Presentamos un método de citometría de flujo para identificar simultáneamente diferentes tipos de células recuperadas del cerebro del ratón o de la médula espinal. Este método podría ser explotado para aislar o caracterizar las poblaciones de células puras en enfermedades neurodegenerativas o para cuantificar el alcance de la orientación celular a la administración in vivo de vectores virales o nanopartículas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Caracterización citométrica de flujo simultáneo de múltiples tipos de células recuperadas del cerebro del ratón/cordón espinal a través de diferentes métodos de homogeneización
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los recientes avances en las ciencias de vectores virales y nanomateriales han abierto el camino a nuevos enfoques de vanguardia para investigar o manipular el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, una mayor optimización de estas tecnologías se beneficiaría de métodos que permitan determinar rápida y agilizar el alcance del SNC y la orientación específica de las células en la administración de vectores virales o nanopartículas en el cuerpo. Aquí, presentamos un protocolo que aprovecha las capacidades de alto rendimiento y multiplexación de la citometría de flujo para permitir una cuantificación directa de diferentes subtipos celulares aislados del cerebro del ratón o de la médula espinal, a saber, microglia/macrophages, linfocitos, astrocitos, oligodendrocitos, neuronas y células endoteliales. Aplicamos este enfoque para resaltar las diferencias críticas entre dos métodos de homogeneización tisular en términos de rendimiento celular, viabilidad y composición. Esto podría indicar al usuario que elija el mejor método dependiendo de los tipos de celda de interés y la aplicación específica. Este método no es adecuado para el análisis de la distribución anatómica, ya que el tejido se homogeneiza para generar una suspensión de una sola célula. Sin embargo, permite trabajar con células viables y se puede combinar con la clasificación celular, abriendo el camino para varias aplicaciones que podrían ampliar el repertorio de herramientas en manos del neurocientífico, que van desde el establecimiento de cultivos primarios derivados de poblaciones de células puras, hasta análisis de expresión génica y ensayos bioquímicos o funcionales sobre subtipos celulares bien definidos en el contexto de enfermedades neurodegenerativas, sobre el tratamiento farmacológico o la terapia génica.
Introducción
Las tecnologías de generación de genes y fármacos (como los vectores virales y las nanopartículas) se han convertido en una poderosa herramienta que se puede aplicar para obtener mejores perspectivas sobre vías moleculares específicas alteradas en enfermedades neurodegenerativas y para el desarrollo de enfoques terapéuticos innovadores1,2,3. La optimización de estas herramientas se basa en la cuantificación de: (1) el grado de penetración en el SNC en diferentes vías de administración y (2) la focalización de poblaciones celulares específicas. Los análisis histológicos se aplican generalmente para visualizar genes de reporterofluorescentes o nanopartículas etiquetadas fluorescentes en diferentes áreas del SNC y en diferentes tipos de células, identificados por inmunomanchado para marcadores celulares específicos4,5. A pesar de que este enfoque proporciona información valiosa sobre la biodistribución del gen administrado o las herramientas de administración de fármacos, la técnica puede ser lenta e intensa en el trabajo de parto, ya que requiere: (1) fijación de tejidos, criopreservación o incrustación y corte de parafina; (2) la tinción de marcadores celulares específicos que a veces requieren la recuperación de antígenos; 3) adquisición por microscopía de fluorescencia, que normalmente permite el análisis de un número limitado de marcadores diferentes dentro del mismo experimento; (4) procesamiento de imágenes para permitir una cuantificación adecuada de la señal de interés.
La citometría de flujo se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada que aprovecha marcadores fluorescentes muy específicos para permitir no sólo una evaluación cuantitativa rápida de diferentes fenotipos celulares en suspensiones celulares, basada en la expresión de antígenos superficiales o intracelulares, sino también mediciones funcionales (por ejemplo, tasa de apoptosis, proliferación, análisis del ciclo celular, etc.). El aislamiento físico de las células a través de la clasificación de células fluorescentes activadas también es posible, lo que permite aplicaciones posteriores (por ejemplo, cultivo celular, ARNseq, análisis bioquímicos, etc.) 6,7,8.
