El modelo de vejiga libre de detrusores permite el acceso directo al suburotelio para estudiar los mecanismos locales para la regulación de la disponibilidad de mediadores biológicamente activos en suburothelium/lamina propria durante el almacenamiento y la anulación de la orina. La preparación se asemeja mucho al llenado de una vejiga intacta y permite realizar estudios de volumen de presión sin influencias sistémicas.
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Artículo de método
Un modelo de vejiga murina descentralizada (Ex Vivo) con el músculo detrusor eliminado para el acceso directo al suburotelio durante el llenado de la vejiga
En este artículo
Resumen
Resumen
Estudios anteriores han establecido la liberación de sustancias químicas de las láminas de la mucosa de la vejiga plana colocadas en las cámaras ussing y expuestas a cambios en la presión hidrostática o el estiramiento mecánico y de las células uroteliales cultivadas tras cambios de presión hidrostática, estiramiento, hinchazón celular o fuerzas de arrastre, y en lumen vesical al final del llenado. Tales hallazgos llevaron a la suposición de que estos mediadores también se liberan en suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) durante el llenado de la vejiga, donde afectan a las células profundas de la pared de la vejiga para regular en última instancia la excitabilidad de la vejiga. Hay al menos dos limitaciones obvias en tales estudios: 1) ninguno de estos enfoques proporciona información directa sobre la presencia de mediadores en SubU/LP, y 2) los estímulos utilizados no son fisiológicos y no recapitulan el llenado auténtico de la vejiga. Aquí, discutimos un procedimiento que permite el acceso directo a la superficie suburotelial de la mucosa de la vejiga en el curso del llenado de la vejiga. La preparación libre de detrusores murinos que creamos se asemeja mucho al llenado de la vejiga intacta y permite realizar estudios de volumen de presión en la vejiga en ausencia de señalización de confunción a partir de reflejos espinales y músculo liso detrusor. Utilizando el nuevo modelo de vejiga libre de detrusores, recientemente demostramos que las mediciones intravesicales de los mediadores no se pueden utilizar como un proxy de lo que se ha liberado o está presente en la SubU/LP durante el llenado de la vejiga. El modelo permite el examen de moléculas de señalización derivadas del urotelio que se liberan, generadas por el metabolismo y/o transportadas a la SubU/LP durante el transcurso del llenado de la vejiga para transmitir información a las neuronas y el músculo liso de la vejiga y regular su excitabilidad durante la continencia y la micción.
Introducción
El propósito de este modelo es permitir el acceso directo al lado submucoso de la mucosa de la vejiga durante diferentes fases de llenado de la vejiga.
La vejiga debe abstenerse de contracción prematura durante el llenado y vaciarse cuando se alcanza el volumen crítico y la presión. La continencia anormal o el vaciado de orina se asocian con frecuencia con excitabilidad anormal del músculo liso del detrusor (DSM) en el curso del llenado de la vejiga. La excitabilidad de DSM está determinada por factores intrínsecos a las células musculares lisas y por influencias generadas por diferentes tipos de células dentro de la pared de la vejiga. La pared de la vejiga urinaria consiste en urotelio (mucosa), suburotelio (SubU)/lamina propria (LP), músculo liso detrusor (DSM) y serosa(Figura 1A). El urotelio consiste en células paraguas (es decir, la capa más externa del urotelio), células intermedias y células basales (es decir, la capa más interna del urotelio). Varios tipos de células, incluyendo células intersticiales, fibroblastos, terminales nerviosos aferentes, vasos sanguíneos pequeños y células inmunitarias residen en el SubU/LP. Se asume ampliamente que el urotelio vesical es un órgano sensorial que inicia la micción y la continencia reflejoliberando mediadores en la submucosa que afectan a las células de la SubU/LP y al DSM1,2,3. En su mayor parte, tales suposiciones se basan en estudios que han demostrado la liberación de mediadores: de piezas de mucosa expuestas a cambios en la presión hidrostática4,5; de células uroteliales cultivadas expuestas al estiramiento6,7, hinchazón celular inducida por hipotonía7 o fuerzas de arrastre8; de tiras aisladas de la pared de la vejiga tras la activación del receptor o del nervio9,10,11,12,13,14; y en el lumen de la vejiga al final del llenado de la vejiga15,16,17,18,19. Si bien estos estudios fueron fundamentales para demostrar la liberación de mediadores sobre la estimulación mecánica de segmentos de la pared de la vejiga o células uroteliales cultivadas, deben estar respaldados por evidencia directa para la liberación de mediadores en la submucosa que se provoca por estímulos fisiológicos que reproducen el llenado de la vejiga. Esta es una tarea difícil dado que el SubU/LP se encuentra en lo profundo de la pared de la vejiga, lo que dificulta el acceso directo a las proximidades de SubU/LP durante el llenado de la vejiga.
