Artículo de método

Medición de las tasas de mutación microbiana con el ensayo de fluctuación

DOI:

10.3791/60406

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28 de noviembre de 2019

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1School of Biological Sciences, The University of Manchester, 2School of Science, University of Waikato, 3School of Natural Sciences, The University of Manchester, 4Department of Mathematics, Université du Québec à Montréal

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, se presenta un protocolo para realizar un ensayo de fluctuación y estimar la tasa de mutación microbiana utilizando marcadores fenotípicos. Este protocolo permitirá a los investigadores analizar mutaciones en diversos microbios y entornos, determinando cómo el genotipo y el contexto ecológico afectan a las tasas de mutación espontánea.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los ensayos de fluctuación se utilizan ampliamente para estimar las tasas de mutación en microbios que crecen en entornos líquidos. Muchos cultivos se inoculan con unos pocos miles de células, cada una sensible a un marcador selectivo que se puede analizar fenotípicamente. Estos cultivos paralelos crecen durante muchas generaciones en ausencia del marcador fenotípico. Un subconjunto de cultivos se utiliza para estimar el número total de células en riesgo de mutaciones (es decir, el tamaño de la población al final del período de crecimiento, o Nt). Los cultivos restantes están chapados en el agar selectivo. La distribución de mutantes resistentes observados entre cultivos paralelos se utiliza para estimar el número esperado de eventos mutacionales, m, utilizando un modelo matemático. La división m por Nt da la estimación de la tasa de mutación por locus por generación. El ensayo tiene tres aspectos críticos: el marcador fenotípico elegido, el volumen elegido de cultivos paralelos, y asegurar que la superficie en el agar selectivo esté completamente seca antes de la incubación. El ensayo es relativamente barato y sólo necesita equipos de laboratorio estándar. También es menos laborioso que los enfoques alternativos, como la acumulación de mutaciones y los ensayos de una sola célula. El ensayo trabaja en organismos que pasan por muchas generaciones rápidamente y depende de suposiciones sobre los efectos de la aptitud de los marcadores y la muerte celular. Sin embargo, las herramientas y los estudios teóricos desarrollados recientemente significan que estas cuestiones ahora pueden abordarse analíticamente. El ensayo permite la estimación de la tasa de mutación de diferentes marcadores fenotípicos en células con diferentes genotipos que crecen de forma aislada o en una comunidad. Mediante la realización de múltiples ensayos en paralelo, los ensayos se pueden utilizar para estudiar cómo el contexto ambiental de un organismo afecta la tasa de mutación espontánea, que es crucial para entender la resistencia a los antimicrobianos, la carcinogénesis, el envejecimiento y la evolución.

Introducción

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En 1901 el botánico holandés Hugo de Vries acuñó el término mutación1. Veintiséis años más tarde, cuando Hermann Joseph Muller descubrió la acción mutagénica de los rayos X2,las mutaciones ya eran percibidas como una de las fuerzas motrices de la evolución. Sin embargo, la naturaleza de las mutaciones no estaba clara. Para responder a la pregunta fundamental de si las mutaciones surgen espontáneamente (es decir, una mutación espontánea) o en respuesta a la selección (es decir, una mutación inducida), se necesitaba un método para observar eventos mutacionales. Tal método mediría el número esperado de mutaciones por división celular o lo que ya se conocía como tasa de mutación3,4.

