Caracterización citométrica de flujo simultáneo de múltiples tipos de células recuperadas del cerebro del ratón/cordón espinal a través de diferentes métodos de homogeneización

Summary

Presentamos un método de citometría de flujo para identificar simultáneamente diferentes tipos de células recuperadas del cerebro del ratón o de la médula espinal. Este método podría ser explotado para aislar o caracterizar las poblaciones de células puras en enfermedades neurodegenerativas o para cuantificar el alcance de la orientación celular a la administración in vivo de vectores virales o nanopartículas.

Abstract

Los recientes avances en las ciencias de vectores virales y nanomateriales han abierto el camino a nuevos enfoques de vanguardia para investigar o manipular el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, una mayor optimización de estas tecnologías se beneficiaría de métodos que permitan determinar rápida y agilizar el alcance del SNC y la orientación específica de las células en la administración de vectores virales o nanopartículas en el cuerpo. Aquí, presentamos un protocolo que aprovecha las capacidades de alto rendimiento y multiplexación de la citometría de flujo para permitir una cuantificación directa de diferentes subtipos celulares aislados del cerebro del ratón o de la médula espinal, a saber, microglia/macrophages, linfocitos, astrocitos, oligodendrocitos, neuronas y células endoteliales. Aplicamos este enfoque para resaltar las diferencias críticas entre dos métodos de homogeneización tisular en términos de rendimiento celular, viabilidad y composición. Esto podría indicar al usuario que elija el mejor método dependiendo de los tipos de celda de interés y la aplicación específica. Este método no es adecuado para el análisis de la distribución anatómica, ya que el tejido se homogeneiza para generar una suspensión de una sola célula. Sin embargo, permite trabajar con células viables y se puede combinar con la clasificación celular, abriendo el camino para varias aplicaciones que podrían ampliar el repertorio de herramientas en manos del neurocientífico, que van desde el establecimiento de cultivos primarios derivados de poblaciones de células puras, hasta análisis de expresión génica y ensayos bioquímicos o funcionales sobre subtipos celulares bien definidos en el contexto de enfermedades neurodegenerativas, sobre el tratamiento farmacológico o la terapia génica.

Introduction

Las tecnologías de generación de genes y fármacos (como los vectores virales y las nanopartículas) se han convertido en una poderosa herramienta que se puede aplicar para obtener mejores perspectivas sobre vías moleculares específicas alteradas en enfermedades neurodegenerativas y para el desarrollo de enfoques terapéuticos innovadores^1,2,3. La optimización de estas herramientas se basa en la cuantificación de: (1) el grado de penetración en el SNC en diferentes vías de administración y (2) la focalización de poblaciones celulares específicas. Los análisis histológicos se apl....

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Dana Farber Cancer Institute (número de protocolo 16-024).

1. Preparación de las soluciones necesarias para el experimento

1. Prepare 1 solución salina equilibrada de Hank (HBSS) diluyendo 10x HBSS con agua estéril. Enfríe previamente la solución sobre hielo. Se necesitan al menos 25 ml de solución para cada muestra.
2. Preparar la solución isotónica de Percoll (IPS) mezclando 10x HBSS 1:10 estéril con medio de gradiente de densidad (es decir, Percoll). Pre-enfriado en hielo.
   NOTA: IpS se puede almacenar ....

Results

Comparamos dos métodos de homogeneización diferentes (DH versus PD) aplicados al cerebro del ratón y la médula espinal, para probar la eficiencia en la recuperación de diferentes tipos de células viables adecuadas para aplicaciones posteriores. Para ello, explotamos un panel de citometría de flujo de 9 colores diseñado para caracterizar, en la misma muestra, diferentes tipos de células del SNC, incluyendo microglia, linfocitos, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y endotelio.

Los tejidos ce.......

Discussion

Aquí describimos un protocolo para la co-purificación y el análisis citométrico de flujo simultáneo de algunas de las células del SNC más relevantes del cerebro del ratón y la médula espinal. Tradicionalmente, se han aplicado análisis histológicos para describir la distribución de nanopartículas o la eficiencia de transducción de vectores virales en el SNC^5,13, o para proporcionar información sobre los cambios morfológicos y moleculares que se producen en tipos c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (sin calcio, cloruro de magnesio y sulfato de magnesio)	Gibco	14185-052
Filtro de células de 70 mm	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anticuerpo anti-ratón	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugado
albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b anticuerpo	anti-ratón para ratasInvitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 conjugado
CD31 anticuerpo anti-ratón en ratas	BD Bioscience	562939	BV421 conjugado
CD45 anticuerpo anti-ratón en ratas Biolegend		103138	Brilliant Violet 510 conjugado
CD90.1/Thy1.1 anticuerpo anti-ratón en ratas	Biolegend	202518	PE/Cy7 conjugado
CD90.2/Thy1.2 anticuerpo anti-ratón en ratas	Biolegend	1005325	conjugados PE/Cy7
(15 mL)	229411		CellTreat
(50 mL)	CellTreat	229422
Dounce (incluye mortero y morteros A y B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Bloquea el anticuerpo antiratón para ratas	BD Pharmingen	553142
Suero fetal bovino	Benchmark	100-106
Kit de disociación de tejido neural (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti ratón/rata/anticuerpo humano	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotina conjugada
Percoll	GE Healthcare	10266569	vende como reactivo no estéril
Percoll	Sigma	65455529	reactivo estéril (para aplicaciones que requieren esterilidad)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reactivo que contiene trazas muy bajas de endotoxina
Estreptavidina	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugado