Supervivencia de células Purkinje en cultivos de rebanadas de cerebeloso organotípico

Resumen

Los cultivos de rodajas organotípicas son una poderosa herramienta para estudiar los procesos neurodesarrollo o degenerativos/regenerativos. Aquí, describimos un protocolo que modela la muerte del neurodesarrollo de las células de Purkinje en cultivos de rebanadas cerebelosas de ratón. Este método puede beneficiar la investigación en el descubrimiento de fármacos neuroprotectores.

Resumen

El cultivo de rebanadas organotípicas es un potente modelo in vitro que imita las condiciones in vivo más de cerca que los cultivos celulares primarios disociados. En el desarrollo postnatal temprano, se sabe que las células de Purkinje cerebelosas pasan por un período vulnerable, durante el cual se someten a muerte celular programada. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar la cultura de corte cerebelosa organotípico de ratón durante este momento crítico. Las rodajas se etiquetan además para evaluar la supervivencia celular de Purkinje y la eficacia de los tratamientos neuroprotectores. Este método puede ser extremadamente valioso para detectar nuevas moléculas neuroactivas.

Introducción

El modelado in vitro es una herramienta esencial en la investigación biomédica. Permite a los investigadores estudiar y controlar estrechamente mecanismos específicos en tipos de células restringidas, o en sistemas u órganos aislados. El cultivo de rebanadas organotípicas es una técnica in vitro ampliamente utilizada, especialmente en el campo de la neurociencia¹. El método fue establecido por primera vez por El sr. G-hwiler, que cultivaba rebanadas cerebrales usando la técnica de tubo de rodillo^2,y más tarde modificado por Yamamoto et al., que introdujeron el uso de una membrana microporosa para realizar cultivos de rebanadas corticales³. En comparación con los cultivos celulares primarios, los cultivos de rebanadas organotípicas presentan la ventaja de preservar la citoarquitectura del tejido, así como las conexiones celulares nativas en el plano de la sección del tejido.

Las rebanadas organotípicas se han cultivado desde muchas partes del sistema nervioso central, como el hipocampo^4,la corteza^5,el estriado^6,el cerebelo^4,7,y la médula espinal^8,9,entre otros. Se ha demostrado que son una herramienta poderosa en los estudios de descubrimiento de fármacos¹⁰. Los efectos de las moléculas neuroactivas se pueden evaluar de muchas maneras: supervivencia y neurodegeneración mediante inmunomanchas y ensayos bioquímicos, formación de circuitos neuronales, o interrupción mediante electrofisiología y imágenes en vivo.

El objetivo de este trabajo es describir un método simple para realizar el cultivo organotípico de rodajas cerebelosas, que se sabe que es un modelo relevante para imitar el desarrollo cerebeloso in vitro. Particularmente, nos centramos en el estudio de la muerte del desarrollo celular de Purkinje. In vivo, las células de Purkinje se someten a apoptosis durante la primera semana postnatal, alcanzando su punto máximo en el día postnatal 3 (P3)¹¹. El mismo patrón se observa en el cultivo de rodajas cerebelosas, con las neuronas Purkinje muriendo por apoptosis cuando la cerebella se toma de animales entre P1 y P8, con un pico en P3^4,12. El uso de los cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas ha permitido identificar varias moléculas neuroprotectoras^7,13, así como la comprensión de parte de los mecanismos involucrados en esta muerte celular programada^14,15,16. Aquí, describimos un protocolo basado en el estudio de Stoppini et al.¹⁷ en el hipocampo, y adaptado al cerebelo por Dusart et al.⁴ Incluye disección rápida y corte de cerebella postnatal; cultivo de corte en un inserto de cultivo celular que contiene una membrana microporosa, con o sin tratamiento neuroprotector; y la tinción de inmunofluorescencia para evaluar la supervivencia neuronal.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el comité de estudios de animales de la Universidad Northwestern.