Flujo de trabajo de estimación de la tasa de mutación; inoculación, incubación, siembra celular, diagrama de análisis de datos.
Figura 1: Ilustración esquemática de cómo realizar el ensayo de fluctuación con una cepa microbiana en una placa de pozo de 96 profundidades. (A) Inocular y aclimatar células en tubos de 50 ml que contengan cinco ambientes diferentes (ensayos de «rojo», «azul», «verde», "púrpura" y «naranja»). (B) Preparar cultivos paralelos con un pequeño número de células sensibles en una placa de pozo de 96 profundidades. El ensayo 'rojo' tiene 20 culturas paralelas, mientras que los ensayos 'azul', 'verde', 'púrpura' y 'naranja' tienen 19 referencias culturales paralelas. Las posiciones de los cultivos paralelos en la placa de pozo profundo 96 son aleatorias. La aleatorización se puede hacer con el script LayoutGenerator.R suplementario o con alguna otra herramienta. El diseño en la parte superior derecha es el resultado de la aleatorización. (C) Incubar la placa de pozo de 96 profundidades y permitir que las células se dividan y muten espontáneamente. Seis culturas de pozos profundos A1, B1, C1, E1, F1 y G1 muestran cómo el número de mutantes fluctúa: 4, 0, 2, 2, 1 y 4 glóbulos rojos después de la división de la tercera célula, respectivamente. El número de mutantes difiere no sólo por el diferente número de mutaciones espontáneas (0, 1 o 2 como se muestra en la primera célula roja), sino también porque es importante cuando durante un ciclo de cultivo surge espontáneamente una mutación de resistencia (división celular 1, 2 o 3). (D) Después de la incubación de la placa de pozo sin profundidad 96 el número de mutantes se determina mediante el chapado de 81 culturas paralelas. En el diseño se trata de círculos sin bordes en negrita. Todo el cultivo paralelo está chapado en un pozo de una placa de 6 pocillos que contiene un agar selectivo. (E) Los 15 cultivos restantes se diluyen y se chapan en el agar no selectivo para determinar el número medio de células (Nt). En el diseño se etiquetan como Ntwells y tienen bordes en negrita. Para cada ensayo Nt se promedia en tres referencias culturales paralelas. En la parte inferior derecha hay un plato Petri que contiene una placa de agar no selectiva con 25 UFC de un cultivo diluido cultivado en un pozo profundo D1 (parte de un ensayo 'verde'). (F) Después de la incubación de las 6 placas de pozo selectivos se contó el número de mutantes observados y se estimó el número esperado de eventos mutacionales, m, utilizando un estimador de máxima probabilidad. (G) Conocer tanto el número de mutaciones, m, como el número de células por ensayo, Nt, la tasa de mutación se estimó como m/Nt. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En 1943, Salvador Luria y Max Delbrick proporcionaron una solución ingeniosa a este problema con el ensayo de fluctuación5 (véase la figura 1). El ensayo comienza con varias poblaciones (denominadas referencias culturales paralelas) que se inician con un pequeño número de células microbianas(Figura 1A,B). Después del crecimiento en un entorno benigno y no selectivo(Figura 1C),los cultivos paralelos se transfieren en placas que contienen un marcador selectivo (fagos, antibióticos, etc.), donde sólo sobreviven las células con una mutación de resistencia y pueden producir una colonia(Figura 1D). La principal expectativa era que si se inducen mutaciones de resistencia, el número de células que llevan una mutación debe distribuirse entre diferentes poblaciones con la media igual a la varianza. Lo que Luria y Delbrick encontraron con el ensayo de fluctuación es que el número de mutantes fluctuó drásticamente y que la varianza en el número de mutantes entre diferentes poblaciones fue considerablemente mayor que la media. De este medio tiempo, Luria y Delbrick demostraron que las mutaciones son espontáneas. Mostraron que las mutaciones surgen espontáneamente cada vez que se replica el ADN, y el número de mutantes depende de cuándo se produce la mutación durante el crecimiento de la población. Véase la Figura 1C, donde seis poblaciones, cada una iniciada con una célula microbiana (en azul), no experimentan ninguna, 1 o 2 mutaciones individuales. Las poblaciones A1, E1 y F1 experimentaron una sola mutación (primera célula roja), pero debido a que una sola mutación emerge espontáneamente en varios momentos durante un ciclo de cultivo, las poblaciones terminaron con un número muy diferente de mutantes observados (cuatro, dos y uno, respectivamente). Por otro lado, las poblaciones C1 y G1 terminaron con el mismo número de mutantes observados que E1 y A1, a pesar de experimentar dos eventos mutacionales en lugar de uno. La fluctuación de los mutantes observados entre las poblaciones no sólo dio el nombre al ensayo, sino que también mostró que una frecuencia mutante (es decir, la proporción de células mutantes) es un indicador inadecuado de la tasa de mutación.

