Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.
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Artículo de método
Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular
En este artículo
Resumen
Resumen
Ya en la década de 1970, los investigadores han trasplantado con éxito las células epiteliales mamarias a la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas. El injerto de epitelio mamario mediante técnicas de trasplante aprovecha el entorno hormonal proporcionado por el huésped adolescente. Estos estudios son ideales para explorar el impacto de varias manipulaciones biológicas en el desarrollo de la glándula mamaria y diseccionar muchos aspectos de la biología de la glándula mamaria. Una característica común, pero limitante, es que las células epiteliales trasplantadas están fuertemente influenciadas por el estroma circundante y son sube a la competencia por epitelio endógeno; para utilizar tejido mamario nativo, la almohadilla de grasa blanca abdominal-inguinal debe eliminarse para eliminar el epitelio mamario huésped antes del trasplante. Un obstáculo importante cuando se utiliza el organismo modelo de rata es que limpiar el árbol mamario en desarrollo en ratas post-dedianas no es eficiente. Cuando se trasplantan en almohadillas de grasa libres de glándulas, las células epiteliales del donante pueden repoblar la almohadilla de grasa del huésped limpiada y formar una glándula mamaria funcional. La almohadilla de grasa interescapular es un lugar alternativo para estos injertos. Una ventaja importante es que carece de estructuras ductales, pero proporciona el estroma normal que es necesario para promover el crecimiento epitelial y es fácilmente accesible en la rata. Otra ventaja importante de esta técnica es que es mínimamente invasiva, ya que elimina la necesidad de cauterizar y eliminar el creciente árbol mamario endógeno. Además, la almohadilla de grasa interescapular contiene un vaso sanguíneo medial que se puede utilizar para separar sitios para el injerto. Debido a que las glándulas endógenas permanecen intactas, esta técnica también se puede utilizar para estudios que comparan la glándula mamaria endógena con la glándula trasplantada. Este artículo describe el método de trasplante de células epiteliales mamarias en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas.
Introducción
El desarrollo de la glándula mamaria postnatal y la morfogénesis ductal son procesos influenciados en gran medida por la señalización hormonal al inicio de la pubertad. En ratones y ratas, comúnmente utilizados organismos modelo de la biología de la glándula mamaria, este proceso comienza alrededor de 3 semanas de edad, donde la rápida proliferación y diferenciación resultan en la formación del parénquima maduro. La glándula mamaria madura puede sufrir numerosas rondas de expansión e involución, una propiedad que ha estado siendo investigada desde principios delsiglo XX. En el contexto de la hiperproliferación y el desarrollo del cáncer, las técnicas de tra....
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Protocolo
Todos los animales fueron alojados y mantenidos en una instalación aprobada por la AAALAC, y los experimentos descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) MUSC. Los animales para su uso en trasplantes recíprocos deben ser una cepa endogámica o isogénica, con estado congénico preferido o cruzado durante al menos 6 generaciones.
1. Cosecha de epitelio de la glándula mamaria de la rata donante
- Determinar el número de ratas donantes necesarias para el trasplante.
NOTA: Generalmente, 1 rata donante (4 semanas de edad) puede proporcionar suficientes células par....
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Resultados
Glándulas mamarias de donantes y receptores
Los pasos para aislar y preparar las células epiteliales mamarias de ratas para el trasplante se muestran en la Figura 1A. A las 4 semanas de edad, la glándula mamaria endógena de la rata donante ha comenzado la maduración y el epitelio se puede visualizar en diapositivas montadas enteras teñidas con carmín de alumbre(Figura 1
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Discusión
Este protocolo describe una técnica de trasplante de células epiteliales mamarias optimizada para trabajar con ratas. Los organoides epiteliales mamarios aislados de ratas donantes (3-5 semanas de edad) se injertan en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas receptoras (también de 3 a 5 semanas de edad). Los resultados pueden ser interpretados tan poco como 4-6 semanas más tarde, utilizando microscopía de luz para examinar el tejido injertado; sin embargo, la cantidad óptima de tiempo entre el trasplante y .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Centro Oncológico de Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 fondos piloto de investigación de los Institutos Nacionales de Salud(https://www.nih.gov/),y fondos del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad Médica de Carolina del Sur. Nos gustaría dar las gracias a Marijne Smiths por grabar las declaraciones de la entrevista.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,2 y micro; M filtros de jeringa | Fisher Scientific | 09-715G | medios de digestión de colagenasa filtrantes estériles |