La homogeneización de tejidos es un paso crítico necesario para obtener una suspensión de una sola célula que permita evaluaciones citométricas de flujo descendente fiables y reproducibles. Se han descrito diferentes métodos para la homogeneización cerebro-tejido adulto, principalmente con el objetivo de aislar las células de microglia9,10,11; pueden clasificarse en general en dos categorías principales: (1) disociación mecánica, que utiliza la fuerza de molienda o cizallamiento a través de un homogeneizador de Dounce (DH) para separar las células de sus nichos y formar una suspensión de una sola célula relativamente homogeneizada, y (2) la digestión enzimática, que se basa en la incubación de trozos de tejido picado a 37 oC en presencia de enzimas proteolíticas, como la trippsina o la papaína, favoreciendo la degradación de la matriz extracelular para crear una suspensión celular bastante homogeneizada12.
Independientemente del método que se utilice, se recomienda un paso de purificación después de la homogeneización del tejido para eliminar la mielina a través de la centrifugación en un gradiente de densidad o por selección magnética9,12, antes de pasar a las aplicaciones aguas abajo.
Aquí, describimos un método de procesamiento de tejido basado en la digestión de la papaína (PD) seguido de purificación en un gradiente de densidad, optimizado para obtener suspensiones celulares heterogéneas viables del cerebro del ratón o de la médula espinal de una manera sensible al tiempo y adecuada para la citometría de flujo. Además, describimos un panel de citometría de flujo de 9 colores y la estrategia de gating que adoptamos en el laboratorio para permitir la discriminación simultánea de diferentes poblaciones de SNC, células vivas/muertas o positividad para reporteros fluorescentes como proteína fluorescente verde o tinte de rodamina. Mediante la aplicación de este análisis citométrico de flujo, podemos comparar diferentes métodos de procesamiento de tejido, es decir, PD frente a DH, en términos de preservación de la viabilidad celular y rendimientos de diferentes tipos de células.
Los detalles que proporcionamos aquí pueden instruir la decisión sobre el protocolo de homogeneización y la combinación de anticuerpos para utilizar en el panel de citometría de flujo, basado en el tipo de celda específico de interés y los análisis aguas abajo (por ejemplo, sensible a la temperatura seguimiento de marcadores fluorescentes específicos, cultivo in vitro, análisis funcionales).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Dana Farber Cancer Institute (número de protocolo 16-024).
1. Preparación de las soluciones necesarias para el experimento
- Prepare 1 solución salina equilibrada de Hank (HBSS) diluyendo 10x HBSS con agua estéril. Enfríe previamente la solución sobre hielo. Se necesitan al menos 25 ml de solución para cada muestra.
- Preparar la solución isotónica de Percoll (IPS) mezclando 10x HBSS 1:10 estéril con medio de gradiente de densidad (es decir, Percoll). Pre-enfriado en hielo.
NOTA: IpS se puede almacenar durante un máximo de 30 días a 4 oC. - Preparar la solución de bloqueo de citometría de flujo (FACS) (BL) (1% de albúmina sérica bovina [BSA], suero bovino fetal al 5% [FBS] en solución salina con fosfato [PBS]). Pre-enfriado en hielo.
2. Eutanasia animal por perfusión intracardiaca y disección tisular
NOTA: En los experimentos se utilizaron ratones C57BL/6J de ocho semanas de edad, ya sea sexo. La perfusión con solución de PBS se realiza para eliminar la contaminación de la sangre de los órganos, antes de proceder con la digestión de los tejidos.
- Anestetizar el ratón mediante el uso de una mezcla de ketamina/xilazina (90-200 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilazina). Coloque el ratón en su espalda y pegue cada extremidad hasta el soporte. Verifique la profundidad adecuada de la anestesia comprobando el reflejo de abstinencia.
- Haga una incisión cutánea de línea media a nivel de la entrada torácica para exponer el esternón. Use fórceps para agarrar la punta del esternón, luego haga una incisión de 1 cm a cada lado de la caja torácica. Finalmente cortar a través del diafragma y abrir el esternón lo suficientemente suficiente como para visualizar el corazón.