El objetivo general del ensayo de fluctuación es estimar la tasa de mutación espontánea de un genotipo particular de bacterias u otro organismo unicelular que crece en un entorno líquido particular. El ensayo de fluctuación sigue siendo la herramienta más adecuada para estudiar la dependencia ambiental de las tasas de mutación microbiana y permite una estimación rápida y económica de la tasa de mutación. Los enfoques alternativos para la estimación de la tasa de mutación, como la secuenciación de profundidad máxima6,la secuenciación de la población7,los experimentos de acumulación de mutaciones8o la comparación de secuencias genómicas de una descendencia con las de los padres9 son mucho más laboriosos y, por lo tanto, poco adecuados para detectar potencialmente dependencias ambientales. Sin embargo, los aspectos dinámicos de la generación y reparación de una mutación son en gran medida inaccesibles para un ensayo de fluctuación o para cualquiera de los métodos de decir una tasa de mutación enumerada anteriormente. Para estudiar cómo cambia el número de mutaciones en el tiempo, el espacio o entre células individuales dentro de una población, se acerca la célula única11,12, que, además de ser más laboriosas que los ensayos de fluctuación, requieren habilidades y equipos altamente especializados.

En la práctica, un ensayo de fluctuación está contando células ganando un marcador fenotípico debido a una mutación que ocurre en un entorno que carece de selección para ese marcador. El metanálisis de cientos de ensayos publicados10 muestra que al menos 39 marcadores fenotípicos diferentes se han utilizado desde el inicio del ensayo en 1943. El ensayo de fluctuación se puede utilizar para comparar los promedios y la dependencia ambiental de las tasas de mutación entre cepas de laboratorio, clínicas, no mutantes y mutantes que crecen en entornos permisivos. El ensayo permite la estimación de la tasa de mutación en células con diferentes orígenes genéticos que crecen en ambientes mínimos o ricos. El ensayo es adecuado no sólo para las poblaciones que crecen como monocultivo, sino que también se puede utilizar para estudiar los efectos de las interacciones células celulares en las tasas de mutación11. Cuando la cepa de interés se cocultiva con una segunda cepa, y se utiliza un marcador neutro para distinguir las cepas, se pueden analizar las tasas de mutación para dos cepas en el mismo tubo al mismo tiempo.

Los ensayos de fluctuación han revelado que la tasa de mutación espontánea depende tanto del genotipo de una célula como de su entorno12 y es un rasgo que a su vez evoluciona13. Siempre que la tasa de mutación de un genotipo en particular cambie con el medio ambiente, se describe como plasticidad de tasa de mutación11. Las tasas de mutación plástica se han abordado más a fondo para la mutagénesis inducida por el estrés (SIM)14. Además, utilizando ensayos de fluctuación, recientemente se ha demostrado que la densidad a la que crece una población de células (normalmente un cultivo por lotes a capacidad de transporte) está estrechamente asociada con las tasas de mutación entre bacterias y eucariotas unicelulares. La tasa de mutación por genoma por generación disminuye en poblaciones densas hasta en 23 veces10,11. Esta plasticidad de la tasa de mutación asociada a la densidad (DAMP) puede depender de un sistema de exploración de quórum15 y actuar independientemente de SIM16.