Aquí, ilustramos un modelo de vejiga murina descentralizado (ex vivo) con el músculo detrusor extirpado13 que fue desarrollado para facilitar estudios sobre los mecanismos locales de mecanotransducción que participan en la señalización entre el urotelio de la vejiga, DSM y otros tipos de células en la pared de la vejiga. Este enfoque es superior al uso de láminas planas de la pared de la vejiga, tiras de la pared de la vejiga o células uroteliales cultivadas porque permite mediciones directas en las proximidades de SubU/LP de mediadores derivados del urotelio que se liberan o se forman en respuesta a presiones fisiológicas y volúmenes en la vejiga y evita posibles cambios fenotípicos en el cultivo celular. Se puede utilizar para medir la disponibilidad, liberación, metabolismo y transporte transurotelial de mediadores en SubU/LP en diferentes etapas de llenado de la vejiga(Figura 1B). La preparación también se puede utilizar para examinar la señalización urotelial y la mecanotransducción en modelos de síndromes de vejiga hiperactivos y hipoactivos.
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Protocolo
Todos los procedimientos relacionados con los animales descritos en este manuscrito fueron llevados a cabo de acuerdo con la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Nevada.
NOTA: El modelo presentado aquí consiste en la extracción del músculo detrusor mientras que el urotelio y SubU/LP permanecen intactos(Figura 1B)para permitir a los investigadores el acceso directo a SubU/LP en el curso del llenado de la vejiga.
1. Disección de la preparación de la vejiga libre de detrusores
- Colocar la vejiga aislada en una placa de disección llena de frío (10 oC) y oxigenada con 5% de CO2/95 % O2 Krebs solución de bicarbonato (KBS) con la siguiente composición (mM): 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dextrosa, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
- Ancle una pequeña porción de la cúpula de la vejiga aislada a un plato de diseción cubierto de Sylgard lleno de KBS. Asegúrese de que el pasador pasa a través de un pedazo de la serosa o el borde más externo del músculo detrusor lejos del borde más interno del músculo que se enfrenta a la SubU/LP.
- Con un microscopio, identifique la uretra y los uréteres y ancle cada uno de ellos en la parte inferior del plato de disección.
- Retire el exceso de tejidos adiposos y conectivos para que se muestre todo el cuerpo principal de la vejiga, la uretra y ambos uréteres.
- Ate los uréteres con suturas de nylon 6-0. A continuación, anclar los extremos abiertos de los uréteres hacia la parte inferior del plato de diseción para asegurar la preparación.
- Usando fórceps de punta fina, tire suavemente de un pedazo de la serosa en la esquina entre el uréter y el cuerpo de la vejiga.
- Ajuste la luz del microscopio para aumentar la transparencia y distinguir el margen de la submucosa debajo del músculo detrusor.
- Comience a cortar(¡no pelar!) la pared de la vejiga con tijeras de punta fina a lo largo de la superficie interna de la capa muscular detrusor mientras arrastra suavemente el segmento de corte lejos de la preparación. En todo momento, asegúrese de que se puede ver el borde lateral de la mucosa y evitar tocarla.
- Retire el músculo detrusor por completo girando alrededor del plato de diselación para que la posición de la preparación sea cómoda para continuar disedando el músculo detrusor.
- Deje un pequeño trozo de músculo detrusor en la parte superior de la cúpula de la vejiga para asegurar la capacidad de inmovilizar la preparación durante los pasos restantes del protocolo.
- Haga un doble lazo de hilo de nylon 6-0, colóquelo alrededor del cuello de la preparación de la vejiga y deje el lazo suelto.
- Agregue un segundo bucle doble de hilo de seda 6-0, colóquelo alrededor del cuello de la preparación de la vejiga y deje que el bucle pierda. Tener dos suturas evita fugas alrededor de las suturas.
- Cortar alrededor de 2 cm de tubos de 20 PE (catéter), arogar la punta moviendo lentamente la punta cerca de una llama.
- Llene el catéter con KBS oxigenados calientes (37 oC).
- Inserte el catéter en el orificio de la uretra de la vejiga y empuje suavemente el catéter hasta que la punta del catéter alcance aproximadamente el centro de la vejiga.
- Ate la sutura alrededor del catéter y el tejido circundante del cuello de la vejiga.
