0,8 kV y ajuste el software para que adquiera datos en 5 puntos/s.
   2. Ajuste las grabaciones iónicas seleccionadas (SIR) para cada metabolito con voltajes de cono especificados y valores de carga excesiva (m/z). Véase el Cuadro 1.
3. Inicialización de LC/MS de acuerdo con las instrucciones del fabricante
   1. Primeras líneas de disolvente en el gestor de disolventes durante 3 min.
   2. Disolvente de lavado de primera (5% agua, 95% ACN) y disolvente de purga (95% agua, 5% ACN) durante 15 s durante 5 ciclos.
   3. Establezca el gestor de muestras en 10 oC.
   4. Instale una columna C18 (1,7 m, 2,1 mm x 150 mm) e inicialice la columna con 100% de ACN a 0,3 ml/min durante 10 min.
   5. Acondicionar la columna al 95% de agua y al 5% de ACN a 0,3 ml/min durante 10 minutos antes de introducir disolventes con tampones.
   6. Acondicionar la columna al 95% disolvente A (5mM TBA acuoso, pH 4.75) y 5% disolvente B (5 mM TBA en ACN) a 0,3 ml/min durante 10 min.
   7. Establecer un protocolo de gradiente con la elución a partir del 95% del disolvente A y del 5% del disolvente B, elevado al 70% disolvente B en 10 min, elevado al 100% disolvente B en 2 min y mantenido al 100% disolvente B durante 3 min. , 5% disolvente B) durante 1 min y mantener durante 9 min para volver a equilibrar la columna.
   8. Acondicione la columna con el protocolo de degradado 3 veces antes de cualquier inyección en la columna.
4. Inyección de muestras y estándares
   1. Inyectar 5 l de la muestra en la columna y adquirir las intensidades de iones m/z adecuadas para la muestra etiquetada de ¹²C-anilina.
   2. Inyectar de nuevo 5 l de la misma muestra, pero esta vez adquiera las intensidades de iones m/z para los estándares etiquetados ^{con 13}C-anilina.
      NOTA: Nuestro sistema LC/MS no puede adquirir intensidades de ¹²C y ¹³C m/z en las ventanas de tiempo SIR especificadas, ya que es demasiados datos para adquirir en la ventana de tiempo especificada. Por lo tanto, inyectamos la misma muestra dos veces.
   3. Inyectar los estándares de metabolitos sin etiquetar de la concentración más baja a la más alta y registrar las intensidades de iones m/z apropiadas.

6. Cuantificación

1. Creación del método de exportación
   1. En el software de adquisición de datos, seleccione Archivo > Nuevo método > Métodode exportación .
   2. Especifique un nombre de archivo, como AnilineTagging_Date.
   3. Marque el archivo ASCII de la exportación y elija un directorio para exportar el archivo de texto a.
   4. En Tipo de informe, seleccione Resumen por todos.
   5. En Delimitadores, en Columna, seleccione un ,. En Fila, seleccione [cr][si].
   6. En Tabla, seleccione Exportar y, a continuación, Editar tabla para incluir SampleName, Area, Height, Amount y Units.
   7. Guardar método de exportación.
2. Cuantificación de metabolitos con estándares internos mediante software de adquisición de datos
   1. En la pestaña Conjuntos de muestras, haga clic con el botón derecho en la ejecución de LC/MS correspondiente y seleccione Ver como > Canales.
   2. Seleccione todos los canales SIR para los ¹³estándares internos de C-aniline de una inyección, haga clic con el botón derecho y seleccione Revisar.
   3. Si la ventana Diseño del método de procesamiento de LC no aparece automáticamente, vaya a Ver > Diseño de métodode procesamiento .
   4. En Diseño de métodode procesamiento , vaya a la pestaña Integración y establezca ApexTrack como algoritmo.
   5. Vaya a la pestaña Suavizado y establezca el tipo en Media y el nivel de suavizado en 13.
      NOTA: Se puede seleccionar cualquier nivel de suavizado, siempre y cuando sea coherente en todas las muestras.
   6. En la ficha Canal mS, deshabilite Procesamiento MS 3D .
   7. En la ventana del canal SIR, integre cada pico, un canal a la vez. Una vez que se integra un pico, vaya a Opciones > Rellenar desde resultado y los detalles del pico se rellenarán en la pestaña Componentes.
   8. Una vez evaluados todos los canales SIR, guarde el método de procesamiento y cierre la ventana.
   9. Seleccione todos los canales SIR de la muestra etiquetada ¹³C-aniline y ¹²C-aniline, haga clic con el botón derecho y seleccione Procesar.
   10. Active la casilla Proceso, seleccione Usar método de procesamiento especificadoy elija el método de procesamiento que acaba de guardar. Marque también la casilla Exportar, seleccione Usar método de exportación especificado y elija el método de exportación guardado creado anteriormente. Haga clic en Aceptar.
   11. Abra el archivo de texto exportado con Excel y calcule la concentración del compuesto desconocido utilizando:
       