Aquí, se presenta un protocolo detallado para el ensayo de fluctuación utilizado para estudiar la cepa de Escherichia coli K-12 ganando resistencia al antibiótico rifampicina en un entorno de medios mínimos de glucosa. Sin embargo, este protocolo debe ser visto como una plantilla básica que se puede utilizar para estudiar una amplia variedad de microbios simplemente modificando las condiciones de cultivo y los marcadores fenotípicos de mutación. El protocolo ha evolucionado desde sus inicios5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 a través de su uso en una amplia gama de microbios e incluso células cancerosas30 y ha sido modificado para aumentar el rendimiento, que era esencial para probar adecuadamente las dependencias ambientales de las tasas de mutación microbiana10,11,16. El protocolo descrito aquí no abarca todas las cuestiones metodológicas y analíticas del ensayo de fluctuación que ya han sido bien discutidos en la literatura, particularmente los efectos de aptitud de las mutaciones resistentes31,retraso fenotípico32,muerte celular33,y la idoneidad de varios algoritmos disponibles para estimar las tasas de mutación26,34. Esto puede ser importante, por ejemplo, cuando la dependencia ambiental de los efectos de la aptitud puede dar lugar a una variación errónea en las estimaciones de la tasa de mutación35. Sin embargo, observamos que las herramientas analíticas que utilizamos aquí pueden tratar con la variación en la aptitud mutante y la muerte celular. Como se aborda en las notas y la discusión, también se recomienda que se consideren múltiples marcadores fenotípicos que es poco probable que tengan los mismos efectos de aptitud dependientes del medio ambiente. Este protocolo permitirá a las personas ensayo rutinariamente las dependencias ambientales de las tasas de mutación en la diversidad de cepas y entornos microbianos. El ensayo de mutaciones en diferentes ambientes aún no se ha probado a fondo y una vez que se considera la densidad de población, los ensayos de fluctuación pueden dar una estimación más precisa de la tasa de mutación10. Este protocolo permitirá realizar más ensayos de fluctuación, como es necesario para comprender los mecanismos que sustentan las tasas de mutación, que a su vez es vital para comprender la evolución, la carcinogénesis, el envejecimiento y la resistencia a los antimicrobianos.

Protocolo

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1. Día 1: Inoculación y Aclimatación de Culturas

  1. Inocular 3 ml de caldo de lisógenia líquida (LB, ver Tabla Suplementaria 1) con un trozo de hielo de la caldo de glicerol E. coli MG1655 (18% glicerol, -80 oC). Agitar el cultivo de LB a 120 rpm durante 7 h a 37 oC.
    NOTA: En este experimento, e. coli K12 MG1655 que crece en LB se utiliza, pero este ensayo se puede realizar con cualquier cepa de E. coli o cualquier otra especie microbiana cultivable. La temperatura de incubación, los tiempos de incubación y el nivel de nutrientes de los medios de crecimiento pueden estar sujetos a variaciones por especie o cepa.
  2. Diluir el cultivo 2.000 veces utilizando la solución salina. Añadir 100 ml de la solución diluida a tres tubos de polímero inferior cónico de tapa de tornillo de 50 ml (tubos de 50 ml) con 10 ml de medio mínimo de Davis líquido (DM, véase la Tabla Suplementaria 1), que contiene respectivamente 80 mg/L, 125 mg/L o 250 mg/L de glucosa. Este es el mismo medio (es decir, el medio ambiente) en el que se estimará la tasa de mutación. Agitar los cultivos a 120 rpm durante la noche a 37 oC.
    NOTA: La elección de los medios está sujeta a variaciones por especie, cepa o pregunta de investigación.

