Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.
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Artículo de método
Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
Los organoides cerebrales humanos diferenciados de las células madre embrionarias ofrecen la oportunidad única de estudiar interacciones complicadas de múltiples tipos de células en un sistema tridimensional. Aquí presentamos un método relativamente sencillo y barato que produce organoides cerebrales. En este protocolo las células madre pluripotentes humanas se dividen en pequeños racimos en lugar de células individuales y se cultivan en medios básicos sin una matriz de membrana de sótano hetróloga o factores de crecimiento exógenos, lo que permite que las señales intrínsecas de desarrollo crecimiento del organoide. Este sistema simple produce una diversidad de tipos de células cerebrales incluyendo células gliales y microgliales, células madre y neuronas del cerebro forebrain, cerebro medio y cerebro trasero. Los organoides generados a partir de este protocolo también muestran señas de identidad de una organización temporal y espacial adecuada demostrada por imágenes de campo brillante, histología, inmunofluorescencia y reacción en cadena cuantitativa de transcripción inversa en tiempo real ( qRT-PCR). Debido a que estos organoides contienen tipos celulares de varias partes del cerebro, se pueden utilizar para estudiar una multitud de enfermedades. Por ejemplo, en un artículo reciente demostramos el uso de organoides generados a partir de este protocolo para estudiar los efectos de la hipoxia en el cerebro humano. Este enfoque se puede utilizar para investigar una serie de condiciones difíciles de estudiar, como discapacidades del neurodesarrollo, trastornos genéticos y enfermedades neurológicas.
Introducción
Debido a innumerables limitaciones prácticas y éticas, ha habido una gran dificultad en el estudio del cerebro humano. Mientras que los estudios que utilizan roedores han sido críticos para nuestra comprensión del cerebro humano, el cerebro del ratón tiene muchas diferencias1,2. Curiosamente, los ratones tienen una densidad neuronal que es al menos 7 veces menor que el cerebro de primate3,4. Aunque los primates están más cerca de los seres humanos que los roedores desde un punto de vista evolutivo, no es práctico para la mayoría de los investigadores t....
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Protocolo
1. Mantenimiento de células madre
- Mantener H9 hESCs en una capa de factor de crecimiento reducido matriz de membrana sótano (ver la Tabla de Materiales, a partir de ahora simplemente se conoce como matriz) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Para recubrir un plato de 6 pocillos o un plato de 10 cm, combine 100 ml de matriz con 5,9 ml de medio Eagle modificado (DMEM) /F12 modificado de Dulbecco en frío. Envuelva las placas en una película de parafina y guárdelas durante la noche a 4oC. Utilícelos al día siguiente para pasar las células después de que se aspira el exceso de matriz/medios.
- Cultivo de ....
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Resultados
La Figura 1 muestra imágenes representativas de campo brillante de varios puntos de tiempo para demostrar cómo se ven las células/organoides a lo largo de las diferentes etapas del protocolo. Los hESC se extraían de la placa de cultivo de tejido, se dividieron en trozos pequeños y se colocaron en un matraz de fijación ultrabajo T75 donde formaron esferas. Es importante tener en cuenta que las células se ven brillantes y similares en tamaño, sin células oscuras y moribundas en los centros de .......
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Discusión
Al igual que otros modelos de organoides, este es un sistema artificial que viene con varias advertencias. Aunque había poca variación de lote a lote en términos de niveles generales de expresión, los organoides individuales mostraban diferencias. Por ejemplo, la ubicación de las áreas positivas de Sox-2 no era idéntica en todos los organoides(Figura 3). Mientras que qPCR es adecuado para buscar cambios generales en lotes de células, técnicas adicionales como RNAseq de una sola célula se utilizarán en es.......
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Divulgaciones
S.G.K. es miembro de SAB para Dansar IT y Gene-in-Cell.
Agradecimientos
Agradecemos al Núcleo de Células Madre de Yale (YSCC, por sus principales servicios) por su ayuda. Agradecemos al Dr. Jung Kim por su revisión de neuropatología. Este trabajo fue apoyado por Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes y NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), el Yale Cancer Center y el Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) y un generoso regalo sin restricciones de Joseph y Lucille Madri.
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Materiales
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU | A11035 | |
| B27 Suplemento | Gibco, Waltham, MA, EE. UU. | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU | . PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | Microscopio A9647 | |
| BX43 | Olympus, Shinjuku, Tokio, Japón | ||
| Tinción DAPI | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | D1306 | |
| Dispasa | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU | . 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, EE. UU. | ||
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| anticuerpo GFAP | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Factor de crecimiento Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, EE. UU | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, EE. UU. | WA09 | |
| Heparina | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU. | 1708880 | |
| Kit de síntesis de ADNc iScript | Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU | . 1708891 | |
| L-glutamina | Gibco, Waltham, MA, EE. UU | . 25030-081 | |
| Monotioglicerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, EE. UU | . 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, EE. UU. | 11140-050 | |
| Suero de burro normal (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EE. UU | ||
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, EE. UU | 25608-930 | |
| Ciencias de microscopía electrónica PFA, Hatfield, PA | RT15710 | ||
| Máquina de qPCR | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, EE. UU | 1855196 | |
| Kit RNeasy | Qiagen, Hilden, Alemania | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| Microscopio TMS-F | Nikon, Melville, NY, EE. UU | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | T8787-100ML | |
| Matraces de fijación ultra baja T75 | Corning, Corning, NY, EE. UU | . 3814 |
Referencias
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S.
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Reimpresiones y permisos
