Se presenta un protocolo para generar organoides endometriales primarios humanos que consisten en células epiteliales y estromales y retienen las características del tejido endometrial nativo. Este protocolo describe los métodos desde la adquisición de tejido uterino hasta el procesamiento histológico de organoides endometriales.
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Artículo de método
Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El endometrio humano es uno de los tejidos más hormonalmente sensibles en el cuerpo y es esencial para el establecimiento del embarazo. Este tejido también puede enfermarse y causar morbilidad e incluso la muerte. Los sistemas modelo para estudiar la biología endometrial humana se han limitado a los sistemas de cultivo in vitro de tipos de células únicas. Además, las células epiteliales, uno de los principales tipos celulares del endometrio, no propagan bien ni conservan sus rasgos fisiológicos en el cultivo, y por lo tanto nuestra comprensión de la biología endometrial sigue siendo limitada. Hemos generado, por primera vez, organoides endometriales que consisten en células epiteliales y estromales del endometrio humano. Estos organoides no requieren ningún material de andamio exógeno y se organizan específicamente para que las células epiteliales abarquen la estructura similar a los esferoides y se polarericen con células estromales en el centro que producen y secretan colágeno. Los receptores de estrógeno, progesterona y andrógenos se expresan en las células epiteliales y estromales y el tratamiento con niveles fisiológicos de estrógeno y testosterona promueven la organización de los organoides. Este nuevo sistema modelo se puede utilizar para estudiar la biología endometrial normal y la enfermedad de maneras que antes no eran posibles.
Introducción
El endometrio humano recubre la cavidad uterina y sirve como primer contacto para el embrión durante la implantación. El endometrio se compone de células epiteliales luminales y glandulares, fibroblastos estromales de apoyo, células endoteliales y células inmunitarias. Juntos, estos tipos de células conforman el tejido endometrial que es uno de los tejidos más sensibles a las hormonas esteroides sexuales1. Los cambios que ocurren durante cada ciclo menstrual son sorprendentes. Se requiere un crecimiento y remodelación adecuados del endometrio para permitir la implantación de embriones. Respuesta aberrante al estrógeno y la progesterona puede re....
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Protocolo
Se recogieron muestras de endometriales de mujeres premenopáusicas sometidas a histerectomía de rutina para afecciones uterinas benignas en el Hospital de Mujeres de la Universidad Northwestern Prentice, de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todas las mujeres incluidas en el estudio.
1. Preparación de moldes de agarosa
- Antes del inicio del aislamiento celular, moldee y equilibra 1.5% micromoldes de agarosa(Tabla de Materiales)para albergar los organoides de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Resultados
En la Figura 1se muestra un esquema del protocolo. El tejido uterino se obtuvo de la cirugía después de que fue examinado por los patólogos. El revestimiento endometrial se separó del miometrio raspando y el tejido endometrial se digería enzimáticamente a las células como se describe en el protocolo. Las células epiteliales y estromales se añadieron a los micropozos en los moldes de agarosa. Después de 7 días en cultivo, los organoides fueron tratados con E y T durante 7 a 14 días adicionale.......
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Discusión
Hemos generado organoides endometriales humanos compuestos por células epiteliales y estromales del endometrio sin el uso de materiales de andamios exógenos. Si bien ya se ha demostrado que las células epiteliales endometriales primarias pueden formar organoides6,7, estas células se incrustaron en una matriz gelatinosa de proteínas secretadas por las células del sarcoma del ratón (ver Tabla de Materiales)para ayudar a forman estructuras esferoide.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por la subvención NIEHS/NIH/NCATS UG3 (ES029073) y el fondo Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Nos gustaría reconocer el Centro Básico de Patología del Noroeste para procesar los organoides fijos para la incrustación de parafina. Nos gustaría reconocer a todo el equipo de UG3, incluidos los laboratorios Woodruff, Burdette y Urbanek, por las discusiones y colaboraciones perspicaces.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa HS, grado de biología molecular | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Moldes de agarosa | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Cloruro de amonio (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Colagenasa, Tipo II, polvo | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispasa | Corning | 354235 | |
| DNasa I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Tinción de eosina | VWR | 95057-848 | |
| Receptor de estrógeno (SP1), anticuerpo monoclonal de conejo | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield con DAPI, medio de montaje para histología | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x sin rojo, calcio, magnesio y fenol |
| Solución de tinción de hematoxilina | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 Formulación Harris | modificada, solución |
| heparina | Tecnologías | STEMCELL07980 | añadido a MammoCult media |
| Solución madre de hidrocortisona | STEMCELL Technologies | 07925 | añadido a MammoCult |
| media Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | suplementado con 2 µ L/mL de heparina y 5 µ L/mL de hidrocortisona |
| Paraformaldehído, solución al 16% | Microscopía Electrónica Ciencias | 15710 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Receptor de progesterona, PgR 1294, no conjugado, sobrenadante de cultivo | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| matriz de proteínas - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Anticuerpo anti-E-cadherina purificado de ratón | BD Biociences 610181 | 36 | |
| Anticuerpo anti-vimentina recombinante [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| Kit de lisis y aislamiento de ARN | Zymo Research | R2060 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterona | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Tinte tricrómico | Abcam | ab150686 | |
| Película de cera - Parafilm | VWR | 52858-000 |
Referencias
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualizati....
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Reimpresiones y permisos
