Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular

7.5K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/60401

⸱

4 de marzo de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.

Resumen

Ya en la década de 1970, los investigadores han trasplantado con éxito las células epiteliales mamarias a la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas. El injerto de epitelio mamario mediante técnicas de trasplante aprovecha el entorno hormonal proporcionado por el huésped adolescente. Estos estudios son ideales para explorar el impacto de varias manipulaciones biológicas en el desarrollo de la glándula mamaria y diseccionar muchos aspectos de la biología de la glándula mamaria. Una característica común, pero limitante, es que las células epiteliales trasplantadas están fuertemente influenciadas por el estroma circundante y son sube a la competencia por epitelio endógeno; para utilizar tejido mamario nativo, la almohadilla de grasa blanca abdominal-inguinal debe eliminarse para eliminar el epitelio mamario huésped antes del trasplante. Un obstáculo importante cuando se utiliza el organismo modelo de rata es que limpiar el árbol mamario en desarrollo en ratas post-dedianas no es eficiente. Cuando se trasplantan en almohadillas de grasa libres de glándulas, las células epiteliales del donante pueden repoblar la almohadilla de grasa del huésped limpiada y formar una glándula mamaria funcional. La almohadilla de grasa interescapular es un lugar alternativo para estos injertos. Una ventaja importante es que carece de estructuras ductales, pero proporciona el estroma normal que es necesario para promover el crecimiento epitelial y es fácilmente accesible en la rata. Otra ventaja importante de esta técnica es que es mínimamente invasiva, ya que elimina la necesidad de cauterizar y eliminar el creciente árbol mamario endógeno. Además, la almohadilla de grasa interescapular contiene un vaso sanguíneo medial que se puede utilizar para separar sitios para el injerto. Debido a que las glándulas endógenas permanecen intactas, esta técnica también se puede utilizar para estudios que comparan la glándula mamaria endógena con la glándula trasplantada. Este artículo describe el método de trasplante de células epiteliales mamarias en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas.

Introducción

El desarrollo de la glándula mamaria postnatal y la morfogénesis ductal son procesos influenciados en gran medida por la señalización hormonal al inicio de la pubertad. En ratones y ratas, comúnmente utilizados organismos modelo de la biología de la glándula mamaria, este proceso comienza alrededor de 3 semanas de edad, donde la rápida proliferación y diferenciación resultan en la formación del parénquima maduro. La glándula mamaria madura puede sufrir numerosas rondas de expansión e involución, una propiedad que ha estado siendo investigada desde principios delsiglo XX. En el contexto de la hiperproliferación y el desarrollo del cáncer, las técnicas de trasplante de glándulas mamarias se desarrollaron en la década de 19501,y se mejoraron con la metodología cuantitativa aportada por Gould et al. en 19772,3,4. El refinamiento de la técnica de trasplante en roedores ha contribuido a grandes avances en la comprensión de la biología normal de la glándula mamaria que todavía se utilizan ampliamente para estudiar el efecto de varios tratamientos y la manipulación genética en el desarrollo normal de la glándula mamaria y los estados de enfermedad.

Muchas hipótesis se han generado y probado posteriormente utilizando el trasplante de glándulas mamarias, descrito por primera vez por DeOme et al. en 19591. Los experimentos a lo largo de varias décadas mostraron la propensión del tejido ducal extirpado de las glándulas mamarias del donante a repoblar toda la almohadilla de grasa5,6,7 e indicaron que un componente crítico del desarrollo de la glándula mamaria reside en estas estructuras epiteliales. Estudios posteriores en ratones mostraron que una sola célula madre mamaria puede repoblar una almohadilla de grasa aclarada y contribuyó al descubrimiento de un progenitor único y común de células epiteliales mamarias basales y luminales8,9,10. En línea con estas conclusiones, se ha sugerido que el trasplante aumenta el conjunto de células con potencial de repoblación multilineaje como resultado de la plasticidad, permitiendo que las células injertadas crezcan una glándula mamaria funcional7,10,11,12,13. Es importante destacar que el uso de técnicas de trasplante en roedores supera las limitaciones de las anomalías inducidas por el cultivo celular14 y a menudo proporciona resultados en cuestión de semanas.

Mientras que el procedimiento fue descrito originalmente en el contexto de lesiones preneoplásicas en ratones, pronto se amplió a ratas y se utilizó junto con el tratamiento de carcinógenos para establecer la multiplicidad como una medida de la susceptibilidad al cáncer15,pero la popularidad de las técnicas de trasplante ha seguido el desarrollo de herramientas genéticas para cada especie. Aunque los estudios de ratón que incorporan trasplantes han contribuido con muchos hallazgos traslacionales, el parénquima de la glándula mamaria de la rata se asemeja más al humano más de16,17 y ofrece ventajas distintas para el estudio del cáncer de mama receptor-positivo de estrógeno (ER+). Los tumores mamarios son inducibles en ambas especies, pero difieren en términos de sensibilidad hormonal y perfiles de expresión génica. Una diferencia principal es que los tumores mamarios de ratas expresan y dependen de la función de los receptores de hormonas ováricas y pituitarias, a saber, estrógeno y progesterona (PR), similar al subtipo luminal-A del cáncer de mama humano. De hecho, el trasplante de células epiteliales mamarias, como se describe en este protocolo, se ha utilizado para estudiar las variantes genéticas implicadas en el cáncer de mama y determinar la autonomía celular de los efectos sobre las células epiteliales mamarias18.