2. Día 2: Generación de Mutantes en Culturas Paralelas

  1. Primero, preparar los ambientes en los que se cultivarán las bacterias. Preparar siempre un 10% más de lo necesario (es decir, veinte cultivos de 1 ml requieren 22 ml). Preparar 22 ml de 1) DM con 80 mg/L de glucosa, 2) DM con 125 mg/L de glucosa, 3) DM con 250 mg/L de glucosa, 4) DM con 80 mg/L de glucosa, y 5) DM con 250 mg/L de glucosa en cinco tubos de 50 ml. Etiquete los glC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B y GLC-250B, respectivamente.
  2. Preparar la inócula para los ambientes. Asegúrese de que el inóculo para 1 mL del entorno contenga 1.000 a 5.000 celdas. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.
    1. Mida la densidad óptica (OD) de los cultivos nocturnos (desde el paso 1.2) a 600 nm.
    2. Diluir cada cultivo durante la noche con el fin de alcanzar una densidad final de 1.000-5.000 células por ml de DM con glucosa. En nuestras manos, si el OD medido en 2.2.1 es 0.3, esto significa hacer una dilución de 100 veces (en solución salina) del cultivo nocturno, luego añadir 11 l de esta solución al entorno de 22 ml.
  3. Preparar cultivos paralelos.
    NOTA:     Este protocolo está escrito para una placa de pozo de 96 profundidades, realizando cinco ensayos de fluctuación (el número máximo razonable en una placa de 96 pozos), utilizando tres entornos. Con experiencia, múltiples placas de pozo profundo se pueden ejecutar en paralelo.
    1. Cree un diseño aleatorio de cultivos paralelos para una placa de pozo de 96 profundidades. El script de R suplementario LayoutGenerator.R (véase el diseño en la figura 1B)se puede utilizar para esto. Coloque cada cultivo paralelo en la placa de pozo profundo 96 de acuerdo con el diseño.
      NOTA: La ejecución de LayoutGenerator.R garantizará que el primer ensayo tenga 20 referencias culturales paralelas y que los ensayos segundo, tercero, cuarto y quinto tengan 19 referencias culturales paralelas cada una.
    2. Transfiera 1 ml de medios inoculados a cada pozo de una placa de pozo de 96 profundidades de acuerdo con el diseño aleatorizado.
    3. Fije la tapa de la placa de pozo profundo con la cinta. No fijar la tapa firmemente, porque el crecimiento del cultivo es sensible a la cantidad de aireación.
    4. Pesar toda la placa con la tapa y la cinta y agitar la placa a 250 rpm durante 24 h a 37 oC. Colocar 2 L de agua destilada en la incubadora para estabilizar la cantidad de evaporación entre conjuntos experimentales.
  4. Determinar el tamaño del inóculo enchapando 10 ml de cada uno de los medios inoculados en la placa de agar Tetrazolium no selectivo (TA) (ver Tabla Suplementaria 1). Utilice un esparcidor estéril en forma de L hasta que la superficie del agar esté seca. Las placas de agar TA de incubación se reducen durante la noche a 37 oC.
    NOTA: El agar TA es un agar rico que contiene el azúcar L-arabinosa y el tinte soluble en agua 2,3,5-cloruro de trifenilettrazolium, que es incoloro en su forma oxidada. Cuando las bacterias reducen el tinte, se vuelve rojo debido a la formación de formazán. Las colonias en el agar TA que no pueden utilizar l-arabinosa son de color rojo oscuro. Otras cepas, como MG1655, son rosáceas. Se recomienda el uso de agar TA en lugar del agar LB estándar porque las colonias bacterianas de color son más fáciles de detectar, lo que hace que el conteo de colonias sea más confiable y más rápido.
  5. Preparar el agar TA selectivo que contenga rifampicina en 6 placas de pozo. Pipetear 5 ml del agar TA selectivo en cada pocilla de las 6 placas de pozo. Prepare el antibiótico rifampicina justo antes de que se añada al agar TA.
    NOTA:     Cuando la cicloserina se utiliza como marcador, utilice Davis medio mínimo con 250 mg/L de glucosa suplementada con agar y L-arabinosa y 2,3,5-cloruro de trifeniloliumtrazo como agar selectivo. A saber, agar TA no selecciona sólo las células que son resistentes a la cicloserina, porque la triptona y el extracto de levadura (ambos los componentes esenciales del agar TA) contienen el aminoácido D-alanina. Este aminoácido antagoniza el efecto antimicrobiano de la cicloserina y permite que todas las células hagan una colonia.
    1. Deje las placas selectivas y restantes no selectivas en la oscuridad (por ejemplo, en una caja) a temperatura ambiente.