- Llene lentamente la vejiga con unos 50-100 ml de KBS oxigenados calientes (37 oC), levántela brevemente (<10 s) por encima de la superficie de KBS y monitoree si hay fugas en las suturas y el cuerpo de la vejiga.
- Si no se observa ninguna fuga, la preparación está lista para el experimento. Si se observa una fuga alrededor de la sutura, retire la sutura y reemplácela. Si se observa una fuga de un orificio en el cuerpo de la vejiga, deseche la preparación.
2. Relleno de la preparación de la vejiga denuded
- Perfundie KBS (37 oC) en una cámara de 3 ml de un plato de órgano con camisa de agua (37 oC) con un fondo Sylgard.
- Ajuste las líneas de oxígeno y succión.
- Coloque la preparación de la vejiga denuded en la cámara.
- Fije el catéter a un lado de la cámara para que la preparación no flote sobre la superficie de la solución de perfusión.
- Conecte el catéter de vejiga a un tubo PE20 (línea de infusión) más largo conectado a la línea de parada de tres vías utilizando el mismo tamaño de ajuste.
- Asegúrese de que las líneas entre la bomba de perfusión, el transductor de presión y la vejiga estén abiertas.
- Llene la jeringa de perfusión con KBS frescos, calientes (37 oC) y oxigenados.
- Ajuste los parámetros de la bomba: tipo/volumen de jeringa (es decir, 1 ml), operación (es decir, infusión), caudal (es decir, constante) y caudal (es decir, 15 ml/min).
- Pulse el botón Inicio de la bomba de la jeringa para llenar la vejiga.
- Supervise el volumen de llenado y la presión intravesical durante el llenado de la vejiga.
3. Detección de mediadores en el Aspecto SubU/LP de la Preparación de la Vejiga Denuded
- Recoja las alícuotas de la solución de baño en tubos de microcentrífuga heladas o inserciones de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
- Preparar y procesar las muestras de acuerdo con la aplicación de detección adecuada. En el caso de detectar la disponibilidad de purina, procesar las muestras por HPLC con detección de fluorescencia13,18.
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Resultados
La pared de preparación de vejiga libre de detrusores murinas está intacta y contiene todas las capas excepto el DSM y la serosa. Los estudios de prueba de principio demostraron que la pared de la vejiga libre de DSM incluye urotelio y SubU/LP, mientras que la tunica muscular y la serosa están ausentes (Figura 2)13.
El llenado de la vejiga libre de detrusores se apro...
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Discusión
La vejiga tiene dos funciones: almacenamiento y vaciado de orina. El funcionamiento normal de estas funciones requiere una correcta sensibilidad mecánica del volumen intraluminal y la presión y la transducción de las señales a través de las células en la pared de la vejiga para regular la excitabilidad muscular detrusor. Se cree que la mucosa de la vejiga (urothelium) regula la excitabilidad de la vejiga liberando una variedad de moléculas de señalización en el SubU/LP que afectan a numerosos tipos de células en la pared...
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Divulgaciones
Parte de este trabajo fue publicado previamente en el Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Wiley and Sons, Inc. ha otorgado permiso para el uso de materiales de esta publicación. Los autores no tienen conflictos financieros o de otro tipo que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Beca dk41315 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CaCl2 | Fisher | C79 | Fuente flexible |
| Dextrosa | Fisher | D16 | Fuente flexible |
| Pasadores de disección | Fine Science Tools | 26002-20 | Fuente flexible |
| Bomba de infusión | Kent Scientific | GenieTouch | Fuente flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Fuente flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Fuente flexible |
| Fuente de luz | SCHOTT ACEI | Source | |
| microscopio | Olympus SZX7 | Flexible para usar cualquier osciloscopio | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Fuente flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Fuente flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Fuente |
| Agujas flexibles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Fuente flexible |
| Baño de órganos | Hecho a | Fuente flexible; Lo hicimos a partir de un plato de disección Radnoti | |
| Tubo PE-20 | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Transductor de presión | AD instrument | Source flexible | |
| S& Pinzas T | Fine Science Tools | 00632-11 | Fuente flexible |
| Software presión-volumen | AD Instruments | Power lab | |
| Sutura Nylon, 6-0 | AD quirúrgico | S-N618R13 | Fuente |
| sutura flexible Silk, 6-0 | Deknatel vía Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Fuente flexible |
| Jeringas 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Fuente flexible |
| Tijeras de resorte Vannas | Fine Science Tools | 15000-08 | Fuente flexible Circulador |
| agua | Baxter | K-MOD 100 | Fuente flexible |
Referencias
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