Además de la biología tumoral, el epitelio ductal de la glándula mamaria de rata normal presenta un nivel más alto de ramificación y está flanqueado por una capa más gruesa de estroma que el ratón. La importancia del estroma está bien documentada en estudios de trasplante epitelial mamario. El epitelio mamario debe interactuar con el estroma graso, e idealmente su propio mesenquima, para someterse a su característica morfogénesis19,20. El injerto de tejido en una glándula mamaria receptora proporciona un ambiente óptimo; sin embargo, la presencia de epitelio endógeno puede interferir con los resultados. La prelimpieza de la glándula mamaria del epitelio endógeno se realiza comúnmente en ensayos de trasplante de ratón y requiere la escisión quirúrgica del tejido mamario endógeno y/o la extirpación del pezón1,21,22. Aunque es posible, prelimpiar el epitelio mamario en ratas post-destetaderas no es tan ampliamente realizado, principalmente debido a la ineficacia de limpiar el árbol mamario en crecimiento en ratas post-destete. Dado que se ha demostrado que las regiones de tejido adiposo en otras partes del cuerpo podrían apoyar el crecimiento del epitelio mamario trasplantado21,23,24, el proceso de prelimpieza se puede evitar fácilmente en ratas injertando tejido en la almohadilla de grasa blanca interescapular.

El método de trasplante descrito en este documento consiste en la inyección de organoides de la glándula mamaria disociadas enzimáticamente (fragmentos de epitelio ductal mamario y otros tipos de células capaces de morfogénesis) o células monodispersas en la almohadilla de grasa interescapular en cepas endogámicas, isogénicas o congénicas de ratas de laboratorio2. Debido a que la almohadilla de grasa interescapular normalmente está desprovista de tejido mamario, proporciona un entorno adecuado para múltiples sitios de trasplante sin la necesidad de pre-borrar epitelio endógeno. Como resultado, las glándulas mamarias endógenas, de la inguinal abdominal-inguinal del animal huésped no están sujetas a manipulación quirúrgica, se desarrollan normalmente y no pueden interferir con la interpretación de los resultados. Además, las glándulas mamarias intactas se pueden utilizar para la comparación para evaluar los efectos del huésped frente al donante en el desarrollo del epitelio mamario y la tumorigenesis18,25. Aunque la repoblación de la glándula mamaria a partir de una sola célula madre está disponible para ratones, todavía no se ha desarrollado para ratas, principalmente debido a la falta de disponibilidad de anticuerpos para seleccionar para las células madre mamarias de rata25,26,27. A pesar de esto, el trasplante de células epiteliales mamarias monodispersas para cuantificar el potencial de repoblación se puede realizar con éxito, y esas células se desarrollarán normalmente cuando se injerten en el marco apropiado2,3,4. Si bien los organoides son buenos para muchos propósitos, se requieren células monodispersas para aplicaciones cuantitativas, por ejemplo, para determinar el número de células epiteliales mamarias necesarias para la iniciación del cáncer tras el tratamiento de radiación ionizante28 o para comparar las características de las poblaciones de células epiteliales mamarias seleccionadas citométricamente29.

Hasta la fecha, el procedimiento descrito aquí es el método más robusto para realizar el trasplante de glándula sómariaense en la rata con un objetivo general de estudiar el desarrollo de la glándula mamaria y los mecanismos subyacentes al desarrollo del cáncer de mama. A menudo, el donante y/o los animales receptores están expuestos a diferentes variables antes, durante o después del trasplante epitelial. Algunos ejemplos son los estudios de un solo gen que implican carcinogénesis química30,radiación28,31,32,manipulación genética del genoma del huésped/donante18y manipulación hormonal12. Una de las principales ventajas de la disociación enzimática descrita en este protocolo es la oportunidad de aislar organoides epiteliales o células monodispersas para experimentos complementarios que implican citometría de flujo, cultivo 3D, edición de genes y más. Las aplicaciones futuras de esta técnica incluirán la manipulación adicional del donante y/o tejido huésped con ingeniería genética. Por ejemplo, las células del donante pueden ser alteradas genéticamente ex vivo en cualquier locus genómico elegido utilizando el sistema de edición de genes CRISPR-Cas9. Del mismo modo, las ratas receptoras también pueden ser alteradas genéticamente para estudiar la interacción entre los factores genéticos diseñados por donantes y receptores.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los animales fueron alojados y mantenidos en una instalación aprobada por la AAALAC, y los experimentos descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) MUSC. Los animales para su uso en trasplantes recíprocos deben ser una cepa endogámica o isogénica, con estado congénico preferido o cruzado durante al menos 6 generaciones.