1. Preparación previa a cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas

1. En una campana de cultivo celular rociada con 70% de etanol de antemano, prepare 200 ml de medio de cultivo en un filtro de vacío de 250 ml de botella-tapa unido a un receptor de botella estéril. Añadir 100 ml de águila basal media (BME), 50 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), 50 ml de suero de caballo activado por calor, 1 ml de L-glutamina (concentración final 1 mM) y 5 ml de glucosa de 200 g/L (concentración final 5 mg/ml). Filtrar al vacío el medio de cultivo y mantenerlo a +4 oC durante un mes.
2. En el gabinete de bioseguridad esterilizado, saque una placa de cultivo de 6 pocillos de su paquete. Llenar cada pozo con 1 mL de medio de cultivo. Si se prueba un tratamiento, añada el agente farmacológico al pozo tratado y el mismo volumen de solución del vehículo para el pozo de control. En el presente estudio, añadimos 1 l de solución estéril de 3 M KCl al pozo tratado (30 mM final) y 1 l de agua estéril a los pozos de control.
3. Lleve dentro de la campana de cultivo celular el número necesario de insertos de cultivo celular envueltos individualmente con membrana de politetrafluoroetileno hidrófilo (PTFE) (tamaño de los poros a 0,4 m). Desenvuélvalos con cuidado y saque las inserciones de cultivo celular con fórceps estériles. Colóquelos uno por uno en un pozo de una placa de 6 pocillos, evitando burbujas en la interfaz entre la membrana de inserción y el medio de cultivo celular. Dejar que las plaquitas equilibran en el medio en una incubadora de CO₂ de 37oC, 5% durante al menos 2 h antes del cultivo.
   NOTA: El helicóptero de tejido reside permanentemente en la campana de cultivo celular.
4. Preparar dos vasos de 200 ml, uno lleno de 150 ml de agua estéril, y el otro lleno de 150 ml 70% de etanol. Sumerja las herramientas quirúrgicas en el baño de etanol del 70% y luego en agua antes de usarlas.
   NOTA: No utilice herramientas quirúrgicas inmediatamente después del contacto con etanol.
5. Desinfecte la hoja de doble filo en el vaso de precipitados de etanol del 70%. Colóquelo en el soporte de la hoja con fórceps estériles y sosténgaslo en su lugar con la llave de la abrazadera de la hoja. Dejar secar hasta que se use.
6. Desinfecte el disco de plástico suministrado con el helicóptero de tejido en el vaso de precipitados de etanol del 70%. Rocíe la mesa de corte con 70% de etanol antes de colocar el disco sobre ella. Dejar secar hasta que lo use.

2. Disección y Cerebelosa Culturas de Rebanadas Organotípicas

1. Lleve el cachorro de ratón dentro de la capucha de cultivo celular para realizar la disección.
2. Decapitar al cachorro rápidamente usando tijeras rectas de funcionamiento(Figura 1A).
3. Mientras sostiene la cabeza del cachorro por la nariz con fórceps de apósito recto, abre el cuero cabelludo usando tijeras de ojos rectas, comenzando desde el extremo posterior, y yendo lateral a la línea media.
4. Proceda de forma idéntica para el cráneo.
   NOTA: Asegúrese de apuntar las puntas de las tijeras hacia afuera para evitar dañar el cerebelo durante la disección.
5. Saque el cerebro y transfiéralo a un plato de 60 mm lleno de HBSS frío + 5 mg/ml de glucosa.
6. Diseccionar cuidadosamente el cerebelo usando fórceps finos rectos estériles(Figura 1B). Transfiera al disco de plástico colocado en la mesa de corte del helicóptero de tejido utilizando fórceps finos curvos estériles.
7. Orientar el tejido girando la mesa de corte para realizar secciones parasagitales.
8. Mueva la mesa de corte tirando de la perilla de liberación de la mesa hacia la derecha, para que la hoja se coloque en el borde del tejido.
9. Ajuste el espesor de la rebanada a 350 m y la velocidad de la hoja a medio.
10. Arranca el helicóptero. Una vez cortado todo el cerebelo(Figura 1C),apague el helicóptero.
11. Retire el disco de plástico con fórceps estériles.
12. Lleve cuidadosamente el disco de plástico cerca de una placa de 60 mm que contenga HBSS + 5 mg/ml de glucosa. Pipetear en frío HBSS + 5 mg/ml de glucosa en el tejido utilizando una pipeta de transferencia estéril para permitir la cosecha de rodajas de cerebelosa en el plato lleno de tampón.
13. Separelas las rodajas cerebelosas entre sí usando una microsonda. Saque secciones de buena calidad con la pipeta de transferencia (se recomienda utilizar secciones de tejido cercanas a la vermis) y dejarlas en una plaquita de cultivo celular preequilibrada(Figura 1D).
14. Coloque las rodajas cerebelosas en el inserto de cultivo celular utilizando la microsonda y, a continuación, retire cuidadosamente el exceso de solución de glucosa HBSS + 5 mg/ml con la pipeta de transferencia.
    NOTA: En esta etapa el tejido es extremadamente sensible y propenso a daños físicos. El número máximo de rodajas cerebelosas por inserción de cultivo celular depende de la edad del animal donante. Se pueden cultivar de 6 a 8 rebanadas para un animal de P0-P4, y de 4 a 6 rebanadas para animales mayores de P5.
15. Coloque el plato de cultivo en la incubadora, cambiando el medio por completo cada 2-3 días.
16. Para evaluar la supervivencia celular de Purkinje, las rodajas se pueden recolectar tan pronto como 5 días in vitro. Para otros fines, se pueden mantener en cultivo durante varias semanas(Figura 1F).
    NOTA: En el caso de los experimentos de supervivencia celular de Purkinje, no es necesario renovar el tratamiento farmacológico al cambiar el medio de cultivo celular(Figura 1F).