- Usa fórceps para agarrar suavemente el corazón por el ventrículo derecho y elevarlo a la línea media y ligeramente fuera del pecho.
- Inserte una aguja de mariposa de 23 G en la punta del ventrículo izquierdo, hacia la aorta y sostenga firmemente.
- Inicie la perfusión con 1x PBS. Atraviesa la aurícula derecha usando tijeras para permitir que el perfusado salga de la circulación. Fije el caudal de PBS en 3 mL/min. Perpeto con al menos 15 mL de 1x PBS para asegurarse de que los tejidos estén limpios.
NOTA: El blanqueamiento del hígado y los vasos sanguíneos mesentéricos son signos de buena perfusión. Si es necesario, el volumen de la prefusión se puede aumentar hasta que el líquido que sale del corazón esté libre de sangre, momento en el que se puede detener la línea de descarga. - Después de la perfusión, corta el cerebro de la médula espinal y retira el cerebro del cráneo con tijeras y fórceps. Retire el pelaje para aumentar la visibilidad y el control durante la disección y evitar el transporte de contaminantes capilares. Saque la médula espinal de su columna utilizando una jeringa de 3 ml llena de PBS.
- Transfiera cada tejido en un pozo de una placa multipode 6po precargada con 2 ml de hielo-frío 1x HBSS y mantener en hielo hasta la digestión.
- Divida el cerebro y la médula espinal en dos mitades, a lo largo de la línea longitudinal.
NOTA: La mitad de cada tejido se homogeneiza (ver secciones a continuación) para permitir análisis citométricos de flujo; la otra mitad se puede asignar a diferentes procesos para análisis alternativos (por ejemplo, sumergido en solución fijativa paraparaformaldehídepara para histología).
3. Digestión enzimática del cerebro y la médula espinal
NOTA: Los volúmenes descritos en esta sección son suficientes para la digestión de la mitad del cerebro o la médula espinal.
- Usa un par de tijeras para picar los tejidos en trozos de 1 x 2 mm de espesor.
- Cortar la punta de una pipeta de 1000 l con un par de tijeras para que sea lo suficientemente grande como para permitir la recolección de las piezas de tejido. Enjuague previamente la punta de la pipeta con 1 hbSS. A continuación, utilice la pipeta para transferir los 2 ml de solución de HBSS que contiene el tejido picado a un tubo cónico de 15 ml.
NOTA: El pre-enrrecemiento de la punta de la pipeta es importante para evitar la adherencia de las piezas de tejido dentro de la punta. - Lavar el pozo con 2 ml adicionales de hielo frío 1x HBSS y transferir la solución al tubo cónico correspondiente de 15 ml que contiene las piezas de tejido.
- Centrifugar cada muestra durante 5 min a 250 x g a 4oC.
- Preparar la mezcla enzimática 1 del kit de disociación del tejido neural (NTDK; Tabla de Materiales) mezclando 50 ml de enzima P con 1900 l de tampón X por muestra. Mezcla enzimática cálida de 1 a 37oC en un baño de agua. Mezclar enzima sin usar 1 a 37 oC durante al menos 10 minutos antes de su uso para permitir la activación completa de la enzima.
- Aspirar el sobrenadante del tubo cónico de 15 ml y añadir 1,95 ml de mezcla enzimática 1 a cada muestra. Suavemente vórtice para asegurarse de que el pellet se resuspende.
- Incubar las muestras en una rueda o coctelera durante 15 min a 37 oC.
- Mientras tanto, prepare la mezcla enzimática 2 del NTDK mezclando 10 ml de enzima A con 20 ml de tampón Y por muestra; precalentar la solución a 37 oC en un baño de agua.
- Al final de la incubación con mezcla enzimática 1, añadir 30 l de mezcla enzimática 2 a cada muestra.
- Mezcle suavemente las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1000 ml preenjugada con 1 HBSS.
- Incubar la muestra en una rueda o coctelera durante 15 min a 37 oC.
- Después de la incubación, añadir 10 ml de hielo-frío 1x HBSS a cada tubo para inactivar la mezcla enzimática 1 y la mezcla enzimática 2.
