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Artículo de método

Cultivos organoides de próstata como herramientas para traducir genotipos y perfiles mutacionales a respuestas farmacológicas

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DOI:

10.3791/60346

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24 de octubre de 2019

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para estudiar las respuestas farmacológicas en organoides epiteliales de próstata. Los organoides se asemejan mucho a la biología in vivo y recapitulan la genética de los pacientes, convirtiéndolos en atractivos sistemas de modelos. Los organoides de próstata se pueden establecer a partir de próstatas de tipo salvaje, modelos de ratón genéticamente diseñados, tejido humano benigno y cáncer de próstata avanzado.

Resumen

Se presenta aquí un protocolo para estudiar la farmacodinámica, el potencial de las células madre y la diferenciación del cáncer en los organoides epiteliales de la próstata. Los organoides de próstata son cultivos tridimensionales (3D) sensibles a los andrógenos cultivados en un medio definido que se asemeja al epitelio prostático. Los organoides de próstata se pueden establecer a partir de modelos de ratón de tipo salvaje y genéticamente diseñados, tejido humano benigno y cáncer de próstata avanzado. Es importante destacar que los organoides derivados del paciente se asemejan mucho a los tumores en la genética y la biología tumoral in vivo. Además, los organoides pueden manipularse genéticamente utilizando sistemas CRISPR/Cas9 y shRNA. Estas genéticas controladas hacen que el cultivo organoide sea atractivo como plataforma para probar rápidamente los efectos de los genotipos y perfiles mutacionales en las respuestas farmacológicas. Sin embargo, los protocolos experimentales deben adaptarse específicamente a la naturaleza 3D de los cultivos organoides para obtener resultados reproducibles. Aquí se describen protocolos detallados para realizar ensayos de sembrado para determinar la capacidad de formación de organoides. Posteriormente, este informe muestra cómo realizar tratamientos farmacológicos y analizar la respuesta farmacológica a través de mediciones de viabilidad, aislamiento de proteínas y aislamiento de ARN. Por último, el protocolo describe cómo preparar organoides para xenografting y posteriores ensayos de crecimiento in vivo utilizando injertosub. Estos protocolos producen datos altamente reproducibles y son ampliamente aplicables a los sistemas de cultivo 3D.

Introducción

La resistencia a los medicamentos es uno de los principales problemas clínicos en el tratamiento del cáncer. El tratamiento del cáncer de próstata metastásico (PCa) se dirige principalmente al eje de señalización de andrógenos. Las terapias antiandrógenas de última generación (p. ej., enzalutamida y abiraterona) han demostrado un gran éxito clínico, pero prácticamente toda la PCa eventualmente progresa hacia un estado independiente de los andrógenos, o cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC).

El perfil genómico y transcriptomico reciente de CRPC reveló que hay tres mecanismos generales de resistencia en el cáncer de próstata: 1) activando mutaciones que resultan en la restauración del receptor de andrógenos (AR) señalización1; 2) activación de la señalización de derivación, como se ejemplifica en un modelo preclínico para la resistencia a la terapia antiandrógeno de próxima generación en la que la activación del receptor de glucocorticoides (GR) puede compensar la pérdida de la señalización AR2; y 3) el proceso recientemente identificado de plasticidad del linaje, en el que las células tumorales adquieren resistencia cambiando los linajes de un tipo de célula dependiente del objetivo del fármaco a otro tipo de célula que no depende de esto (que, en PCa, se representa como AR negativo y/o enfermedad neuroendocrina [NEPC])3,4. Sin embargo, no se entienden los mecanismos moleculares que causan resistencia a los fármacos. Por otra parte, resistencia antiandrógeno adquirida puede conducir a vulnerabilidades terapéuticas que pueden ser explotados. Por lo tanto, es esencial evaluar las respuestas de los medicamentos en sistemas modelo que imitan los fenotipos y genotipos del paciente.

Los organoides de próstata son cultivos organotípicos cultivados en una matriz de proteína 3D con un medio definido. Es importante destacar que los organoides de próstata se pueden establecer a partir de tejido benigno y canceroso de origen murino u humano, y conservan rasgos fenotípicos y genotípicos que se encuentran en vivo5,6. Es importante destacar que las células PCa y CRPC sensibles a los antiandrógenos están representadas en el compendio actual de organoides. Además, los organoides de próstata se manipulan genéticamente fácilmente utilizando CRISPR/Cas9 y shRNA5. Por lo tanto, los organoides de próstata son un sistema modelo adecuado para probar las respuestas de los medicamentos y dilucidar los mecanismos de resistencia. Aquí, se describe un protocolo detallado para realizar pruebas de drogas y analizar las respuestas farmacológicas utilizando organoides de próstata.