1. Cosecha de epitelio de la glándula mamaria de la rata donante

  1. Determinar el número de ratas donantes necesarias para el trasplante.
    NOTA: Generalmente, 1 rata donante (4 semanas de edad) puede proporcionar suficientes células para el trasplante en 4 animales receptores. Ciertas aplicaciones de este protocolo requerirán un número adicional de celdas, y puede haber diferencias específicas de tensión en el rendimiento total.
  2. Etiquete todos los suministros y asegúrese de que el cirujano pueda acceder a un lugar accesible(Tabla 1).
  3. Registre el peso corporal de cada rata donante hembra. Siga las pautas institucionales para anestesiar o eutanasiar a la rata donante. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo.
  4. Mueva al animal al campo quirúrgico estéril. Coloque al animal en su espalda y rocíe toda la superficie ventral con 70% de etanol.
  5. Hacer una incisión sagital, en forma de X, permitiendo el acceso a las glándulas mamarias torácicas, abdominales e inguinales. Diseccionar todo el tejido de la glándula mamaria de la rata donante usando tijeras (Figura 1). Retire todos los ganglios linfáticos visibles.
  6. Extraiga el tejido mamario con fórceps y colóquelo en un plato etiquetado de 60 mm sobre hielo. Agregue 500 ml de medios DMEM/F12 sin suero a la placa de 60 mm. Ajuste la colocación del tejido de la glándula mamaria para que permanezca completamente húmedo.
  7. Picar finamente el tejido mamario usando tijeras. Para ello, cortar el tejido en trozos de 1-2 mm3 de tamaño(Figura 1C). Mantener la glándula sobre hielo hasta que se haya cosechado todo el tejido del donante (no exceda los 60 min).
    NOTA: El personal adicional puede picar las glándulas mamarias y preparar adicionalmente la solución de colagenasa mientras el cirujano procede con las extracciones de tejido.

2. Extraer tejido cerebral de donantes eutanasiados

  1. Gire cuidadosamente el cuerpo del animal donante para colocarlo en una posición propensa. Asegure con alfileres. Rocíe la cabeza y la parte superior de la espalda con 70% de etanol.
  2. Localice la base del cráneo y haga una incisión debajo de los cóndilos occipitales. Inserte tijeras afiladas debajo de la piel y corte la piel lejos del cráneo, incluidos los lados de la cabeza.
  3. Utilice cortadores de huesos o tijeras fuertes para cortar el cráneo a lo largo de la línea media, desde el occipital hasta los huesos frontales. Mantenga la hoja lo más superficial posible y angulo hacia arriba para evitar la destrucción del tejido cerebral subyacente.
  4. Pelar el hueso usando rongeurs o fórceps fuertes. Inserte la herramienta lateral al cerebelo para romper el hueso a cada lado, exponiendo el canal auditivo óseo. Cortar las conexiones a las meninges.
  5. Levante suavemente el cerebro con fórceps curvos de punta fina. Coloque el cerebro en un pedazo de papel de aluminio y registre el peso, y luego transfiera inmediatamente a un tubo de 15 ml con una cantidad igual (w:v) de medios, almacenado en hielo.
    1. Opcionalmente, utilice fórceps de punta fina para extraer la glándula pituitaria (ubicada debajo del cerebro) para uso adicional en el procedimiento de trasplante, si es necesario.
  6. Utilice un homogeneizador mecánico para interrumpir el tejido. Homogeneizar el cerebro durante 10-15 s a baja velocidad. Dejar que la mezcla se sente en hielo durante al menos 1 min, y luego homogeneizar de nuevo. La homogeneización es suficiente cuando la mezcla final está libre de piezas grandes.
  7. Filtrar el homogeneato pasándolo a través de un filtro de 100 m. Mantenga el filtrado sobre hielo hasta su uso (menos de 4 h).

