Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Renat  N. Khaliullin; Jeffrey  M. Hendel; Adina Gerson-Gurwitz; Shaohe Wang; Stacy  D. Ochoa; Zhiling Zhao; Arshad Desai; Karen Oegema; Rebecca  A. Green

doi:10.3791/60362

Method Article

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

DOI:

10.3791/60362

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October 29th, 2019

Renat N. Khaliullin¹^,²^,³ , Jeffrey M. Hendel¹^,² , Adina Gerson-Gurwitz¹^,² , Shaohe Wang¹^,⁴^,⁵ , Stacy D. Ochoa¹^,⁶ , Zhiling Zhao¹^,⁷ , Arshad Desai¹^,² , Karen Oegema¹^,² , Rebecca A. Green¹^,²

¹Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, ³Recursion Pharmaceuticals, ⁴Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, ⁵Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, ⁶Department of Biology, San Diego State University, ⁷Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

Summary

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Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Abstract

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C. elegans es el sistema principal para el análisis sistemático de la especificación del destino celular y eventos morfogenéticos durante el desarrollo embrionario. Un desafío es que la embriogénesis se desarrolla dinámicamente durante un período de aproximadamente 13 h; esta escala temporal de medio día ha limitado el alcance de los experimentos limitando el número de embriones que se pueden crear imágenes. Aquí, describimos un protocolo de semi-alto rendimiento que permite la toma simultánea de imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo en 80-100 embriones con resolución de tiempo moderada, de hasta 14 condiciones diferentes, en una sola carrera nocturna. El protocolo es sencillo y puede ser implementado por cualquier laboratorio con acceso a un microscopio con capacidad de visita puntual. La utilidad de este protocolo se demuestra utilizándolo para crear una imagen de dos cepas personalizadas que expresan marcadores fluorescentes optimizados para visualizar aspectos clave de la especificación de la capa germinal y la morfogénesis. Para analizar los datos, se construyó un programa personalizado que recorta embriones individuales de un campo de visión más amplio en todos los canales, pasos z y puntos de tiempo y guarda las secuencias de cada embrión en una pila tiff independiente. El programa, que incluye una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar, agiliza el procesamiento de datos aislando, preprocesando y orientando uniformemente embriones individuales en preparación para la visualización o el análisis automatizado. También se suministra una macro ImageJ que compila datos de embriones individuales en un archivo multipanel que muestra la proyección de fluorescencia de máxima intensidad e imágenes de campo brillante para cada embrión en cada punto de tiempo. Los protocolos y herramientas descritos en este documento fueron validados utilizándolos para caracterizar el desarrollo embrionario tras el derribo de 40 genes de desarrollo descritos anteriormente; este análisis visualizó fenotipos de desarrollo previamente anotados y reveló otros nuevos. En resumen, este trabajo detalla un método de imagen de rendimiento semi-alto junto con un programa de recorte y una herramienta de visualización ImageJ que, cuando se combina con cepas que expresan marcadores fluorescentes informativos, acelera en gran medida los experimentos para analizar desarrollo embrionario.

Introduction

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El embrión C. elegans es un importante sistema modelo para la biología celular mecanicista y el análisis de la especificación del destino celular y eventos morfogenéticos que impulsan el desarrollo embrionario¹^,²^,³^,⁴ ^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Hasta la fecha, gran parte de la caracterización de eventos a nivel celular y especificación del destino celular en el embrión se ha ....

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Protocol

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1. Preparación de C. elegans Embryos para imágenes de semi-alto rendimiento

NOTA: El objetivo de esta parte del protocolo es cargar una población de embriones C. elegans semi-sincronizados (etapa de 2 a 8 celdas), diseccionados de cepas marcadoras adecuadas(Figura 2),en una placa de 384 pocillos con fondo de vidrio para la toma de imágenes. Otros formatos de placas también podrían funcionar, pero se prefieren las 384 placas de pozo porque el pequeño tamaño del pozo restringe la propagación de embriones a un área relativamente pequeña, lo que facilita la identificación de campos ....

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Results

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Un desafío significativo en la caracterización del efecto de las perturbaciones moleculares en el desarrollo embrionario de C. elegans es que los embriones tardan alrededor de 10 horas en progresar desde la primera escisión hasta el final del alargamiento a 20o¹⁶. Un método de semi-alto rendimiento en el que se pueden tomar imágenes simultáneas de grandes cohortes de embriones es útil para eventos en este escala temporal porque permite la toma de imágenes de múltiples condiciones en paral.......

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Discussion

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Este trabajo describe un conjunto de herramientas y métodos que se desarrollaron para permitir esfuerzos a mayor escala para perfilar la función de los genes en el desarrollo embrionario en C. elegans. Nuestro método de semi-alto rendimiento permite imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo embrionario a una resolución de 20 minutos para 80-100 embriones en un solo experimento. Si bien este protocolo se puede adaptar para su uso con cualquier cepa de marcador deseada, este trabajo demuestra el potencial del .......

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Acknowledgements

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S.D.O. fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales patrocinado por la Universidad de California San Diego Institucional De investigación y el Premio de Desarrollo Académico de Carrera (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. y K.O. contaron con el apoyo del Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, que también les proporcionó fondos de investigación utilizados para apoyar este trabajo. Estamos agradecidos a Andrew Chisholm por su consejo en las primeras fases de este proyecto, Ronald Biggs por las contribuciones a este proyecto después de la fase inicial de desarrollo del método, y Dave Jenkins y Andy Shiau por el apoyo y el acceso a la molécul....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Conjunto de tubo de aspiración	Drummond Scientific	2-000-000
Pipeta calibrada (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	CV1000
(15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscopio	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Portaobjetos de depresión (3 pocillos)	Erie Scientific	1520-006
	Nikon	SMZ-645
Centrífuga Eppendorf 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Código abierto	https://imagej.net/Fiji
M9 Laboratorio de tampón	preparado	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Tubo de microcentrífuga (1,5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Placas	Laboratorio Preparado	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Bisturí #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Pozos, F-fondo, Fondo de vidrio	Greiner Bio-One 781855
clorhidrato de tetramisol	Sigma Aldirch	T1512-10G
Pinzas, Dumont #3	Ciencias de la Microscopía Electrónica	0109-3-PO
Objetivo U-PlanApo (10 veces; 0,4 NA)	Olympus	1-U2B823
Objetivo U-PlanApo (60 veces; 1,35 NA)	Olympus	1-U2B832

Incluido con tubo cónico Microscopio de disección

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

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