       donde C_x,i es la concentración de la muestra desconocida para metabolito i, A_x,i es el área integrada del metabolito desconocido i, A_std,i es el área integrada del estándar interno de metabolito i, C_std,i es el concentración del estándar interno de metabolito i, y D es el factor de dilución.
3. Cuantificación de metabolitos sin etiquetar con curva estándar
   1. En la pestaña Conjuntos de muestras, haga clic con el botón derecho en la ejecución de LC/MS correspondiente y seleccione Ver como > Canales.
   2. Seleccione todos los canales SIR para los estándares sin etiquetar de una inyección, haga clic con el botón derecho y seleccione Revisar.
   3. Si la ventana Diseño del método de procesamiento de LC no aparece automáticamente, vaya a Ver > Diseño de métodode procesamiento .
   4. En Diseño del método de procesamiento, vaya a la pestaña Integración y establezca ApexTrack como algoritmo.
   5. Vaya a la pestaña Suavizado y establezca el tipo en Media y el nivel de suavizado en 13.
      NOTA: Se puede seleccionar cualquier nivel de suavizado, siempre y cuando sea coherente en todas las muestras.
   6. En la ficha Canal mS, deshabilite Procesamiento MS 3D .
   7. En la ventana del canal SIR, integre cada pico, un canal a la vez. Una vez que se integra un pico, vaya a Opciones > Rellenar desde resultado y los detalles del pico se rellenarán en la pestaña Componentes.
   8. Una vez evaluados todos los canales SIR, guarde el método de procesamiento y cierre la ventana.
   9. En la pestaña Conjuntos de muestras, haga clic con el botón derecho en el conjunto de muestras y seleccione Modificar muestra.
   10. Seleccione Importe en la nueva ventana.
   11. Seleccione Copiar en Método de proceso y elija el método de proceso que se acaba de guardar.
   12. Introduzca la concentración de cada metabolito para cada vial e introduzca la unidad como <-M para cada componente (o la unidad correspondiente) y seleccione OK.
   13. Seleccione el conjunto de muestras de nuevo, haga clic con el botón derecho, Ver como > Canales.
   14. Seleccione todos los canales SIR de los metabolitos sin etiquetar para los estándares, haga clic con el botón derecho y seleccione Procesar.
   15. Active la casilla Proceso y elija Usar método de procesamiento especificado. Seleccione el método de procesamiento adecuado y haga clic en Aceptar.
   16. Seleccione Canales SIR para todos los metabolitos sin etiquetar para las muestras, haga clic con el botón derecho y seleccione Procesar.
   17. Active la casilla Proceso, seleccione Usar método de procesamiento especificado y elija el método de procesamiento que se acaba de guardar. Marque también la casilla Exportar, seleccione Usar método de exportación especificado y elija el método de exportación guardado creado anteriormente. Haga clic en Aceptar.
   18. Cuantifique los metabolitos sin etiquetar con la curva estándar y exporte los resultados a un archivo de texto al directorio especificado.

Resultados

Como prueba de concepto, utilizamos el protocolo para cuantificar metabolitos en un sistema CFPS basado en E. coli que expresa proteína fluorescente verde (GFP).  La reacción de CFPS (14 l) se acalmó y se desproteinó con etanol. El ejemplo de CFPS fue etiquetado con ¹²C-aniline, mientras que los estándares fueron etiquetados con ¹³C-aniline. La muestra etiquetada y los estándares se combinaron e inyectaron en la LC/MS(Figura 1). También se desarrolló el protoco...

Discusión

Los sistemas libres de células no tienen pared celular, por lo que hay acceso directo a metabolitos y la maquinaria biosintética sin necesidad de una preparación compleja de la muestra. Sin embargo, se ha hecho muy poco trabajo para desarrollar protocolos exhaustivos y robustos para interrogar cuantitativamente a los sistemas de reacción libres de células. En este estudio, desarrollamos un método rápido y robusto para cuantificar metabolitos en mezclas de reacción sin células y potencialmente en extractos de células ente...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12C Anilina	Sigma-Aldrich	242284	Anilina 12C
13C anilina marcada	Sigma-Aldrich	485797	Anilina 13C6
Ácido 3-fosfoglicérico	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
Ácido acético	FisherScientific	AC222140010	ACE
Acetonitrilo, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acetil-coenzima A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μ M, 2,1 x 150 mm Columna	Aguas	186002353	Columna
Difosfato de adenosina	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Adenosina monofosfato	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Trifosfato de adenosina	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alfa-cetoglutarato	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
Citrato	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Difosfato de citidina	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Monofosfato de citidina	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Trifosfato de citidina	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-gliceraldehído 3-fosfato	Sigma-Aldrich	39705	GAP
Eritrosa 4-fosfato	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
Etanol	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Centrífuga Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrífuga	FisherScientific
Flavina adenina dinucleótido	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
Fructosa 1,6-bisfosfato	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
Fructosa 6-fosfato	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
Fumarato	Sigma-Aldrich	F8509	FUM
Gluconato 6-fosfato	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
Glucosa 6-fosfato	Sigma-Aldrich	G7879	G6P Glicerol
3-fosfato	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Difosfato de guanosina	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Monofosfato de guanosina	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Trifosfato de guanosina	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	258148	Isocitrato de HCl
	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
Lactato	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
Malato	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Síntesis de proteínas libres de células
N-(3-dimetilaminopropil)-N′-clorhidrato de etilcarbodiimida	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Dinucleótido de nicotinamida y adenina	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
nicotinamida adenina dinucleótido reducido	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Oxalacetato	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Fosfoenolpiruvato	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Piruvato	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
Ribosa 5-fosfato	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Ribulosa 5-fosfato	CarboSynth	MR45852	RL5P
Sedoheptulosa 7-fosfato	CarboSynth	MS07457	S7P
Succinato	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributilamina	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Trietilamina	FisherScientific	O4884	TEA
ultrapura	FisherScientific	10977-015	agua
Difosfato de uridina	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Monodistato de uridina	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Trifosfato de uridina	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Vórtice de alta resistencia	VWR		Vortex
Agua, LCMS	JT BAKER	9831-03	AGUA
Aguas Acquity H Clase UPLC Gerente de solventes cuaternarios	Waters		LCMS
Waters Acquity H Gerente de muestras de clase UPLC FTN	Aguas		LCMS
Detector Acquity Qda	de Waters	LCMS
Software Empower 3	Waters
Vial de recuperación total de Waters LCMS	Waters	186000384c	Vial LCMS