| 1,5 - 2,0 mL tubos de microcentrífuga (estériles) | Fisher Scientific | 05-408-129 | que contiene células resuspendidas y/o mezcla de homogeneizado cerebral |
| 100 µ Filtros de células M | Corning | 431752 homogeneizado cerebral filtrante | |
| Jeringas herméticas al gas de 100 uL con agujas de calibre 25 | Hamilton | 81001 y 90525 | Para inyectar mezcla de injerto en animales receptores (1 por genotipo/condición del donante) |
| Puntas de pipeta de 1000 uL + pipeta | - | -transferencia de | células/mezclas/tejidos |
| Tubo de polipropileno de 15 mL | Falcon (Corning) | 352196 | Mezcla de homogeneizado cerebral almacenamiento, o célula : mezcla homogeneizada para trasplante |
| 40 y micro; Filtros de células M | Corning | 431750 | organoides filtrantes después de lavar la célula Pellet |
| 50 mL tubos de polipropileno | Fisher Scientific | 05-539-6 | para la digestión de colagenasa del tejido de la glándula mamaria del donante Placas de |
| 60 mm | Thermo Scientific | 130181 | para picar tejido |
| Sulfato de potasio de alumbre | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | tinción de la glándula mamaria montaje entero portaobjetos |
| Vaporizador de anestesia para uso veterinario | - | siga el protocolo institucional | |
| Beta-dine o yodo | - | ||
| Tubo de cultivo de vidrio de borosilicato para homogeneización | Fisher Scientific | 14-961-26 | para la homogeneización del cerebro (use el tubo apropiado para el homogeneizador) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | tinción de la glándula mamaria Portaobjetos de montaje completo |
| Aparato de conteo de células | - | - | |
| Jaulas de animales limpias para la recuperación | - | - | siga el protocolo institucional |
| Colagenasa Tipo 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | digestión enzimática de tejido de glándula mamaria picado de ratas donantes |
| Agua desionizada | : | para soluciones químicas | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | para picar tejidos, medios de digestión de colagenasa y mezclas de células epiteliales resuspendidas |
| EDTA: | mezcla de monodispersión | ||
| Etanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | fijador de portaobjetos de montaje completo mamario, lavados de portaobjetos de montaje completo mamario, limpieza de sitios de incisión quirúrgica (diluidos) |
| Suero fetal bovino (FBS) | de | inactivación | hipclones |
| Gasa | - | - | |
| Ácido acético glacial | Fisher Scientific | A38-212 | uso para fijador de portaobjetos de montaje completo mamario (ácido acético glacial 1:4 en etanol al 100%) |
| HBSS | GIBCO | - | Mezcla de monodispersión |
| Almohadillas térmicas | - | - | seguir el protocolo institucional |
| Cubetas de hielo (x2) | - | - | |
| Incubadora con rotación orbital | - | - | debe ser capaz de mantener 37° C, agitación a 220-225 RPM (para la digestión de la colagenasa del tejido mamario) |
| Anestesia con isoflurano | : | siga el protocolo institucional | |
| Microscopio óptico o cámara digital | : | visualización del epitelio mamario montado completo y/o adquisición de imágenes | |
| Homogeneizador mecánico | Fisher | Scientific-TissueMiser o modelos alternativos | |
| Aceite mineral, puro | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | Almacenamiento a largo plazo de monturas enteras de glándulas mamarias aclaradas |
| Tanques de oxígeno para vaporizador de anestesia | : | siga el protocolo institucional | |
| Toallas de papel o toallitas húmedas delicadas para tareas | |||
| portaobjetos de microscopio con carga positiva | Thermo Scientific | P4981-001 | Tejido de glándula mamaria Montajes enteros |
| Postoperatorio analgésico | - | - | Protocolo institucional |
| Báscula Mediciones | del peso corporal de los animales, dosificación adecuada de analgésicos | ||
| Afeitadora | - | - | maquinillas eléctricas, u otros |
| Frascos de tinción | - | - | de 1 por lavado químico, tamaño apropiado para el número de portaobjetos, vidrio preferido |
| Paños de campo estériles | IMCO | 4410-IMC | utilizado durante el trasplante |
| Tijeras y pinzas estériles x3 (esterilizadas en autoclave): | herramientas quirúrgicas en autoclave utilizadas para donantes y receptores | ||
| Jeringas: 5 ml (o más) | para la filtración estéril de medios de digestión de colagenasa Mezcla de | ||
| monodispersión | tripsina | Worthington | |
| Receptáculo de recolección de desechos para líquidos (vertidos o aspirados) | - | - | |
| pinzas para heridas, pinzas y herramienta de extracción | Fine Science Tools | 12020-00 | Cierre de la incisión cutánea sobre la almohadilla de almohadilla blanca interescapular |
| Xilenos | Fisher Scientific | X3S-4 Limpieza de | glándula mamaria Correderas de montaje completo después de la tinción |
Referencias
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H.
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Reimpresiones y permisos