- Centrifugar cada muestra durante 10 min a 320 x g a 4oC.
- Desechar el sobrenadante; Añadir hielo frío 1x HBSS a cada tubo hasta un volumen final de 7 ml y resuspender suavemente el pellet por vórtice.
- Continúe con la sección 5 para la eliminación de escombros.
4. Homogeneización mecánica del cerebro y la médula espinal
NOTA: Los volúmenes descritos en esta sección son suficientes para la homogeneización de la mitad del cerebro o la médula espinal. El protocolo descrito en esta sección se puede utilizar como una alternativa de método al descrito en la sección 3, dependiendo de la necesidad del usuario como se describe a continuación.
- Enfríe previamente el mortero de vidrio de la trituradora de tejido Dounce(Tabla de Materiales)sobre hielo.
- Añadir 3 ml de 1x HBSS pre-enfriado al mortero.
- Transfiera el tejido (cerebro o médula espinal) desde el pozo de la placa de 6 pocillos en el mortero de vidrio asegurándose de que se sumerge en 1 x HBSS y se sienta en la parte inferior del mortero.
- Aplastar suavemente el tejido con 10 golpes de pestillo A seguido de 10 golpes de peste B. Transferir la mezcla homogeneizada en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
- Llene el tubo a un volumen final de 10 ml utilizando 1x HBSS pre-enfriado y centrífuga durante 10 min a 320 x g a 4 oC.
- Aspirar el sobrenadante y añadir hielo-frío 1x HBSS a cada tubo hasta un volumen final de 7 mL y resuspender suavemente el pellet por vórtice.
- Continúe con la sección 5 para la eliminación de escombros.
5. Eliminación de escombros
NOTA: La eliminación de escombros, compuesta principalmente de tejido no digerido y vainas de mielina, es un paso crítico para permitir una tinción eficiente del homogeneizado tisular para análisis citométricos de flujo posteriores.
- Filtrar cada muestra a través de un colador de células de 70 m para eliminar cualquier trozo de tejido no digerido. Este paso es particularmente importante especialmente cuando se trabaja con tejidos de la médula espinal ya que estas muestras son más propensas a contener fragmentos nerviosos no digeridos o meninges que podrían afectar los pasos posteriores.
- Asegúrese de que el volumen final es de 7 ml en cada tubo de muestra. Si no es así, llene con hielo-frío 1x HBSS hasta 7 mL.
- Añadir 3 ml de IPS preenfriado a cada muestra para hacer un volumen final de 10 ml de una solución que contenga medio de gradiente de densidad a una concentración final del 30%. Retírese suavemente de las muestras para asegurarse de que se mezclan homogéneamente.
- Muestras de centrífuga durante 15 min a 700 x g a 18oC, asegurándose de ajustar la aceleración de la centrífuga a 7 y el freno a 0.
NOTA: La centrifugación debe tardar aproximadamente 30 minutos. - Retire delicadamente las muestras de la centrífuga.
NOTA: Un disco blanquecino compuesto de escombros y mielina debe ser visible flotando en la superficie de la solución. Un pellet (que contiene las células de interés) debe ser visible en la parte inferior del tubo. - Aspirar cuidadosamente todo el disco blanquecino de escombros y luego el resto del sobrenadante asegurándose de no desalojar el pellet. Deje alrededor de 100 l de solución encima del pellet celular para evitar el riesgo de desalojarlo inadvertidamente.
- Añadir 1 ml de FACS BL, resuspender el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1000 ml y transfiera muestras a tubos de 1,5 ml.
- Centrífuga durante 5 min a 450 x g a temperatura ambiente (RT).
- Aspirar suavemente el sobrenadante y resuspender el pellet en un búfer adecuado compatible con los análisis aguas abajo (ver sección 6 para el protocolo utilizado para la evaluación citométrica de flujo de múltiples tipos de células).
6. Tinción para la evaluación citométrica de flujo de múltiples tipos de células
- Resuspenda el pellet obtenido en el paso 5.9 con 350 l de FACS BL. Añadir bloque Fc a cada muestra a una concentración final de 5 g/ml.
