Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro

Resumen

Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.

Resumen

Las micobacterias, incluyendo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causante de la tuberculosis humana, liberan naturalmente vesículas extracelulares (EV) que contienen moléculas inmunológicamente activas. El conocimiento sobre los mecanismos moleculares de la biogénesis vesícula, el contenido de las vesículas y sus funciones en la interfaz patógeno-huésped es muy limitado. Abordar estas preguntas requiere procedimientos rigurosos para el aislamiento, purificación y validación de vehículos eléctricos. Anteriormente, se encontró que la producción de vesículas se mejoró cuando M. tuberculosis estaba expuesta a una restricción de hierro, una condición encontrada por Mtb en el entorno huésped. Aquí se presenta un protocolo completo y detallado para aislar y purificar los vehículos eléctricos de las micobacterias con deficiencia de hierro. Se aplican métodos cuantitativos y cualitativos para validar los vehículos eléctricos purificados.

Introducción

Las vesículas extracelulares micobacterianas (MEV) son nanopartículas unidas a la membrana, de 60 a 300 nm de tamaño, liberadas naturalmente por micobacterias de crecimiento rápido y lento¹. Los MEV liberados por micobacterias patógenas constituyen un mecanismo para interactuar con el huésped a través de proteínas inmunológicamente activas, lípidos y glucólidos secretados de manera concentrada y protegida^2,3,4. Para caracterizar MEVs y comprender su biogénesis y funciones, son cruciales métodos estrictos y eficientes de purificación y validación de vesículas. Hasta ahora, los MEV se han aislado de los filtrados de cultivo de micobacterias cultivadas en un medio rico en hierro^1,5,6,7,8.

Sin embargo, trabajos anteriores demostraron que la limitación del hierro estimula en gran medida la liberación de vesículas en Mtb, posiblemente para capturar hierro a través de mycobactin, un siderophore secretado en MEVs⁹. Aunque se han descrito procedimientos para el aislamiento de MEV de Mtb cultivadoen en medios de hierro alto, no se ha informado de una metodología eficiente para obtener MEV de cultivos de hierro bajos. Por lo tanto, el objetivo de este método es aislar, purificar y cuantificar los MEV obtenidos de cultivos de hierro bajos para que puedan ser utilizados para ensayos bioquímicos y funcionales y para el análisis de determinantes genéticos de la producción de vesículas en micobacterias.

Protocolo

1. Preparación del medio definido agotado de hierro

1. Preparar 1 L de medio mínimo (MM) disolviendo 5 g de KH₂PO₄, 5 g de L-asparagina, 20 ml de glicerol, y 2 g de dextrosa en 900 ml de agua desionizada en un recipiente de plástico. Evite el vidrio para evitar la contaminación del hierro. Ajuste el pH a 6,8 con 5 NaOH y el volumen a 1 L con agua.
2. Añadir 50 g de resina quelante metálica (MCR) y agitar suavemente con una barra de agitación magnética durante 24 h a 4oC. Esterilice y retire el MCR por filtración a través de una unidad de filtro de 0,22 m con un receptor de plástico. Para acelerar la filtración y evitar la obstrucción del filtro, deje que el sedimento de resina durante unos 30 minutos antes de la filtración.
   NOTA: Este medio contiene menos de 2 m de hierro residual, según lo determinado por la espectroscopia de absorción atómica.
3. Suplemento MM con 0,5 mg/L de ZnCl_2,40 mg/L de MgSO₄y 0,1 mg/L de MnSO_4. Por separado, preparar las existencias concentradas (1,000x) de cada uno de los suplementos de metal en agua desionizada y esterilizar por filtración antes de la suplementación MM. MM de metal suplementado con material de hierro agotado se denominará aquí MM de hierro bajo (LIMM).
4. A partir de un stock de 50 mM de FeCl₃ disuelto en 10 mM HCl, añadir 1 mL a 1 L de LIMM (concentración final de 50 M) para preparar MM de hierro alto (HIMM).