3. Digestión y procesamiento de extractos de glándula mamaria

  1. Descongelar o calentar los reactivos indicados(Tabla 1). Siga los pasos adecuados para recuperar organoides o células monodispersas.
  2. Preparar 10 ml de medios de digestión libres de suero (sin colagenasa) para cada animal donante(Archivo Suplementario 1).
    NOTA: El volumen de los medios de digestión utilizados se puede ajustar (escalado hacia arriba o hacia abajo) para acomodar el tejido agrupado, si corresponde.
    1. Para organoides, vaya a 3.3.
    2. Para células monodispersas, prepare una nueva mezcla de monodispersión y solución de inactivación(Archivo Suplementario 2, Archivo Suplementario 3),además de los medios de digestión de la colagenasa libres de suero. Continúe con el paso 3.3.
  3. Cuando todo el tejido mamario de los donantes se haya extraído y picado, agregue la enzima colagenasa al medio de digestión caliente (o temperatura ambiente)(Archivo Suplementario 1). Mezclar invirtiendo.
  4. Pasar los medios de digestión de la colagenasa a través de un filtro de 20 m. Dispensar 10 ml de medios filtrados en los tubos etiquetados de 50 ml para la digestión.
  5. Utilice una nueva punta de pipeta de 1.000 ml para cada muestra y transfiera el tejido del donante picado de cada plato de 60 mm al tubo de digestión de la colagenasa. Corte 1 cm del extremo de una punta de 1.000 l y colóquela manualmente en el dispositivo antes de su uso. Mezcle suavemente el tejido picado pipeteando hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces.
    NOTA: Si el tejido es difícil de pipetear durante la transferencia, utilice una pequeña cantidad de los medios de digestión de la colagenasa del tubo de 50 ml y, a continuación, transfiera de nuevo.
  6. Colocar las muestras en posición horizontal en una incubadora de agitación y permitir que las muestras digeryen 1,5-2 h a 37 oC, 200-220 rpm.
    1. Para organoides, vaya a 3.7.
    2. Para las células monodispersas añadir DNase I (0,2 g/ml) a la mezcla durante los últimos 10 minutos de la digestión. Incubar como antes, con agitación vigorosa. Continúe con el paso 3.7.
  7. Cuando el tejido esté completamente digerido, pelete la suspensión utilizando centrifugación en frío (4 oC) durante 10 min a 1.200 x g (Figura 1D).
    NOTA: Mantenga los tubos en el hielo entre cada paso para aumentar la viabilidad de las células.
  8. Asegúrese de que se ha formado un pellet, y luego verter cuidadosamente la capa de sobrenadante y grasa. Resuspenda suavemente el pellet en 10 ml de medios dMEM/F12 frescos.
  9. Gire brevemente a 68 x g durante aproximadamente 10 s. La longitud del giro (pero no la velocidad) puede aumentarse si no hay una separación clara de las células. Inspeccione visualmente el pellet antes de continuar(Figura 1D).
  10. Retire con cuidado el sobrenadante, dejando atrás un pequeño volumen. Continúe con el siguiente paso, en función de si se necesitan organoides o células monodispersas.
    NOTA Es importante dejar un pequeño volumen de medios en el tubo porque el pellet estará muy suelto. El volumen residual de los medios se diluirá a través de pasos de lavado.
    1. Para organoides, añada otro volumen de 10 ml de medios DMEM/F12 y repita el lavado/espín. Después del segundo lavado, resuspenda las células en un volumen más pequeño (1-2 ml) de medios DMEM/F12 para la filtración. Continúe con el paso 3.11.
    2. Para células monodispersas, disolver en 2 ml de HBSS precalentado con 0.025% (p/v) Trypsin y 6.8 mM EDTA. Digerir durante 3-5 min a 37oC. Inactivar inmediatamente.
      1. Agregue 4 mL de DMEM/F12 con 10% FBS para detener la inactivación de la trippsina.