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Protocolo

Todo el trabajo descrito en este protocolo se ha realizado con organoides murinos previamente establecidos y organoides derivados del paciente. Todo el trabajo animal se realizó de acuerdo con las directrices del Centro de Recursos Animales de Investigación del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Todos los tejidos derivados del paciente se recogieron de conformidad con las reglas y regulaciones del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).

1. Preparación media y tampón

  1. Descongelar la matriz de membrana del sótano (p. ej., Matrigel) a 4oC durante la noche antes de iniciar el experimento. Manténgalo en hielo durante el uso.
  2. Colocar las placas de cultivo a 37oC durante 24 horas antes de los experimentos. Esto ayudará a la cúpula de la matriz de membrana del sótano (en adelante, denominada cúpula de matriz) a polimerizar. Los organoides de chapado se describen en el paso 2.1.2.
  3. Preparar el medio organoide de acuerdo con el protocolo establecido5.
  4. Preparar el medio organoide sin la adición de factor de crecimiento epidérmico (EGF; ver Tabla de Materiales para componentes). EGF suprime la salida transcripcional AR y confiere resistencia a los andrógenos5.
  5. Prepare el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco con un 10% de suero bovino fetal (FBS).
    NOTA: Este medio se utiliza para inhibir la digestión enzimática con reemplazo de trippsina en las secciones 2-4.
  6. Preparar soluciones de medicamentos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para enzalutamida/mdv3100 (en lo sucesivo denominado antiandrógeno de segunda generación), prepare una solución en stock de 100 m en dimetil sulfóxido (DMSO). El stock se puede almacenar a -20 oC durante un máximo de 6 meses y no es necesario que se haya elaborado fresco.

2. Aislamiento, digestión enzimática y establecimiento de organoides

  1. Aislar los organoides de próstata del ratón o tejido humano de acuerdo con los protocolos previamente establecidos5,7. A continuación se proporciona una breve descripción.
    1. La mince y el tejido prostático digieren enzimáticamente para producir una suspensión de una sola célula. En este experimento, se utilizó 1 mL de 5 mg/ml de colagenasa tipo II en ADMEM/F12 para la digestión de 50 mg de tejido prostático.
    2. Recoger las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min, contar las células, resuspenderlas en la matriz de membrana del sótano, y la placa en la densidad adecuada5,7 en las cúpulas de matriz en placas de cultivo organoides precalentadas (placado método se muestra en la Figura 1A).
    3. Deje que las cúpulas se solidifiquen y agreguen medios a la parte superior de las cúpulas para que estén completamente cubiertas.
  2. Haga crecer los organoides a la cantidad deseada para aplicaciones posteriores. El número de celda se puede determinar mediante métodos de recuento estándar. Consulte la sección específica de la aplicación del protocolo para obtener más detalles sobre la densidad.
  3. Con una pipeta P1000, extraiga el medio y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para interrumpir. Cuando la matriz de membrana del sótano se interrumpa por completo, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml. No coloque más de 10 cúpulas por tubo cónico de 15 ml. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
  4. Retirar el sobrenadante y lavar el pellet celular con 5 ml de PBS. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
  5. Sacar el sobrenadante y resuspender el pellet en 4 ml de reemplazo de trippsina. Digerir durante 5-10 min con agitación a 37oC. Añadir un volumen igual de medio organoide + 10% FBS para inhibir el reemplazo de trippsina. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
  6. Apague el sobrenadante y resuspenda en 1 mL de PBS.
  7. Filtrar la suspensión con un filtro de 40 m para asegurar una suspensión de una sola celda. Cuantifique el número de celda utilizando un hemocitómetro o un dispositivo de conteo equivalente.
    NOTA: Si es difícil obtener células individuales viables, utilice la clasificación de flujo para obtener una solución de celda única.

3. Evaluación de la capacidad de formación de organoides

NOTA: Para determinar el porcentaje de células que pueden generar un organoide, se puede realizar un ensayo de semillas como un proxy para el potencial de tallo/progenitor. La capacidad de formación de organoides también es importante para definir un número de sembración celular para los ensayos de viabilidad.