3. Día 3: Cultivos de chapado en placas de agar selectivas y no selectivas

  1. Contar unidades formadoras de colonias (CFU) en las placas de agar no selectivas y determinar el tamaño de la inócula multiplicando la CFU por 100. Se trata de una relación entre un volumen del cultivo paralelo (1 ml a 1.000 l) y el volumen chapado (10 l).
    NOTA: Si se almacenan placas no selectivas refrigeradas, la CFU se puede contar más adelante.
  2. Después de 24 h de incubación, pesar toda la placa de pozo profundo para determinar la cantidad de evaporación. Es probable que esto sea alrededor del 10%.
  3. Calcular el volumen medio de un cultivo paralelo después de 24 h de incubación (V[24h]) en microlitros utilizando un volumen inicial V[0h] a 1.000 l y el peso de la placa convertido en microlitros, donde la densidad del medio de crecimiento se mide en mg/l. Este estudio utiliza una densidad de 1 mg/l:
    Fórmula de equilibrio estático, V[24h]=V[0h]−(1/densidad)×((peso[0h]−peso[24h])/96), cálculo.
  4. Transfiera los tres cultivos elegidos aleatoriamente por ensayo (15 en total, resaltado con un círculo negro en el diseño de la Figura 1B)en tubos de microcentrífuga etiquetados. Déjelos en el banco para utilizarlos más adelante (véase el paso 3.6) para determinar el tamaño final de la población (o Nt).
  5. Placa los 81 cultivos paralelos restantes desde la placa de pozo profundo hasta el agar TA selectivo que contiene rifampicina. Pipetear un cultivo paralelo completo de la placa de pozo profundo 96 en un pozo de una placa de 6 pocillos. Asegúrese de que cualquier placa de 6 pocillos contenga cultivos paralelos de más de un ensayo de fluctuación.
    1. Retire las tapas de las placas de agar selectivas y déjelas al descubierto en condiciones estériles. Seque todo el líquido en la superficie del agar TA selectivo.
      NOTA: El agar que está completamente seco es fundamental. Sin embargo, no seque en exceso el agar TA selectivo, porque no se debe permitir que se agriete.
  6. Mientras que las placas selectivas de agar TA se están secando, que puede tardar hasta varias horas, determinar Nt de los 15 cultivos preparados en el paso 3.4 utilizando unidades formadoras de colonias (CFU).
    1. Determinar la UFC diluyendo los cultivos de los tubos de microcentrífuga. Utilice cinco pasos de dilución de 10 veces, mezclando y vórtice 900 l de solución salina con 100 ml del cultivo en cada paso. Placa 40 l de la última dilución (con un factor de dilución de 105) en el agar TA no selectivo e incubar las placas se tapas durante la noche a 37 oC.
      NOTA: La serie de dilución en 96 placas de pozo se puede realizar con una pipeta multicanal, que puede aumentar la velocidad de este paso.
  7. Una vez que todos los pozos en una placa de 6 pozos están libres del líquido de cultivo, vuelva a colocar la tapa y coloque la placa de 6 pozos con la tapa hacia abajo en el banco hasta que las 6 placas de pozo estén secas. Una vez que todo esté seco, incubar la tapa de las placas a 37oC durante 44-48 h.
    NOTA: Para otros marcadores (ácido nalidixic, cicloserina, higromicina B o 5-FOA) incubar las placas durante 68-72 horas. Asegúrese de que la humedad de la incubadora sea alta. Es fundamental que las placas de agar selectivas no se sequen durante el período de incubación.

4. Día 4: Determinación del número de células en los cultivos

  1. Cuente la CFU en las placas de agar no selectivas. Estimar el número de células viables en el cultivo multiplicando la CFU con el factor de dilución (105) y la relación entre el volumen medio calculado V[24h] en microlitros (ver paso 3.3) y el volumen chapado (40 l):
    Fórmula de cálculo de Nt para unidades formadoras de colonias (UFC) con factor de dilución y relación de volumen.
  2. Nt de un genotipo particular que crece en un entorno particular es la media de estos valores de las tres culturas.