      2. Gire las células a 270 x g durante 5 min y, a continuación, resuspenda en DMEM/F12 con 10% FBS de nuevo. Continúe con el paso 3.11 para filtrar las celdas.
  11. Filtrar las células usando un colador de células de 40 m colocado en un nuevo tubo de 50 ml. Humedezca previamente el colador pipeteando 1 ml del mismo medio base utilizado para suspender las células, y luego pase la suspensión celular a través del filtro utilizando una pipeta para recoger fragmentos ducales/organoides.
    NOTA: El rendimiento aproximado del epitelio filtrado del tejido de la glándula mamaria de una sola rata donante de 4 semanas de edad es de 1 x 106 células.
    1. En el caso de los organoides, deseche el filtrado. Los organoides mamarios permanecerán dentro de la cesta del colador celular y se eliminarán las células más pequeñas y no deseadas. Invierta el colador de células sobre un nuevo tubo de 50 ml y enjuague con cualquier volumen necesario para recoger las células. Continúe con el paso 3.12.
    2. Para las células monodispersas, deseche el colador de células y mantenga el filtrado porque las células epiteliales mamarias pasarán a través del filtro, junto con células estromales e inmunitarias más pequeñas. Enjuague el tubo que se utilizó para la digestión/centrifugación con otro volumen de DMEM/F12 con 10% FBS y pase a través del mismo colador celular. Pellet las células monodispersas por centrifugación a 1.200 x g durante 5 min. Proceder al paso 3.12.
      NOTA: Las celdas resuspendidas están listas para aplicaciones posteriores.
  12. Pulse girar la solución y asegurar la formación de un pellet celular antes de proceder al siguiente paso. Pulse girar de nuevo, si es necesario.
  13. Retire con cuidado el sobrenadante. Resuspenda el pellet en un volumen pequeño (1.000-2.000 l de DMEM/F12) para concentrar las células para el recuento.
  14. Cuente las células y diluya si es necesario. Resuspender el número deseado de células para el trasplante en 20 l de medios DMEM/F12 para cada animal. Mantenga siempre las células en el hielo.
    NOTA: Se requerirán recuentos de células de donantes en el rango de 1 x 105 - 1 x 106 células para cada sitio de injerto basado en el punto final del estudio. Por ejemplo, los experimentos de carcinogénesis a menudo requieren un mayor número de células trasplantadas, en relación con otras aplicaciones. El número de células necesarias debe determinarse experimentalmente para cada cepa. El procedimiento descrito en este protocolo utilizó 250.000 células de donante en medios de 20 ml por sitio de injerto, antes de mezclarse con homogeneización cerebral, como se describe en el paso 3.16.
  15. Preparar cualquier alícuota(s) de células necesarias para otros experimentos (por ejemplo, aislamiento FACS3,26,27,30,33).
    1. Para organoides, proceda al paso 3.16.
    2. Para las células monodispersas, cuantifique las células viables usando Tinción azul trypan o metileno, y luego proceda.
  16. Preparar lotes individuales de material de donante para todos los receptores del trasplante. Combinar volúmenes iguales de la suspensión celular (20 l) con un 50% de homogeneización cerebral (20 l) para cada sitio de trasplante.
    NOTA: Se inyectará un total de 40 ml por sitio en cada sitio, pero se recomienda incluir un mínimo del 25% de volumen adicional para los residuos.
  17. Proceder inmediatamente al trasplante o congelar células para el trasplante más tarde (punto de parada potencial).
    NOTA: Las células congeladas no se han probado con este protocolo y requerirán optimización antes de generar una cohorte de animales para experimentos de trasplante. Se recomienda encarecidamente trasplantar células frescas.