  1. Diluir la suspensión celular obtenida en el paso 2.7 a 100 células por 10 éL de la suspensión utilizando medio organoide que contiene 10 m inhibidor de Rho quinasa Y-27632.
  2. Transfiera 1.100 células (110 l de suspensión) a un nuevo tubo cónico.
  3. Añadir 285 l de matriz de membrana de sótano y resuspender las células. Esto resultará en una concentración de matriz del -70%.
    NOTA: La dilución de la matriz de membrana del sótano durante la sembración reduce en gran medida la variación en el tamaño de la cúpula, causada por la viscosidad de la matriz proteica.
  4. Células de semilla en 35 s de cúpulas de matriz en una placa precalentada de 24 pocillos, lo que resulta en 200 células/pozo. La placa 3-5 replica por muestra (véase también el método de chapado en la Figura 1A y el paso 2.1.2).
  5. Para asegurarse de que las células permanezcan dentro de la cúpula de la matriz, voltee la placa y colóquela en una incubadora de células para solidificar la matriz de membrana del sótano.
  6. Después de 10 minutos, retire la placa de la incubadora y agregue un medio que contenga el inhibidor de Rho quinasa.
  7. Actualice el medio cada 2 días. Después de 7 días, cuantifique el número de organoides. Mantener el inhibidor de Rho quinasa en los medios durante todo el experimento.
  8. Cuente el número de organoides establecidos por cúpula y calcule el porcentaje de organoides formados a partir del número total de células chapadas (200 células).
    NOTA: Las proporciones de establecimiento organoides varían de 3%-60% dependiendo del tipo de célula y el genotipo.

4. Determinación de las respuestas farmacológicas de los organoides

  1. Continuando con el paso 2.7, semilla 1.000-10.000 células en una cúpula de matriz. Utilice la eficiencia de formación de organoides y la velocidad de crecimiento como un proxy para determinar el número de celda final.
    NOTA: Los números de celda recomendados se proporcionan en la Tabla 1. Utilice de tres a cinco réplicas por condición por análisis. Utilice una concentración final de 70% matriz de membrana de sótano para reducir los errores de pipeteo inducidos por la viscosidad.
  2. Semilla de 35 l de cúpulas de matriz en una placa de 24 pocillos y dejar que las cúpulas se solidifiquen como se hace en la sección 3 (véase también el método de chapado en la Figura 1A y el paso 2.1.2). Añadir medio que contenga el inhibidor de Rho quinasa y el medicamento de elección. Este método se puede aplicar a todos los medicamentos, pero en este protocolo, un antiandrógeno de segunda generación se utiliza a 10 M por ejemplo. Para determinar la media concentración inhibitoria máxima (IC50), realice un log10 incremental, y como control, utilice el vehículo en el que se disolvió el fármaco.
  3. Refrescar el medio cada dos o tres días y analizar los organoides el día 7 para determinar la respuesta farmacológica del fármaco. Los puntos de tiempo pueden variar entre la elección del experimento y la droga.
    NOTA: Los organoides no tienen que ser trippsinizados para realizar estos ensayos.
  4. Para mantener intactos los organoides, utilizando una pipeta P1000, extraiga el medio y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para interrumpir la matriz de membrana del sótano.
  5. Cuando la matriz de membrana del sótano se interrumpa por completo, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml. No transfiera más de 10 cúpulas de matriz por tubo cónico de 15 ml.
  6. Centrífuga a 300 x g durante 5 min. Extraiga el sobrenadante y lávelo con 5 ml de PBS.
  7. Resuspender los organoides en 1 ml de PBS y alterar los organoides utilizando la trituración y una pipeta Pasteur de vidrio.
  8. Cuantificar el número de fragmentos organoides. Semilla 5 réplicas que contienen 100 fragmentos organoides como se describe en el paso 2.1.2.
  9. Realice el ensayo de viabilidad celular como se describe a continuación en la sección 7.

5. Aislamiento del ARN de los organoides

NOTA: Los métodos basados en columnas disponibles en el nombre comercial producen una buena cantidad y calidad de ARN. Para garantizar una buena cantidad de ARN, utilice un mínimo de una cúpula por muestra; sin embargo, se recomienda el uso de tres cúpulas, que se pueden sembrar en un solo pozo de un plato de 12 pozos.