3. Inmunofluorescencia

1. Saca la placa de 6 pocillos de la incubadora. Retire el medio de cultivo celular, lave el inserto de cultivo celular con 1pbS y fije las rodajas con una solución fría de paraformaldehído del 4% durante 1 h, con 1 ml debajo de la plaquita de cultivo celular y 500 ml encima de la plaquita de cultivo celular.
2. Lavar las plaquitas 4x 10 min con 1x PBS, con 1 ml debajo y 500 l en la parte superior de la plaquita, en un agitador orbital.
3. Con un cepillo, transfiera las rodajas cerebelosas de 1 inserción de cultivo celular a 1 pozo de 24 pozos precargados con 1pbS, 0.25% Triton X-100 y 3% BSA (PBS-TB), 500 ol/bien.
4. Permeabilizar y bloquear las rodajas por incubación en PBS-TB durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Incubar con anticuerpos primarios diluidos en la solución de PBS-TB, durante la noche a + 4 oC, en un agitador orbital, 200 l/bien.
6. Al día siguiente, realizar cuatro lavados de 10 min con 1x PBS, en un agitador orbital, 500 l/bien.
7. Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en la solución de PBS-TB, dos horas a temperatura ambiente, en un agitador orbital, y protegidos de la luz, 200 l/bien.
8. Realizar cuatro lavados de 10 min con 1x PBS, en un agitador orbital, 500 l/bien.
9. Contranasal las rodajas con Hoechst 33342, diluido en 1x PBS (2 g/ml), durante 10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz, 500 l/pozo.
10. Monte las rodajas cerebelosas en una corredera de microscopía con una pipeta de transferencia. Deja que se sequen completamente al aire, protegidos de la luz. Rehumidificarlos con 1pbS y aplica un cubreobjetos cubierto con unas gotas de medio de montaje (80 l). Evite hacer burbujas.
11. Una vez que el medio de montaje se ha curado, las secciones cerebelosas están listas para ser imágenadas.

4. Imagen y cuantificación de la supervivencia celular

1. Encienda el microscopio y los láseres de acuerdo con las instrucciones del fabricante y/o del núcleo de imágenes.
2. Inicie el software de adquisición.
3. Usando un objetivo 10X, localiza rodajas cerebelosas no alteradas que presentan de 9 a 10 lóbulos (generalmente secciones cerebelosas cercanas a los vermis).
4. Active la adquisición de la pila z. Defina el rango de la pila z para incluir todas las células de Purkinje presentes en la rebanada cerebelosa. Establezca un tamaño de paso de 2 m e inicie la adquisición. Guarde la imagen adquirida en el formato del fabricante del software de adquisición para conservar los metadatos asociados.
5. Abra el archivo adquirido en ImageJ utilizando el plugin Bioformatos¹⁸.
6. Vaya a Imagen > Pilas > Proyecto Z... (Figura 2A).
7. Elija Intensidad máxima en el menú desplegable Tipo de proyección y haga clic en Aceptar (figura 2B).
8. Se generará una imagen 2D aplanada. Haga doble clic en la herramienta Multipunto para permitir que aparezca la ventana Herramienta Punto. Desactive la opción Puntos de etiqueta para facilitar la visualización de celdas contadas. A continuación, haga clic directamente en un soma de una célula de Purkinje para comenzar a contar (Figura 1E). El número total de celdas contadas se indicará en la parte inferior de la ventana Herramienta Punto (Figura 3).
   NOTA: Por lo general, se pueden cuantificar al menos 3 secciones no dañadas que contienen de 9 a 10 lóbulos por plaquita de cultivo celular. Para evaluar el efecto neuroprotector de un agente farmacológico, se deben realizar al menos 3 experimentos independientes.