NOTA: Se deben utilizar al menos 100 l de la muestra para una tinción, para asegurarse de procesar suficientes células para permitir análisis fiables. - Incubar la muestra durante 10 min a 4oC antes de proceder con la tinción.
- Prepare una mezcla de anticuerpos de acuerdo con la Tabla 1.
- Añadir mezcla de anticuerpos a cada tubo, vórtice para 5 s e incubar las muestras durante 15 minutos a 4 oC en la oscuridad.
- Añadir 1 ml de PBS a cada tubo, vórtice y centrífuga durante 5 min a 450 x g en RT.
- Mientras tanto, prepare la mezcla de estreptavidina de acuerdo con la Tabla 1.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en la mezcla de estreptavidina preparada en el paso 6.6. Para cada muestra, utilice el mismo volumen que el utilizado para la tinción en el paso 6.4.
- Vórtice durante 5 s e incubar las muestras durante 10 min a 4oC en la oscuridad.
- Añadir 1 ml de PBS a cada tubo, vórtice y centrífuga durante 5 min a 450 x g en RT.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en FACS BL. Use 300 l de FACS BL para cada 100 l de muestra manchada.
- Añadir 7-amino-actinomicina D (7-AAD) solución a cada muestra. Utilice 5 l de 7-AAD por cada 300 l de muestra preparada en el paso 6.10.
- Almacene las muestras a 4 oC en la oscuridad hasta el análisis citofluorimétrico. Realice el análisis dentro de las 16 h de la preparación de la muestra, para garantizar >60% viabilidad celular.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Comparamos dos métodos de homogeneización diferentes (DH versus PD) aplicados al cerebro del ratón y la médula espinal, para probar la eficiencia en la recuperación de diferentes tipos de células viables adecuadas para aplicaciones posteriores. Para ello, explotamos un panel de citometría de flujo de 9 colores diseñado para caracterizar, en la misma muestra, diferentes tipos de células del SNC, incluyendo microglia, linfocitos, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y endotelio.
Los tejidos ce...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aquí describimos un protocolo para la co-purificación y el análisis citométrico de flujo simultáneo de algunas de las células del SNC más relevantes del cerebro del ratón y la médula espinal. Tradicionalmente, se han aplicado análisis histológicos para describir la distribución de nanopartículas o la eficiencia de transducción de vectores virales en el SNC5,13, o para proporcionar información sobre los cambios morfológicos y moleculares que se producen en tipos c...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por fondos de start-up del Boston Children's Hospital a A.B., ALSA grant nr. 17-IIP-343 a M.P., y la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación de Esclerosis Lateral Amiotrófica bajo el Premio No. W81XWH-17-1-0036 a M.P. Reconocemos DFCI Flow Cytometry Core para soporte técnico.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10X HBSS (sin calcio, cloruro de magnesio y sulfato de magnesio) | Gibco | 14185-052 | |
| Filtro de células de 70 mm | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anticuerpo anti-ratón | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugado |
| albúmina sérica bovina | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b anticuerpo | anti-ratón para ratasInvitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugado |
| CD31 anticuerpo anti-ratón en ratas | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugado |
| CD45 anticuerpo anti-ratón en ratas Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugado | |
| CD90.1/Thy1.1 anticuerpo anti-ratón en ratas | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugado |
| CD90.2/Thy1.2 anticuerpo anti-ratón en ratas | Biolegend | 1005325 | conjugados PE/Cy7 |
| (15 mL) | 229411 | CellTreat | |
| (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce (incluye mortero y morteros A y B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Bloquea el anticuerpo antiratón para ratas | BD Pharmingen | 553142 | |
| Suero fetal bovino | Benchmark | 100-106 | |
| Kit de disociación de tejido neural (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti ratón/rata/anticuerpo humano | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotina conjugada |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | vende como reactivo no estéril |
| Percoll | Sigma | 65455529 | reactivo estéril (para aplicaciones que requieren esterilidad) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reactivo que contiene trazas muy bajas de endotoxina |
| Estreptavidina | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugado |
Referencias
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371(2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67(2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272(2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635(2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