  1. Añadir -mercaptoetanol (1%) al tampón de lisis de glutatión en el kit de aislamiento de ARN.
  2. Extraiga el medio de las cúpulas de membrana del sótano que contienen organoides y agregue 750 l de este tampón. Pipetear hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta P1000. Compruebe que toda la matriz de membrana del sótano se ha disuelto.
  3. Añadir 750 s de 70% de etanol y mezclar mediante pipeteo. Posteriormente transfiera 700 l de la mezcla a la columna, centrifugar a 12.000 x g durante 1 min y repetir con el resto del lisado.
  4. Realice lavados y tratamiento de DNase en columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Elute el ARN en 30-50 l de agua libre de ARNi.
  5. Mida las concentraciones utilizando un fluorómetro a OD a 260 nm y 280 nm y guárdelas a -80 oC o continúe con aplicaciones aguas abajo.

6. Aislamiento proteico de organoides

NOTA: Para el aislamiento de proteínas, prepare un tampón RIPA estándar que contenga inhibidores de la fosfatasa y la proteasa(Tabla de materiales). Se recomienda utilizar al menos tres cúpulas, que se pueden sembrar en un solo pozo de 12.

  1. Usando una pipeta P1000, extraiga el medio de la célula con las cúpulas de membrana del sótano que contienen organoides y pipetas hacia arriba y hacia abajo para interrumpir la matriz de membrana del sótano.
  2. Cuando esté totalmente interrumpido, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
  3. Retirar el sobrenadante y lavar con 5 ml de PBS helado. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
  4. Sacar el sobrenadante y resuspender el pellet en 4 ml de reemplazo de trippsina. Digerir durante 5-10 min mientras se agita a 37 oC.
  5. Añadir un volumen igual de medio organoide + 10% FCS para inhibir el reemplazo de trippsina. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
    NOTA: Después de la centrifugación, ninguna matriz de membrana del sótano debe ser visible en el pellet.
  6. Retirar el sobrenadante y lavar con 5 ml de PBS helado. Extraiga el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 300 ml de tampón de lisis usando un pipeta P1000, luego transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  7. Incubar sobre hielo durante 10 min y posteriormente sonicar 2x para 30 s cada uno en agua enfriada con una temperatura de 4oC. Vuelva a colocar el tubo en hielo y realice la cuantificación de proteínas utilizando métodos estándar.
  8. Desnaturalizar la proteína añadiendo dodecilo sulfato sódico (SDS) que contiene tinte de carga y hervir durante 5 min a 95 oC. Almacene los lysates a -80 oC o continúe con las aplicaciones posteriores.

7. Ensayo de viabilidad celular con organoides

NOTA: La viabilidad celular se puede evaluar utilizando el kit de ensayo de viabilidad celular disponible en el uso comercial y un luminómetro. Prepare los tampones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recomiendan cinco réplicas por condición: una réplica que consiste en una cúpula de matriz de membrana de sótano de 35 l en un pozo de una placa de 24 pocillos.

  1. Eliminar el medio de la cultura organoidea, teniendo cuidado de dejar intactas las cúpulas de la matriz.
  2. Agregue 65 sl de PBS y pipeta hacia arriba y hacia abajo para interrumpir la cúpula de la matriz.
  3. Agregue 100 l del búfer del kit de ensayo de viabilidad celular y resuspenda mediante pipeteo.
  4. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos con temblor.
  5. Transfiera 100 ml de mezcla a una placa no translúcida adecuada para el luminómetro y realice la lectura de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de ensayo de viabilidad celular.

8. Preparación de organoides para xenografting

NOTA: Los organoides también son susceptibles de injerto subcutáneo tanto en animales inmunes comprometidos como en ratones isogénicos. Para garantizar que los organoides inyectados sean distinguibles in vivo, etiquete los organoides con un fluoróforo constitutivamente expresivo5. Se recomienda realizar un experimento piloto para el injerto utilizando 5 x 105 células a 2 x 106 células por inyección, con incrementos de 5 x 106 células, ya que la eficiencia del injerto varía entre líneas de organoides.

