Los cultivos organoides derivados del paciente de adenocarcinoma ductal pancreático son un modelo tridimensional rápidamente establecido que representa compartimentos de células tumorales epiteliales con alta fidelidad, lo que permite la investigación traslacional sobre esta malignidad letal. Aquí, proporcionamos métodos detallados para establecer y propagar organoides, así como para realizar ensayos biológicos relevantes utilizando estos modelos.
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Artículo de método
Aislamiento y caracterización de modelos de organoide de adenocarcinoma ductal pancreático derivados del paciente
En este artículo
Resumen
Resumen
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) se encuentra entre los tumores malignos más letales. Recientemente, se han descrito métodos de cultivo organoides de próxima generación que permiten el modelado tridimensional (3D) de esta enfermedad. Los modelos de organoides (DOP) derivados del paciente pueden aislarse tanto de muestras quirúrgicas como de pequeñas biopsias y formarse rápidamente en el cultivo. Es importante destacar que los modelos organoides preservan las alteraciones genéticas patógenas detectadas en el tumor del paciente y son predictivos de la respuesta al tratamiento del paciente, permitiendo así estudios traslacionales. Aquí, proporcionamos protocolos integrales para adaptar el flujo de trabajo de cultivo de tejidos para estudiar modelos de organoides 3D, matriz incrustada. Detallamos métodos y consideraciones para aislar y propagar organoides PDAC primarios. Además, describimos cómo se preparan los medios organoides a medida y se controla la calidad en el laboratorio. Por último, describimos los ensayos para la caracterización posterior de los modelos organoides, como el aislamiento de ácidos nucleicos (ADN y ARN), y las pruebas de fármacos. Es importante destacar que proporcionamos consideraciones críticas para implementar la metodología organoide en un laboratorio de investigación.
Introducción
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una enfermedad letal caracterizada por un diagnóstico tardío en la mayoría de los pacientes, una falta de terapias eficaces y una tasa de supervivencia global de 5 años resultante que permanece inferior al 10%1. Sólo el 20% de los pacientes son diagnosticados con una enfermedad localizada adecuada para la intervención quirúrgica curativa2,3. Los pacientes restantes son típicamente tratados con una combinación de agentes quimioterápicos que son eficaces en una minoría de pacientes4,5....
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Protocolo
Toda la recolección de tejido humano para uso de investigación fue revisada y aprobada por nuestra Junta de Revisión Interna (IRB). Todos los siguientes protocolos se realizan en condiciones asépticas en un entorno de laboratorio de cultivo de tejido de mamíferos.
1. Preparación de medios
- Preparación de medios condicionados.
NOTA: El medio organoide pancreático humano requiere abundantes factores de crecimiento y nutrientes, así como suplementos de medios acondicionados para proporcionar suficiente estimulación del crecimiento para la expansión de los organoides. Ambos medios acondicionados descritos a continuación se preparan ....
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Resultados
Para ilustrar los desafíos asociados con el aislamiento de los organoides de PDAC, mostramos el establecimiento de un cultivo organoide derivado del paciente a partir de una pequeña muestra de tumor hipocelular. Después del revestimiento inicial, sólo unos pocos organoides eran visibles por pozo, como se muestra en la Figura 1. A los organoides se les permitió crecer más grandes en el lapso de 2 semanas y se pasajeron de acuerdo con nuestro protocolo para establecer una cultura más robusta, .......
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Discusión
Aquí, presentamos protocolos actuales para aislar, expandir y caracterizar organoides PDAC derivados del paciente. Nuestra tasa de éxito actual de establecer el cultivo organoide es de más del 70%; por lo tanto, estos métodos aún no se han perfeccionado y se espera que mejoren y evolucionen con el tiempo. Se debe tener en cuenta el tamaño de la muestra, ya que PDAC tiene una celularidad neoplásica baja. En consecuencia, los especímenes pequeños contendrán pocas células tumorales, y sólo generarán un puñado de organoides........
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos el apoyo del UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, miembros del laboratorio Lowy, y el Departamento de Cirugía de UC San Diego, División de Oncología Quirúrgica. AML cuenta con el generoso apoyo de NIH CA155620, un su2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16) y donantes al Fondo para Curar el Cáncer De Páncreas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipeta de 12 canales (P20, P100 o P200) con puntas | |||
| Placas de 12 pocillos | Olympus | 25-106 | |
| Tubos cónicos LoBind de 15 ml | Eppendorf | EP0030122208 | |
| tubo de 15 ml Rotador y/o nutator | |||
| 37 ° C Incubadora de CO2 | |||
| C baño | |||
| 384 placas de pocillos | Corning | 4588 | Fijación ultra baja, negra y ópticamente transparente |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Libre de Animales Recombinante Humano EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Contador | |||
| Suplemento de B27 | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reactivo que despolimeriza el extracto de membrana basal a 4 & grados; C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Reactivo de viabilidad celular de luminiscencia |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computadora | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Solución de congelación celular |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Células | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Impresora de medicamentos | Tecan | D300e | Esta es la impresora de medicamentos que utilizamos en nuestro laboratorio |
| Excel | Para el análisis de datos | ||
| Pinzas de Graefe extrafinas | Herramientas de ciencia fina | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrina I (humano) | TOCRIS | 3006 | |
| Colágenonasa/hialuronidasa suave | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | solución de glutamina |
| Prisma | Para el análisis de datos | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| cultivo de tejidos de flujo laminar | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A células expresadoras | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Solución de almacenamiento de tejidos | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Extracto de membrana basal (BME), factor de crecimiento reducido |
| Mr. Frosty Freezing Contenedor | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-acetilcisteína | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamida | Sigma | N0636 | |
| Pipeta P1000 con puntas | |||
| Pipeta P200 con puntas | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicilina/Estreptomicina | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Unidades de filtro de flujo rápido (0.2 y micro; m) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| FGF-10 humano recombinante | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Bisturíes desechables estériles, hoja #10 | VWR | 89176-380 | |
| Centrífuga | |||
| Placas de cultivo de tejidos 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | solución de fenol ácido |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Cli....
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Reimpresiones y permisos