5. Día 5: Estimación de la tasa de mutación

  1. Contar el número de colonias resistentes al antibiótico en las placas selectivas de agar TA (es decir, el número de células resistentes que surgieron a través de la mutación espontánea en la placa de pozo profundo en los días 2-3). Registre la distribución entre las culturas paralelas del número observado de mutantes para un ensayo en particular (por ejemplo, 16 o 17 valores, incluyendo recuentos cero).
    NOTA:     Si las placas selectivas se almacenan refrigeradas, las colonias resistentes al antibiótico se pueden contar más adelante.
    1. Utilice cada distribución para estimar el número de eventos mutacionales, m, utilizando el flan R-package36.
      NOTA: También está el r-paquete RSalvador con funcionalidad similar29.
    2. Guarde la distribución de los mutantes observados para un ensayo en un archivo de texto como una sola columna.
  2. Utilice el software Shinyflan (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) para estimar m como se detalla a continuación.
    1. En la pestaña Las pruebas de hipótesis dejan valores como valores predeterminados (es decir, Aptitud desconocida marcada, Método de estimación , Probabilidad máxima (ML), Distribución de la vida útil mutante - Exponencial (modelo LD), Parámetro de Winsor 1.024, Número de mutación y Aptitud 1, Nivel de confianza a 0,95, Número de clase y Valor máximo a 100).
    2. Haga clic en Examinar y seleccione el archivo de texto con la distribución de los mutantes observados. Pruebe primero con el archivo de datos suplementarios.
    3. Después de cargar el archivo, haga clic en Realizar prueba. En el lado derecho bajo el resultado de la prueba,bajo la prueba de ML de una muestra (modelo LD), busque el número de mutación. Este es m, el número esperado de eventos mutacionales.
    4. Bajo el Intervalo de Confianza del 95 Por ciento para el Número de Mutación encontrar el límite superior e inferior de m.
  3. Una vez que m y Nt (determinados por cFU) están disponibles, estimar la tasa de mutación de un genotipo determinado en un entorno particular como Fórmula de flujo de masa \(\frac{m}{Nt}\) ecuación; Concepto clave para el estudio de la dinámica de fluidos. . Divida los límites superior e inferior en m por Nt de la misma manera para generar intervalos de confianza en la tasa de mutación (NB esto no tiene en cuenta la incertidumbre en Nt).
    NOTA: Los resultados se presentan como la tasa de mutación por locus rpoB por generación. La tasa de mutación por par base se genera dividiendo la tasa de mutación por locus rpoB por 79, que es nuestro conocimiento actual de cuántas mutaciones puntuales dentro de un gen rpoB confieren resistencia a la rifampicina37. La multiplicación de la tasa de mutación por nucleótido por el tamaño del cromosoma (E. coli K-12 MG1655 a 4.639.675 bp), da la tasa de mutación por genoma.
  4. Repita los pasos 5.1 a 5.3 con los cuatro ensayos de fluctuación restantes.

Resultados

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Los resultados fueron recopilados con el protocolo reportado en cuatro semanas diferentes por tres investigadores individuales diferentes, donde cada semana se utilizó una placa de pozo profundo de 96 para generar cinco estimaciones de la tasa de mutación. En total, tres 96 placas de pozos profundos generaron 15 estimaciones de la tasa de mutación (intervalo de confianza del 95%, CI) en E. coli K-12 MG1655(Figura 2A,tal como se utiliza en el protocolo), mientras que una placa de pozo de 96 profundidades se utilizó para cinco estimaciones (IC del 95%) de E. coli K-12 BW25113mutT mutante(Figura 2B). En la Figura 2, la precisión media con el rango intercuartil de m de estimación es del 17,5% (1,00%- 28,9%, n a 20). La precisión es un coeficiente de la variación del número esperado de eventos mutacionales (m) calculado como m / m x 100% (donde se calcula á como se ha calculado anteriormente38). Los datos sin procesar de la Figura 2 están disponibles en el archivo de datos suplementarios "Krasovec_etal_JoVE_data.csv". El archivo de datos suplementarios se acompaña de un script de R para generar la figura 2. Véase también Tabla suplementaria 2 para obtener más detalles sobre las cepas bacterianas y Tabla suplementaria 3, donde se explican las columnas del archivo de datos. Los puntos de datos adquiridos con rifampicina y ácido nalidixic fueron publicados previamente en Kra-ovec et al.10 y tienen los mismos ID aquí que cuando se publicó por primera vez.