  1. Con una pipeta P1000, extraiga el medio y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para interrumpir la matriz de membrana del sótano. Cuando esté totalmente interrumpido, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
    NOTA: No transfiera más de 10 cúpulas de matriz por tubo cónico de 15 ml.
  2. Retirar el sobrenadante y lavar con 5 mL de PBS. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
  3. Sacar el sobrenadante y resuspender el pellet en 4 ml de reemplazo de trippsina. Digerir durante 5-10 min mientras se agita a 37 oC.
  4. Añadir el mismo volumen de medio organoide + 10% FBS para inhibir el reemplazo de trippsina. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
  5. Apague el sobrenadante y resuspenda en 1 mL de PBS. Filtrar la suspensión con un filtro de 40 m para asegurar una suspensión de una sola celda. Cuantifique las celdas utilizando métodos estándar.
  6. Gire hacia abajo y resuspenda las células en PBS + Rho inhibidor a una concentración de 2 x 106 células por 100 l (ver Tabla 2 para las concentraciones celulares y el número de células absolutas necesarias para las concentraciones variables). Utilice un volumen igual de matriz de membrana de sótano para generar una suspensión 1:1. Coloque la suspensión sobre hielo.
  7. Inyectar células de acuerdo con los protocolos estándar y monitorear el crecimiento del xenoinjerto utilizando métodos estándar8.

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Resultados

Eficiencia de la sembración
La capacidad de formación de organoides está determinada por fenotipo y genotipo. Las células basales de la próstata de tipo salvaje (WT) mostraron una capacidad superior de formación de organoides (30%-40%) en comparación con las células luminales (3%) (Figura 1A). Después del establecimiento de organoides, la capacidad de formación aumentó drásticamente. Típicamente, 25%-30% de las células der...

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Discusión

Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la resistencia a los antiandrógenos y descubrir posibles vulnerabilidades terapéuticas requiere pruebas de respuestas farmacológicas en sistemas modelo que imitan el cáncer de próstata. Aquí se describe un protocolo detallado para el análisis fiable de las respuestas farmacológicas en organoides de próstata derivados del paciente y genéticamente diseñados y la preparación de estas muestras de organoides para aplicaciones posteriores.

Hay dos ...

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Divulgaciones

C.L.S es miembro del consejo de administración de Novartis; es cofundador de ORIC Pharmaceuticals y coinventor de enzalutamida y apalutamida; es asesor científico de Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra y PMV; y es cofundador de Seragon, comprado por Genentech/Roche en 2014. W.R.K. es coinventor y titular de patentes de tecnología organoides.

Agradecimientos

K.P. es compatible con NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. es compatible con HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; y Starr Cancer Consortium. W.R.K. cuenta con el apoyo de Dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 y Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
A83-01Tocris2939Componente del medio organoide: Concentración final 200 nM
ADMEM/F12Gibco/Life technologies12634028Componente del medio organoide
B27Gibco/Life technologies17504-044Componente del medio organoide
Placas de cultivo celularFisher
Cell Titer GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073Componente del medio organoide: Concentración final 1 nM
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09Componente del medio organoide: Concentración final 50 ng/ml para ratón, 5 ng/nl para humanos
FGF10Peprotech100-26Componente del medio organoide específico para humanos: Concentración final 10 ng/ ml
FGF2Peprotech100-18BComponente del medio organoide específico para humanos: Concentración final 5 ng/ml
Tecnologías GlutamaxGibco/Life35050079Componente del medio organoide
HEPESMADE IN-HOUSEN/AComponente del medio organoide: Concentración final 10 mM
Matrigel (Factor de crecimiento reducido & Libre de rojo de fenol)CorningCB-40230CComponente del medio organoide
N-AcetilcisteínaSigma-AldrichA9165Componente del medio organoide: Concentración final 1,25 mM
NicotinamidaSigma-AldrichN0636Componente del medio organoide específico para humanos: Concentración final 10 mM
NOGGINPeprotech o células 293t transfectadas estables con constructo Noggin (Karthaus et al. 2014)120-10CComponente del medio organoide: Concentración final Medio condicionado al 10% o 100 ng/ml
Penicilina/EstreptavidinaGemini Bio-Products400-109Componente del medio organoide
Inhibidores de la fosfatasaMerck Millipore524629
Prostaglandina E2Tocris3632464
Inhibidores de la proteasaMerck Millipore539131
R-SPONDINPeprotech o células 293t transfectadas estables con construcción R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)120-38 Componente delmedio organoide: Concentración final Medio acondicionado al 10% o tampón RIPA 500 ng/ml
Merck20-188
RNA-easy minikitQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7Componente medio organoide específico humano: Concentración final 10 μ M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049Componente del medio organoide: Concentración final 10 μ M
657185

Referencias

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