2. Crecimiento de las micobacterias en condiciones limitadas de hierro

1. Descongelar 50 l de una población congelada de 15% de glicerol de Mtb y rayar una placa de agar complementada con 10% de enriquecimiento de ADN (5 g/L de albúmina, 2 g/L dextrosa y cloruro de sodio de 0,85 g/L, 0,2% glicerol y 0,05% de tween-80)¹⁰. Incubar la placa a 37oC hasta que las colonias sean visibles.
2. Inocular una sola colonia de Mtb¹⁰ en 2 ml de caldo micobacteriano medio(Tabla de Materiales)complementado con enriquecimiento ADN. Incubar con agitación a 37oC.
3. Deje que el cultivo de Mtb crezca hasta la fase logarítmica tardía (OD₅₄₀ es 0,8). Para comprobar esto, mida el OD₅₄₀ usando un espectrofotómetro.
4. Esparcir 200 l del cultivo logarítmico tardío en las placas de agar micobacterianos(Tabla de Materiales)complementado con 0.2% de glicerol, 0.05% Tween-80, y ADN. Inocular al menos 5 placas. Incubar las placas a 37oC hasta que el crecimiento bacteriano sea visible como una capa de confluente. Esto toma 1 semana para Mtb.
5. Humedezca un hisopo de algodón estéril en LIMM. Utilice este hisopo para recoger bacterias de las placas de agar e inocular 100 ml de LIMM para preparar una suspensión bacteriana concentrada con una DoP₅₄₀ de 1,0 euros.
6. Diluir esta suspensión 10 veces a 1 L con LIMM y dividirla en dos botellas de plástico estériles de 2 L, cada una de las cuales contenga 500 ml de cultivo.
7. Saque 2 ml de cultivo y transfiéralo a un tubo de cultivo de 5 ml. Añadir 10 s de 10% vol/vol tyloxapol.
8. Incubar las culturas a 37oC de pie durante 14 días.

3. Colección de MEVs

1. Mida la OD₅₄₀ del cultivo de 2 ml en el momento de la recolección. Hacer diluciones en serie 1:10 del cultivo y la placa 100 l de cada dilución en placas de agar con ADN y 0,05% de Tween-80.
2. Transfiera el cultivo a cinco tubos centrífugos cónicos de 225 ml y centrífuga a 2.850 x g durante 7 min a 20 oC.
3. Recoger el sobrenadante de cultivo con una pipeta de 50 ml y filtrar lo esterilizar a través de una unidad de filtro de 0,22 m.

4. Aislamiento de MEV

1. Transfiera el filtrado de cultivo a un sistema de ultrafiltración de células agitadas colocado a 4 oC y filtre el concentrado a <50 psi a través de una membrana de corte de 100 kDa a 50 ml.
2. Centrifugar el filtrado de cultivo concentrado a 15.000 x g durante 15 min a 4oC y recoger el sobrenadante.
3. Centrifugar el filtrado de cultivo en tubos de ultracentrifugación de policarbonato a 100.000 x g durante 2 h a 4oC.
4. Resuspenda los gránulos membranosos en un total de 1 ml de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) mediante pipeteo suave.
5. Mezclar 0,5 ml de la suspensión de pellets obtenida en el paso 4.4 con 1,5 ml de solución de iodixanol al 60%, produciendo una concentración final de iodixanol del 45% wt/vol. Dispensar esta mezcla en la parte inferior de un tubo ultracentrífugo de pared delgada de polipropileno de 13 mm x 51 mm.
6. Superponer la suspensión MEV-iodixanol 45% con 1 ml de 40%, 35%, 30%, 25% y 20% (vol/vol en PBS) soluciones de iodixanol y 1 ml de PBS en la parte superior.
7. Centrífuga a 100.000 x g durante 18 h a 4oC.
8. Recoja las fracciones de gradiente de densidad de 1 ml a partir de la parte superior utilizando una jeringa Hamilton de 1 ml.
9. Diluir cada fracción recogida a 20 ml con PBS y centrifugar a 100.000 x g durante 2 h a 4 oC.
10. Retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 0,5 ml de PBS. Conservar este pellet a 4oC.

5. Cuantificación de MEV

1. Mida la concentración de proteínas en cada fracción mediante un ensayo de Bradford(Tabla de materiales),siguiendo las directrices del fabricante.
2. Realizar análisis de lípidos de membrana.
   1. Incubar 10 l de cada fracción de gradiente con la sonda de membrana fluorescente 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonato (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos in 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PBS en 96 pocillos negros (TMA-DPH) a una concentración final de 1 g/ml en un volumen final de 50 ol de PB Placas.
   2. Incubar las placas a 33oC durante 20 min.
   3. Mida la fluorescencia a 360 nm de excitación y 430 nm de emisión.