4. Procedimiento de trasplante (ratas receptoras de 4-5 semanas de edad)

  1. Pesar cada rata receptora y calcular la dosis correcta de analgésico aprobado que se utilizará en el procedimiento.
    NOTA: Los pesos corporales se pueden medir hasta 24 horas antes del procedimiento. Siga las pautas institucionales para restringir o anestesiar brevemente a cada animal mientras dure el afeitado.
  2. Afime el área quirúrgica de cada animal con cortadoras eléctricas. Identifique la base del cráneo y el inicio de la columna vertebral. Aproximadamente un tercio del camino por la columna vertebral, afeitar un área de 3 cm x 2 cm en la parte torácica superior de la espalda.
    NOTA: El afeitado también se puede realizar bajo anestesia el día del trasplante, pero debe realizarse fuera del campo estéril. Devuelva a la rata a su jaula hasta que sea necesaria.
  3. Localice todos los suministros necesarios para el trasplante (Tabla 1).
  4. Evaluar el sistema de anestesia animal de laboratorio antes de su uso. Rematar los fluidos y reemplazar los tanques o piezas que se necesitan. Asegúrese de que la línea de gas a la cámara de anestesia esté abierta y todas las líneas periféricas estén cerradas, por lo que la anestesia isoflurano y el oxígeno pueden fluir libremente al animal una vez que se coloca en la cámara.
  5. Almohadillas de calentamiento calientes para apoyar la temperatura corporal de los animales receptores.
  6. Generar el campo estéril que se utilizará para la cirugía. Organice los suministros como se describe en la Tabla 1.
  7. Administrar analgésicos preoperatorios a ratas receptoras según lo indicado por el protocolo de cuidado animal aprobado institucionalmente.
  8. Enjuague las jeringas de Hamilton con medios estériles DMEM/F12 para evitar la pérdida de células. Asegúrese de que la aguja esté fijada al cuerpo de la jeringa, inserte la aguja en el líquido y extraiga el émbolo. Rellene al volumen máximo. Presione el émbolo hacia abajo y expulse el contenido en un tubo de recogida de residuos. Repita 3-5 veces.
  9. Cargue todo el volumen de material del donante (preparado en el paso 3.16) en una jeringa separada para cada condición (por ejemplo, control, tratamiento, wildtype, knockout, etc.). Inserte la punta de la aguja en el líquido, extraiga el émbolo y mantenga la aguja debajo de la superficie de la mezcla a medida que disminuye el volumen en el tubo.
    NOTA: Incluya al menos un 10% de volumen adicional en cada jeringa. No deseche la mezcla restante, cierre el tubo y manténgalo en hielo en caso de que se necesite más.
  10. Invierta la jeringa después de que esté completamente cargada y presione ligeramente el émbolo para eliminar las burbujas de aire en la punta de la aguja. Continúe con el siguiente paso cuando todo esté preparado.
    NOTA: Asegúrese de que la punta de la aguja nunca toque ninguna otra superficie, incluso dentro del campo estéril. Es útil descansar el cuerpo de la jeringa sobre un pequeño recipiente de hielo para promover la viabilidad de las células.
  11. Coloque el animal receptor en la cámara de anestesia y encienda la máquina.
  12. Cuando el animal esté completamente relajado (no reacciona al golpeteo o movimiento suave de la cámara), dirija la anestesia al cono nasal y transfiera al animal al campo estéril.
    NOTA: La duración prolongada de la anestesia no es bien tolerada por las ratas. Complete el procedimiento para cada animal en 10 minutos o menos.
  13. Coloque al animal en una posición propensa (en su estómago) para que la parte posterior de la cabeza y la columna vertebral superior sea accesible.
    NOTA: Asegurar un soporte térmico adecuado para el animal todo el tiempo y evaluar regularmente la profundidad de la anestesia usando un pellizco firme en el dedo del pecho.
  14. Opcionalmente, aplicar pomada de veta oftálmica para evitar el secado de los ojos.
  15. Limpie el área recién arasada para eliminar el exceso de cabello. Utilice un movimiento circular y aplique 70% de etanol (u otro reactivo, según las pautas institucionales) a la piel, seguido de un antiséptico (como yodo), y repita. Coloque una cortina de toalla sobre el animal para que solo se exponga la región de la zona atada.
  16. Asegúrese de que el animal no responde a los estímulos profundos con un pellizco firme en el dedo del pecho, y luego proceda al siguiente paso.
  17. Haga una pequeña incisión interescapular (2 cm) usando una cuchilla quirúrgica afilada.
    NOTA: El corte debe ser superficial, ya que la almohadilla de grasa se encuentra justo debajo de la piel.
  18. Localice el vaso sanguíneo medial para la orientación(Figura 2B).
  19. Levante la piel de un lado de la incisión con fórceps y sosténgala lejos de la almohadilla de grasa mientras se realiza el trasplante(Figura 2B). Inserte la aguja en el lugar del injerto.
    1. Opcionalmente, mueva la punta de la aguja dentro del tejido y cree un pequeño bolsillo para recoger las células. Utilice un movimiento pequeño y repetitivo. No retire la aguja.
      NOTA: Este paso se recomienda para los usuarios primerizos del protocolo. Tenga mucho cuidado al crear un bolsillo, ya que el tejido de la almohadilla de grasa interescapular es muy delicado.
  20. Inyecte cuidadosamente 40 l de la mezcla celular en el tejido de la almohadilla de grasa interescapular. Retire la aguja lentamente.
  21. Sostenga el tejido en su lugar y permita que las células trasplantadas se asienten durante 3-5 s. Use un par adicional de fórceps, si es necesario.
  22. Retire la aguja. Repita el procedimiento de inyección (pasos 4.18-4.21) en el segundo lugar del trasplante.
    NOTA: El epitelio de un grupo de donantes se puede inyectar en el mismo lado de la almohadilla de grasa en cada animal, o alternando lados para evitar efectos por lotes del dominio manual del cirujano.
  23. Cierre la herida quirúrgica con clips de heridas o suturas y, a continuación, interrumpa la anestesia.
  24. Proporcionar analgésico postoperatorio como se indica en el protocolo aprobado institucionalmente.
  25. Mueva inmediatamente al animal a una jaula de recuperación con el soporte térmico. Monitoree los signos de angustia, como sangrado de la incisión o dificultad para respirar.
    NOTA: El animal debe recuperarse completamente en un plazo de 5-10 minutos Consulte las pautas institucionales para el regreso de los animales a la colonia y la vigilancia postoperatoria después de los procedimientos de supervivencia.
  26. Opcionalmente, realice estudios de carcinogénesis en el(los) lugar(s) del injerto administrando carcinógenos a las ratas receptoras 3-4 semanas después del trasplante.
    NOTA: Por lo general, la carcinogénesis mamaria de ratas se realiza utilizando un tratamiento con carcinógeno químico a los 50-57 días de edad. Este tratamiento dicta la edad de la cirugía de trasplante (que debe hacerse entre 29-36 días de edad) para dar tiempo suficiente para que las células injertadas inicien el crecimiento de la glándula mamaria.

