Etiquetado e imágenes de placas amiloideas en el tejido cerebral utilizando la curcumina de polifenoles naturales

Panchanan Maiti; Alexandra Plemmons; Zackary Bowers; Charles Weaver; Gary Dunbar

doi:10.3791/60377

Artículo de método

Etiquetado e imágenes de placas amiloideas en el tejido cerebral utilizando la curcumina de polifenoles naturales

DOI:

10.3791/60377

⸱

1 de noviembre de 2019

Panchanan Maiti¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Alexandra Plemmons¹ , Zackary Bowers²^,³ , Charles Weaver⁵ , Gary Dunbar¹^,²^,³^,⁴

¹Field Neurosciences Institute, Ascension St. Mary's Hospital, ²Field Neurosciences Institute Laboratory for Restorative Neurology, Central Michigan University, ³Program in Neuroscience, Central Michigan University, ⁴Department of Psychology, Central Michigan University, ⁵Department of Health Sciences, Saginaw Valley State University

En este artículo

Resumen

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La curcumina es un fluoróforo ideal para el etiquetado y la toma de imágenes de placas de proteína beta amiloide en el tejido cerebral debido a su unión preferencial a la proteína beta amiloide, así como sus similitudes estructurales con otros colorantes de unión amiloide tradicionales. Se puede utilizar para etiquetar e imágenes de placas de proteína beta amiloide de manera más eficiente y económica que los métodos tradicionales.

Resumen

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La deposición de la proteína beta amiloide (A) en espacios extra e intracelulares es una de las patologías distintivas de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la detección de la presencia de A en el tejido cerebral AD es una herramienta valiosa para el desarrollo de nuevos tratamientos para prevenir la progresión de la AD. Se han utilizado varios colorantes clásicos de unión amiloide, fluorocromo, sondas de imagen y anticuerpos específicos de A- para detectar histoquímicamente A en el tejido cerebral AD. El uso de estos compuestos para la detección de A es costoso y consume mucho tiempo. Sin embargo, debido a su intensa actividad fluorescente, alta afinidad y especificidad para A, así como similitudes estructurales con los colorantes tradicionales de unión amiloide, la curcumina (Cur) es un candidato prometedor para el etiquetado y la toma de imágenes de placas de A en postmortem tejido cerebral. Es un polifenol natural de la hierba Curcuma longa. En el presente estudio, Cur se utilizó para etiquetar histoquímicamente placas A- tanto de un modelo genético de ratón de la enfermedad de Alzheimer 5x familial (5xFAD) como del tejido AD humano en un minuto. La capacidad de etiquetado de Cur se comparó con los colorantes de unión amiloide convencionales, como el tioflavina-S (Thio-S), el rojo del Congo (CR) y el Fluoro-jade C (FJC), así como con los anticuerpos específicos de A- (6E10 y A11). Observamos que Cur es la forma más económica y rápida de etiquetar e imágenes de placas A- en comparación con estos colorantes convencionales y es comparable a los anticuerpos específicos de A. Además, Cur se une a la mayoría de las especies de A, como los oligómeros y las fibrillas. Por lo tanto, Cur podría ser utilizado como el agente de detección de fluorocromo más rentable, simple y rápido para placas A.

Introducción

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La enfermedad de Alzheimer es uno de los trastornos neurológicos progresivos más comunes, relacionados con la edad y una de las principales causas de muerte en todo el mundo¹^,². El aprendizaje, la memoria y el deterioro de la cognición, junto con los trastornos neuropsiquiátricos, son los síntomas comunes manifestados en ad^3. Aunque la etiología de la AD no ha sido completamente aclarada, la evidencia genética, bioquímica y experimental disponible indica que la deposición gradual de A es un biomarcador definitivo para AD^4. Esta proteína minimizada se acumula en e....

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Protocolo

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Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Universidad Estatal del Valle de Saginaw. El tejido humano se obtuvo de un banco cerebral establecido en el Instituto Banner Sun Health en Arizona¹⁵^,¹⁶.

1. Perfusión de los animales

Prepare los búferes fijador y de perfusión.
1. Preparar un tampón de fosfato sódico de 0,1 M añadiendo 80 g de cloruro sódico (NaCl), 2 g de cloruro de potasio (KCl), 21,7 g de fosfato de hidrógeno disódico (Na₂HPO₄x 7H₂O), 2,59 g de fosfato de dihidr....

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Resultados

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Etiquetas de curcumina placas A- en un minuto. Cuando teñimos el tejido 5xFAD con Cur, encontramos que las placas de la etiqueta Cur A en 1 min. Aunque el aumento del tiempo de incubación con Cur aumentó ligeramente la intensidad de fluorescencia de las placas de A, el número de placas observadas de A, no fue significativamente diferente entre 1 min y 5 min de tiempo de tinción(Figura 1).

Cur puede .......

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Discusión

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Nuestra hipótesis era que Cur podría ser utilizado como la forma más rápida, más fácil y menos costosa de etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral postmortem AD en comparación con otros colorantes clásicos de unión amiloide, así como anticuerpos específicos de A. Los objetivos de este estudio fueron determinar el tiempo mínimo necesario para etiquetar e imágenes de placas A- por Cur en el tejido cerebral postmortem AD y determinar si Cur puede ser utilizado como una alternativa al anticuerpo A- para etiquet.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El apoyo a este estudio vino del Instituto de Neurociencias de Campo en ascensión de Santa María.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	IHC world, Woodstock, MD
Un modelo animal de la enfermedad de Alzheimer	Laboratorio de Jackson, Bar Harbor, ME
Alcohol absoluto	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Anticuerpo 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Anticuerpo A11	Millipore, Burlington, MA
Microscopio óptico compuesto	Olympus, Shinjuku, Japón	Olympus BX51
Congo rojo	Sigma, St. Louis, MO
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, St. Louis, MO
Hidrógeno disódico fosfato	Sigma, St. Louis, MO
Plastificante de disestireno xileno	BDH, Dawsonville, GA
Papeles de filtro	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342	Sigma, St. Louis, MO
Microscopio fluorescente invertido	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Fluorescente invertido microscopio	Olympus, Shinjuku, Japón	Olympus 1x70
Suero de cabra normal	Sigma, St. Louis, MO
Parafina	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehído	Sigma, St. Louis, MO
Portaobjetos de vidrio cargado recubierto de estratagema y lisina	Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Cloruro de	potasioSigma, St. Louis, MO
Dihidrógeno fosfato de potasio	Sigma, St. Louis, MO
Azida de sodio	Sigma, St. Louis, MO
Cloruro de sodio	Sigma, St. Louis, MO
Hidróxido de sodio	EMD Millipore, Burlington, MA
Pentobarbital de sodio	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Tioflavina-S	Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xileno	VWR,Radnor, PA

Referencias

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Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
Tarawneh, R., Holtzman, D. M.

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Marcaje con curcumina microscop a de fluorescencia marcaje histoqu mico protocolo de perfusi n corte por criostato corte en parafina concentraci n de curcumina enfermedad de Alzheimer

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