6. Análisis cualitativo de los MEV

1. Realizar electroforesis proteica.
   1. Mezclar aproximadamente 1 g de muestras de MEV en 16 l con 4 l de tampón de carga de muestras de 5x (10% p/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v glicerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% p/v bromophenolazul azul) y calentar las muestras en tampón de muestra a 85 oC durante 5 minutos.
   2. Cargar en un gel¹¹ Tris/Glycine SDS-poliacrilamida al 10% y correr a 10 V/cm en tampón de carrera (base Tris de 25 mM, glicina de 190 mM, 0,1% SDS) hasta que el frente del tinte azul llegue al fondo del gel.
   3. Manchar el gel con una solución de tinción de proteínas ultrasensible(Tabla de materiales).
2. Realice la mancha de puntos.
   1. Cargar 2 ml de una suspensión MEV con una concentración de aproximadamente 0,5 g/l, y diluciones en serie dobles en una membrana de nitrocelulosa y procesar una mancha de puntos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Utilizar un antisuero criado en ratones contra una preparación de MEVs con una dilución de 1:5.000 como anticuerpo primario y un antiratón de cabra acoplado a la peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1:10.000 como anticuerpo secundario. Detecte complejos de anticuerpos antigen con un reactivo de detección de blotting de sustrato HRP adecuado y un sistema de imágenes.
3. Realice tinción negativa y microscopía electrónica.
   1. Fijar 250 éL de MEVs con 2% de glutaraldehído en 0,1 M de cacodilato a temperatura ambiente durante 2 h e incubar durante la noche en 4% de formaldehído, 1% de glutaraldehído y 0,1% PBS.
   2. Mancha las muestras fijas con tetróxido de osmio al 2% durante 90 min.
   3. Deshidratar en serie la muestra en etanol e incrustar la resina epoxi de Spurr.
   4. Observe los MEV bajo un microscopio electrónico de transmisión.

Resultados

Los MEV fueron purificados por sedimentación diferencial en un gradiente de densidad(Figura 1, Figura 2). En las condiciones descritas, los MEV se separaron principalmente en la fracción de gradiente 3 (F3), que corresponde al 25% de iodixanol. Esta conclusión se basa en la detección de proteínas, lípidos de membrana, visualización microscópica de MEV intactos, distribución del tamaño de nanopartículas y reactividad positiva con ...

Discusión

Múltiples métodos para purificar exosomas derivados de células eucariotas se han desarrollado¹². Por el contrario, hay información limitada sobre métodos eficaces para purificar los vehículos eléctricos derivados de bacterias⁷. El aislamiento eficiente de los vehículos eléctricos derivados de Mtb debe tener en cuenta las dificultades intrínsecas en el crecimiento de esta micobacterium patógena. Mtb tiene un largo tiempo de división (24 h) y debe manejarse en condiciones de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Célula agitada Amicon Modelo 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Sistema de ultrafiltración
BD Polipropileno 225 mL tubos cónicos	Fisher	05-538-61	Tubos centrífugos cónicos
Biomax 100 kDa membrana de ultrafiltración de corte	EMD Milipore	PBHK07610	membrana de ultrafiltración
Resina Chelex-100	Bio-Rad	142-2842	Metal resina quelante
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Placas de agar micobacteriano
Middlebrook 7H9 Caldo	BD Difco	271310	Medio de caldo micobacteriano
Membrana secante de nitrocelulosa	GE Healthcare	10600001	membrana secante
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Policarbonato ultra centrifugado tubos 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Tubos de ultra centrifugación de policarbonato 25 mm x 89 mm
Tubo de centrífuga de pared fina de polipropileno 13 mm x 15 mm	Beckman Coulter	344059	Tubo de centrífuga de pared fina de polipropileno 13 mm x 15 mm
Colorante de ensayo de proteínas	BioRad	5000006	Bradford Tinción de proteínas
SYPRO Ruby	Sondas moleculares	S12000	Tinción de proteínas ultrasensible
TMA-DPH	Sondas moleculares	T204	1-(4-trimetilamoniofenil)-6-fenil-1,3,5-hexatrieno p-toluenosulfonato
Matraces de filtración al vacío	CellPro	V50022	Unidad de filtro