Resultados

Como se muestra en la Figura 4, este protocolo produce cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas en los que se puede evaluar la supervivencia celular de Purkinje siguiendo los pasos de inmunofluorescencia y adquisición de imágenes. Las células purkinje fueron etiquetadas con una combinación de anticuerpos anti-Calbindin D-28K (dilución 1/200) y Alexa594 anti-ratón (dilución 1/300). La costura de imágenes se realizó automáticamente mediante el software de adquisición de microscopios (NIS-...

Discusión

El cultivo de rodajas cerebelosa es una poderosa herramienta para estudiar la muerte celular programada de Purkinje durante el desarrollo postnatal. Esta técnica se puede utilizar para examinar rápidamente las moléculas candidatas para su potencial neuroprotector. La principal ventaja es que la configuración es simple y muy rentable, y sólo requiere una inversión modesta en equipos (un vibratome puede costar hasta 3 veces más que un helicóptero de tejido). Además, se pueden generar de 10 a 15 rodajas sanas a partir de un...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Ratón Anticuerpo secundario IgG	ThermoFisher scientific	A21203
Basal Medium Eagle (BME)	ThermoFisher scientific	21010046
Cabina de bioseguridad Clase II, Tipo A2	NuAire	NU-540-400
Albúmina sérica bovina	Millipore Sigma	A2153
Cepillo
anticuerpo anti-Calbindina D-28K (CB-955)	Abcam	ab82812
Incubadora de CO2	NuAire	NU-5700
Corning Costar Fondo plano 6 pocillos Placas de cultivo celular Fisher	Scientific	07-200-83
Cubreobjetos, 22 x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-E
Pinzas de vendaje, rectas	Harvard Apparatus	72-8949
Cuchillas de doble filo	Fisher Scientific	50949411
Etanol 200 a prueba	Decon Labs, Inc	2701
Tijeras de ojo, rectas	Harvard Apparatus	72-8428
Pinzas finas	Fisher Scientific	16-100-127
L-Glutamina 100X	ThermoFisher scientific	25030149
Solución de glucosa	ThermoFisher científico	A2494001
Hanks' Solución salina equilibrada	ThermoFisher scientific	14025092
Hoechst 33342, triclorhidrato, trihidrato	Fisher Scientific	H21492
Suero de caballo, inactivado por calor, origen neozelandés	ThermoFisher scientific	26050088
ImageJ
McIlwain Picador de tejidos	Fisher Scientific	NC9914528
Microsondas	Fisher Scientific	08-850
Insertos de cultivo celular de miliceldas	Millipore Sigma	PICM0RG50
Nalgene Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido con membrana PES, 250 mL	ThermoFisher scientific	168-0045
Sistema de microscopio láser confocal Nikon A1R
NIS-Elements	Nikon
Paraformaldehído Acros	Organics	41678-0010
Pipetas Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
Cloruro de potasio	Fisher Scientific	BP366-500
ProLong Gold Antidecoloración Mountant	ThermoFisher scientific	P10144
Tijeras de operación, rectas	Aparato Harvard	72-8403
Agitador orbital Bailarina del vientre	IBI Scientific	BDRLS0003
Prisma 8	Portaobjetos de
Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
60 mm con anillo de agarre	Fisher Scientific	FB012921
Placa de cultivo de tejidos, 24 pocillos	Falcon/Corning
Pipetas de transferencia estériles	ThermoFisher scientific	13-711-21
Triton X-100	ThermoFisher scientific	BP151-500

Software de procesamiento de imágenes Nikon microscopio GraphPad Plato de cultivo de tejidos , 353047