5. Evaluación del crecimiento epitelial

  1. Supervise el ciclo de estrus de las ratas a través del lavado vaginal diario y examine la citología en una diapositiva del microscopio. Comience 8-12 días antes del punto final del estudio. Sacrificar a todas las ratas en la misma etapa. Este es un paso opcional.
    NOTA: El ciclo de estrus de rata es de 4-5 días. Permitir que el animal pase por 1-2 ciclos completos facilitará la interpretación, ya que los portaobjetos de lavado de ciclos anteriores se pueden utilizar para la comparación.
  2. Sacrificar las ratas receptoras de trasplante de 6 a 8 semanas después del trasplante, según las pautas institucionales.
    NOTA: El crecimiento es generalmente detectable 3-6 semanas después del trasplante, pero puede ser necesario tiempo adicional.
  3. Coloque al animal en una posición propensa y limpie el cuerpo con 70% de etanol. Levante la piel con fórceps y haga una incisión a lo largo de la columna vertebral para exponer la almohadilla de grasa interescapular. Diseccionar la piel lejos del tejido para que la mayor parte de la almohadilla de grasa sea visible.
  4. Identifique el vaso sanguíneo medial que separa los sitios del injerto en la almohadilla de grasa interescapular. Exboce toda la almohadilla como una sola pieza de tejido o corte a lo largo del vaso sanguíneo y retire los lados individualmente.
  5. Coloque el tejido en una corredera de microscopio cargada positivamente para todo el montaje. Utilice 2 pares de fórceps contundentes y extienda suavemente el tejido para restaurar su conformación original en la diapositiva.
    NOTA: El tejido mamario de rata es extremadamente delicado. Los bordes del tejido pueden enroscarse debajo de sí mismo. Siempre manipule con cuidado y sostenga en su lugar hasta que el tejido se adhiera a la diapositiva (unos segundos).
  6. Montaje completo al menos una de las glándulas mamarias abdominales-inguinales endógenas (con ganglios linfáticos para la orientación) para la comparación.
  7. Coloque los portaobjetos en 70% etanol durante 7-10 días para desgrasar el tejido. Reponga el etanol tantas veces como sea necesario para asegurarse de que el tejido no se seque.
  8. Preparar la mancha de alumna-carmina y procesar las diapositivas cuando el tejido esté lo suficientemente opaco. Deje que la mancha se enfríe antes de su uso(Archivo Suplementario 4).
    NOTA: La mancha se puede preparar hasta un día antes de los pasos de fijación y rehidratación. La solución se puede almacenar a 4 oC y tiene un potencial limitado de reutilización.
  9. Fijar el tejido colocando los portaobjetos en 25% ácido acético glacial : 75% etanol durante 60 min.
    1. Rehidratar el tejido a través de una serie de 3 lavados en una serie de disminución de la concentración de etanol: 70% etanol para 15 min, 50% etanol durante 5 min y dH2O durante 5 min.
  10. Mancha con carmín de alumbre durante 4-8 días. Revise la parte posterior de las diapositivas cada día para determinar si la mancha ha penetrado completamente el tejido. Continúe con el siguiente paso cuando se complete la tinción.
    NOTA: La tinción se completa cuando las partes más gruesas de la glándula tienen un tono púrpura y ya no aparecen blancas.
  11. Destaína y deshidratar el tejido mediante la transferencia de los portaobjetos a través de una serie de creciente concentración de etanol: 70% etanol para 30 min, 95% etanol para 30 min y 100% etanol para 30 min.
  12. Colocar los portaobjetos deshidratados en xileno durante más de 3 días para limpiar el tejido. Transferencia a aceite mineral para almacenamiento a largo plazo.
  13. Después de que las diapositivas se hayan despejado, utilice microscopía de luz de baja potencia o fotografía digital de alta resolución para adquirir imágenes de las diapositivas para su análisis. Asegúrese de que los parámetros de adquisición de imágenes sean coherentes para todas las diapositivas.
    NOTA: El crecimiento epitelial debe ser claramente distinguible.
  14. Tratar la presencia de crecimiento como un resultado binario.
  15. Calcular el número medio de células epiteliales trasplantadas que produjeron un crecimiento mamario de 1 en el 50% de los sitios de injerto utilizando las imágenes adquiridas. Cuantificación de otras características físicas, según sea necesario.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Glándulas mamarias de donantes y receptores
Los pasos para aislar y preparar las células epiteliales mamarias de ratas para el trasplante se muestran en la Figura 1A. A las 4 semanas de edad, la glándula mamaria endógena de la rata donante ha comenzado la maduración y el epitelio se puede visualizar en diapositivas montadas enteras teñidas con carmín de alumbre(Figura 1

