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Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

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DOI:

10.3791/60349

10 de febrero de 2020

En este artículo

Resumen

La reconstrucción esofágica es un procedimiento desafiante, y el desarrollo de un esófago diseñado con tejido que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo y que se puede implantar como un injerto artificial es necesario. Aquí, presentamos nuestro protocolo para generar un esófago artificial, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores y diversas técnicas quirúrgicas.

Resumen

El uso de materiales biocompatibles para la reconstrucción esofágica circunferencial es una tarea técnicamente difícil en ratas y requiere una técnica de implante óptima con apoyo nutricional. Recientemente, ha habido muchos intentos de ingeniería de tejido esofágico, pero la tasa de éxito ha sido limitada debido a la dificultad en la epitelización temprana en el entorno especial de la peristalsis. Aquí, desarrollamos un esófago artificial que puede mejorar la regeneración de la mucosa esofágica y las capas musculares a través de un andamio tubular de dos capas, un sistema de biorreactor a base de células madre mesenquimales, y una técnica de alimentación de bypass con Gastrostomy. El andamio está hecho de nanofibras de poliuretano (PU) en forma cilíndrica con una hebra de policaprolactona impresa tridimensional (3D) envuelta alrededor de la pared exterior. Antes del trasplante, las células madre mesenquimales derivadas del ser humano se sembraban en el lumen del andamio, y se realizaba el cultivo del biorreactor para mejorar la reactividad celular. Mejoramos la tasa de supervivencia del injerto aplicando anastomosis quirúrgica y cubriendo la prótesis implantada con un colgajo de la glándula tiroides, seguido de la alimentación temporal de la gastrostomía no oral. Estos injertos fueron capaces de recapitular los hallazgos de epitelización inicial y regeneración muscular alrededor de los sitios implantados, como lo demuestra el análisis histológico. Además, se observaron un aumento de las fibras de elastina y la neovascularización en la periferia del injerto. Por lo tanto, este modelo presenta una nueva técnica potencial para la reconstrucción esofágica circunferencial.

Introducción

El tratamiento de los trastornos esofágicos, como las malformaciones congénitas y los carcinomas esofágicos, puede conducir a la pérdida del segmento estructural del esófago. En la mayoría de los casos, se han realizado injertos de reemplazo autólogos, como conductos de extracción gástricos o interposiciones de colon,1,2. Sin embargo, estos reemplazos esofágistas tienen una variedad de complicaciones quirúrgicas y riesgos de reoperación3. Por lo tanto, el uso de andamios de esófago con ingeniería de tejido imitando el esófago nativo puede ser una estrategia alternativa prometedora para ....

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Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC No 17-0164-S1A0) del Hospital Universitario Nacional de Seúl.

1. Fabricación de andamios

NOTA: Los andamios esofágicos de dos capas se fabrican combinando electrospinning e impresión 3D. La membrana interna del andamio tubular fue fabricada por poliuretano electrospinning (PU) con mandriles giratorios de acero inoxidable como los colectores9.

  1. Para la preparación de nanofibras tubulares de PU, prepare una solución de polímero de PU al 20% (p/v) agitando en N,N-dimeti....

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Resultados

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del proceso de fabricación del andamio tubular de dos capas PU-PCL. La solución de PU fue electrospun de una aguja de 18 G para hacer una estructura interna cilíndrica con un espesor de 200 m. Luego, el PCL fundido se imprimió en la pared exterior de la nanofibra de la PU a intervalos regulares. La morfología superficial de las paredes internas y externas del andamio tubular completado se puede ver en las imágenes d.......

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Discusión

Los estudios en animales existentes sobre esofagia artificial siguen estando limitados por varios factores críticos. El andamio esofágico artificial ideal debe ser biocompatible y tener excelentes propiedades físicas. Debe ser capaz de regenerar el epitelio de la mucosa en el período postoperatorio temprano para evitar fugas anastomóticas. La regeneración de las capas musculares longitudinales circulares y externas internas también es importante para la peristalsis funcional12,

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Divulgaciones

Se ha comercializado el sistema de biorreactor diseñado para este estudio (número de modelo: ACBF-100).

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de I+D de La Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria Sanitaria de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de concesión: HI16C0362) y el Instituto de Investigación en Ciencias Básicas Programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1C1B2011132). Los bioespecímenes y los datos utilizados en este estudio fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Universitario Nacional de Seúl, miembro de Korea Biobank Network.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jaula metabólicaTEUNGDO BIO & PLANTAJD-C-66
Zoletil (dosis de 50 mg/g)Virbac1000000188
0,25% Tripsina-EDTAGibco25200-056
1 mL JeringaBD309659
2% clorhidrato de xilacina (Rumpun)ByelyQ-0615-035
4% paraformaldehídoBIOSOLUTIONBP031
4-0 VicrylETHICONW9443
9-0 VicrylETHICONW2813
Antibiótico gentamicina (Septopal).Septopal0409-1207-03
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma5470
Tampón de citrato, ph6.0, 10XSigmaC9999
DAB KIT DE SUSTRATO DE PEROXIDASAVECTORSK4100
DesminSanta Cruzsc-23879
Kit de tinción elásticaScyTeKETS-1
EtanolEtanol100983
MerckMerck 64-17-5
Fetal Bovino Serun (FBS)Gibco16000-044
GlutaraldehídoSigma354400
Cabra anti-ratón IgG (H+L) Anticuerpo secundarioThermoFisherA-11001
Tapón de heparinaHyupsung MedicalHS-T-05
hMSC (STEMPRO) / medio de crecimiento
(MesenPRO RSTM)
InvitrogenR7788-110
Kit conjugado con peroxidasa de rábano picante (Vectastain)VECTORPK7800
Peróxido de hidrógenoJUNSEI7722-84-1
Keratin13NovusNBP1-97797
VIVO/MUERTO Kit de ensayo de viabilidadSondas molecularesL3224
MatrigelCorning354262
N,N-dimetilformamida (DMF)Sigma227056
Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos no adherentes
.
Corning3738
OsO4SigmaO5500
Placa de PetriEppendorf3072115
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco10010-023
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10XBIOSOLUTIONBP007a
(PCL)Sigma440744
Polímero de poliuretano (PU+A2:A24)Lubrizol2363-80AE
Fuente de alimentaciónNanoNCHV100
ProLong Reactivo antidecoloración de oro con DAPIInvitrogenP36931
RumpunBayerQ-0615-035
Tubo en T de siliconaSewoon Medical2206-005
Pomada ocular de terramicinaPfizer Pharmaceutical Korea W01890011
Tiletamina/Zolazepam (Zoletil)Laboratorios VirbacQ-0042-058
Kit de tinción tricrómicoScyTeKTRM-1
von Willebrand Factor (vWF)Santa Cruzsc 14014
Polímero de policaprolactona

Referencias

  1. Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
  2. Flanagan, J. C., et al.

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