Cultivos organoides de próstata como herramientas para traducir genotipos y perfiles mutacionales a respuestas farmacológicas

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para estudiar las respuestas farmacológicas en organoides epiteliales de próstata. Los organoides se asemejan mucho a la biología in vivo y recapitulan la genética de los pacientes, convirtiéndolos en atractivos sistemas de modelos. Los organoides de próstata se pueden establecer a partir de próstatas de tipo salvaje, modelos de ratón genéticamente diseñados, tejido humano benigno y cáncer de próstata avanzado.

Resumen

Se presenta aquí un protocolo para estudiar la farmacodinámica, el potencial de las células madre y la diferenciación del cáncer en los organoides epiteliales de la próstata. Los organoides de próstata son cultivos tridimensionales (3D) sensibles a los andrógenos cultivados en un medio definido que se asemeja al epitelio prostático. Los organoides de próstata se pueden establecer a partir de modelos de ratón de tipo salvaje y genéticamente diseñados, tejido humano benigno y cáncer de próstata avanzado. Es importante destacar que los organoides derivados del paciente se asemejan mucho a los tumores en la genética y la biología tumoral in vivo. Además, los organoides pueden manipularse genéticamente utilizando sistemas CRISPR/Cas9 y shRNA. Estas genéticas controladas hacen que el cultivo organoide sea atractivo como plataforma para probar rápidamente los efectos de los genotipos y perfiles mutacionales en las respuestas farmacológicas. Sin embargo, los protocolos experimentales deben adaptarse específicamente a la naturaleza 3D de los cultivos organoides para obtener resultados reproducibles. Aquí se describen protocolos detallados para realizar ensayos de sembrado para determinar la capacidad de formación de organoides. Posteriormente, este informe muestra cómo realizar tratamientos farmacológicos y analizar la respuesta farmacológica a través de mediciones de viabilidad, aislamiento de proteínas y aislamiento de ARN. Por último, el protocolo describe cómo preparar organoides para xenografting y posteriores ensayos de crecimiento in vivo utilizando injertosub. Estos protocolos producen datos altamente reproducibles y son ampliamente aplicables a los sistemas de cultivo 3D.

Introducción

La resistencia a los medicamentos es uno de los principales problemas clínicos en el tratamiento del cáncer. El tratamiento del cáncer de próstata metastásico (PCa) se dirige principalmente al eje de señalización de andrógenos. Las terapias antiandrógenas de última generación (p. ej., enzalutamida y abiraterona) han demostrado un gran éxito clínico, pero prácticamente toda la PCa eventualmente progresa hacia un estado independiente de los andrógenos, o cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC).

El perfil genómico y transcriptomico reciente de CRPC reveló que hay tres mecanismos generales de resistencia en el cáncer de próstata: 1....

Protocolo

Todo el trabajo descrito en este protocolo se ha realizado con organoides murinos previamente establecidos y organoides derivados del paciente. Todo el trabajo animal se realizó de acuerdo con las directrices del Centro de Recursos Animales de Investigación del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Todos los tejidos derivados del paciente se recogieron de conformidad con las reglas y regulaciones del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).

1. Preparación media y tampón

1. Descongelar la matriz de membrana del sótano (p. ej., Matrigel) a 4oC durante la noche antes de iniciar el experimento. Manténgalo....

Resultados

Eficiencia de la sembración
La capacidad de formación de organoides está determinada por fenotipo y genotipo. Las células basales de la próstata de tipo salvaje (WT) mostraron una capacidad superior de formación de organoides (30%-40%) en comparación con las células luminales (3%) (Figura 1A). Después del establecimiento de organoides, la capacidad de formación aumentó drásticamente. Típicamente, 25%-30% de las células der.......

Discusión

Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la resistencia a los antiandrógenos y descubrir posibles vulnerabilidades terapéuticas requiere pruebas de respuestas farmacológicas en sistemas modelo que imitan el cáncer de próstata. Aquí se describe un protocolo detallado para el análisis fiable de las respuestas farmacológicas en organoides de próstata derivados del paciente y genéticamente diseñados y la preparación de estas muestras de organoides para aplicaciones posteriores.

Hay dos .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A83-01	Tocris	2939	Componente del medio organoide: Concentración final 200 nM
ADMEM/F12	Gibco/Life technologies	12634028	Componente del medio organoide
B27	Gibco/Life technologies	17504-044	Componente del medio organoide
Placas de cultivo celular	Fisher
Cell Titer Glo	Promega	G7571
DHT	Sigma-Aldrich	D-073	Componente del medio organoide: Concentración final 1 nM
DMSO	Fisher	BP231-100
EGF	Peprotech	315-09	Componente del medio organoide: Concentración final 50 ng/ml para ratón, 5 ng/nl para humanos
FGF10	Peprotech	100-26	Componente del medio organoide específico para humanos: Concentración final 10 ng/ ml
FGF2	Peprotech	100-18B	Componente del medio organoide específico para humanos: Concentración final 5 ng/ml
Tecnologías Glutamax	Gibco/Life	35050079	Componente del medio organoide
HEPES	MADE IN-HOUSE	N/A	Componente del medio organoide: Concentración final 10 mM
Matrigel (Factor de crecimiento reducido & Libre de rojo de fenol)	Corning	CB-40230C	Componente del medio organoide
N-Acetilcisteína	Sigma-Aldrich	A9165	Componente del medio organoide: Concentración final 1,25 mM
Nicotinamida	Sigma-Aldrich	N0636	Componente del medio organoide específico para humanos: Concentración final 10 mM
NOGGIN	Peprotech o células 293t transfectadas estables con constructo Noggin (Karthaus et al. 2014)	120-10C	Componente del medio organoide: Concentración final Medio condicionado al 10% o 100 ng/ml
Penicilina/Estreptavidina	Gemini Bio-Products	400-109	Componente del medio organoide
Inhibidores de la fosfatasa	Merck Millipore	524629
Prostaglandina E2	Tocris	3632464
Inhibidores de la proteasa	Merck Millipore	539131
R-SPONDIN	Peprotech o células 293t transfectadas estables con construcción R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)	120-38 Componente del	medio organoide: Concentración final Medio acondicionado al 10% o tampón RIPA 500 ng/ml
	Merck	20-188
RNA-easy minikit	Qiagen	74104
SB202190	Sigma-Aldrich	152121-30-7	Componente medio organoide específico humano: Concentración final 10 μ M
TryplE	ThermoFisher	12605036
Y-27632	Selleckchem	S1049	Componente del medio organoide: Concentración final 10 μ M

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