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este protocolo describe una técnica de trasplante de células epiteliales mamarias optimizada para trabajar con ratas. Los organoides epiteliales mamarios aislados de ratas donantes (3-5 semanas de edad) se injertan en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas receptoras (también de 3 a 5 semanas de edad). Los resultados pueden ser interpretados tan poco como 4-6 semanas más tarde, utilizando microscopía de luz para examinar el tejido injertado; sin embargo, la cantidad óptima de tiempo entre el trasplante y ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Centro Oncológico de Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 fondos piloto de investigación de los Institutos Nacionales de Salud(https://www.nih.gov/),y fondos del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad Médica de Carolina del Sur. Nos gustaría dar las gracias a Marijne Smiths por grabar las declaraciones de la entrevista.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,2 y micro; M filtros de jeringaFisher Scientific09-715Gmedios de digestión de colagenasa filtrantes estériles
1,5 - 2,0 mL tubos de microcentrífuga (estériles)Fisher Scientific05-408-129que contiene células resuspendidas y/o mezcla de homogeneizado cerebral
100 µ Filtros de células MCorning431752 homogeneizado cerebral filtrante
Jeringas herméticas al gas de 100 uL con agujas de calibre 25Hamilton81001 y 90525Para inyectar mezcla de injerto en animales receptores (1 por genotipo/condición del donante)
Puntas de pipeta de 1000 uL + pipeta--transferencia decélulas/mezclas/tejidos
Tubo de polipropileno de 15 mLFalcon (Corning)352196Mezcla de homogeneizado cerebral almacenamiento, o célula : mezcla homogeneizada para trasplante
40 y micro; Filtros de células MCorning431750organoides filtrantes después de lavar la célula Pellet
50 mL tubos de polipropilenoFisher Scientific05-539-6para la digestión de colagenasa del tejido de la glándula mamaria del donante Placas de
60 mmThermo Scientific130181para picar tejido
Sulfato de potasio de alumbreSigma-Aldrich243361/237086tinción de la glándula mamaria montaje entero portaobjetos
Vaporizador de anestesia para uso veterinario-siga el protocolo institucional
Beta-dine o yodo-
Tubo de cultivo de vidrio de borosilicato para homogeneizaciónFisher Scientific14-961-26para la homogeneización del cerebro (use el tubo apropiado para el homogeneizador)
CarmineSigma-AldrichC6152/1022tinción de la glándula mamaria Portaobjetos de montaje completo
Aparato de conteo de células--
Jaulas de animales limpias para la recuperación--siga el protocolo institucional
Colagenasa Tipo 3Worthington Biochemical Corp.LS004183digestión enzimática de tejido de glándula mamaria picado de ratas donantes
Agua desionizada:para soluciones químicas
DMEM/F12GIBCO11320033para picar tejidos, medios de digestión de colagenasa y mezclas de células epiteliales resuspendidas
EDTA:mezcla de monodispersión
Etanol, 200 ProofDecon Labs2705/2701fijador de portaobjetos de montaje completo mamario, lavados de portaobjetos de montaje completo mamario, limpieza de sitios de incisión quirúrgica (diluidos)
Suero fetal bovino (FBS)deinactivaciónhipclones
Gasa--
Ácido acético glacialFisher ScientificA38-212uso para fijador de portaobjetos de montaje completo mamario (ácido acético glacial 1:4 en etanol al 100%)
HBSSGIBCO-Mezcla de monodispersión
Almohadillas térmicas--seguir el protocolo institucional
Cubetas de hielo (x2)--
Incubadora con rotación orbital--debe ser capaz de mantener 37° C, agitación a 220-225 RPM (para la digestión de la colagenasa del tejido mamario)
Anestesia con isoflurano:siga el protocolo institucional
Microscopio óptico o cámara digital:visualización del epitelio mamario montado completo y/o adquisición de imágenes
Homogeneizador mecánicoFisherScientific-TissueMiser o modelos alternativos
Aceite mineral, puroSigma-Aldrich/ ACROS Organics8042-47-5Almacenamiento a largo plazo de monturas enteras de glándulas mamarias aclaradas
Tanques de oxígeno para vaporizador de anestesia:siga el protocolo institucional
Toallas de papel o toallitas húmedas delicadas para tareas
portaobjetos de microscopio con carga positivaThermo ScientificP4981-001Tejido de glándula mamaria Montajes enteros
Postoperatorio analgésico--Protocolo institucional
Báscula Medicionesdel peso corporal de los animales, dosificación adecuada de analgésicos
Afeitadora--maquinillas eléctricas, u otros
Frascos de tinción--de 1 por lavado químico, tamaño apropiado para el número de portaobjetos, vidrio preferido
Paños de campo estérilesIMCO4410-IMCutilizado durante el trasplante
Tijeras y pinzas estériles x3 (esterilizadas en autoclave):herramientas quirúrgicas en autoclave utilizadas para donantes y receptores
Jeringas: 5 ml (o más)para la filtración estéril de medios de digestión de colagenasa Mezcla de
monodispersióntripsinaWorthington
Receptáculo de recolección de desechos para líquidos (vertidos o aspirados)- -
pinzas para heridas, pinzas y herramienta de extracciónFine Science Tools12020-00Cierre de la incisión cutánea sobre la almohadilla de almohadilla blanca interescapular
XilenosFisher ScientificX3S-4 Limpieza deglándula mamaria Correderas de montaje completo después de la tinción
Solución de delicadas: mínimo deAplicador de la

Referencias

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343(1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173(1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7(2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634(1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002(2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Gl ndula mamaria de rataaislamiento de tejido mamariodigesti n con colagenasafiltraci n con colador de c lulasmezcla con homogenizado de cerebroinyecci n de injerto quir rgicotinci n de montaje completodesarrollo de la gl ndula mamaria
Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.