En la Figura 2A se presentan las tasas de mutación MG1655 de tres marcadores fenotípicos diferentes, cicloserina, rifampicina y ácido nalidixico. Aquí, las tasas de mutación se evaluaron en Davis medio mínimo con 80, 125, y 250 mg/L de glucosa, como se explica en el protocolo. En un caso se utilizaron 1.000 mg/L de glucosa(Figura 1B). En la práctica, se puede utilizar cualquier concentración inicial de glucosa. Como era de esperar, las tasas de mutación fueron más altas para la resistencia a la cicloserina, más bajas para la resistencia al ácido nalidixico, y la tasa de resistencia a la rifampicina estaba en el medio. Esto está de acuerdo con los tamaños de destino conocidos para estas tres resistencias, donde el más grande es para la cicloserina y el más pequeño para el ácido nalidixic. La discusión y la Figura 3 proporcionan detalles sobre cómo explotar los tamaños objetivo, los volúmenes de cultivos paralelos y el nivel de nutrientes en el medio ambiente para optimizar la medición de las tasas de mutación microbiana con el ensayo de fluctuación.

El ensayo de fluctuación muestra claramente qué cepa es un mutador constitutivo y cuál tiene tasas de mutación normales. La cepamutT tenía una tasa de mutación aproximadamente 50 veces mayor a la resistencia al ácido nalidixico(Figura 2B)como MG1655(Figura 2A). Sin embargo, para determinar la tasa de mutación de un genotipo determinado en diferentes ambientes, se recomienda realizar al menos cinco réplicas por genotipo por entorno utilizando solo un marcador fenotípico. Para un esquema detallado de los métodos estadísticos utilizados anteriormente para analizar este tipo de experimento, véase la información complementaria en Kra-ovec et al.10.

Gráfico de la tasa de mutación frente a la concentración de glucosa; Comparación de datos con diagramas de dispersión y símbolos.
Figura 2: Figura representativa de las tasas de mutación estimadas por el ensayo de fluctuación en las poblaciones de Escherichia coli. (A) La tasa de mutación determinada por el protocolo notificado en el tipo salvaje MG1655 (círculos). La figura muestra las tasas de mutación en presencia de rifampicina (círculos azules claros), ácido nalidixico (círculos rojos) y resistencia a la cicloserina (círculos azules oscuros). Para el ácido nalidixic, se utilizaron volúmenes de cultivo más grandes de 10 ml (consulte Archivo de datos suplementarios). Los datos de rifampicina y ácido nalidixic se vuelven a trazar a partir de la Figura 2 aen Krasovec et al.10. (B) La tasa de mutación a la resistencia al ácido nalidixico en el mutanteMutT de Keio39 (triángulos rojos). Observe la escala logarítmica en el eje de la tasa de mutación. Barras de error: intervalos de confianza del 95% calculados como se explica en el protocolo. Los datos se vuelven a trazar de la Figura 4a en Krasovec et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de flujo del proceso de ensayo de fluctuación; mutador, configuración del entorno, análisis de la mediana de las colonias.
Figura 3: Un diagrama de flujo para solucionar problemas del ensayo de fluctuación. El diagrama de flujo debe seguirse desde la parte superior, abordando las tres preguntas en los diamantes amarillos a su vez, ajustando el protocolo de acuerdo con el contenido de las cajas verdes resultantes, e implementando el protocolo como se indica en los óvalos rojos. Consulte los tres primeros párrafos de la discusión para obtener más detalles sobre cómo solucionar problemas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Fórmulas para los medios utilizados en el protocolo. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).

Tabla Suplementaria 2: Cepas bacterianas. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).

Tabla complementaria 3: Descripción detallada de las columnas en el archivo de datos sin procesar Krasovec_etal_JoVE_data.csv. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).

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Discusión

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Cualquier estimación de una tasa de mutación necesita maximizar la precisión alcanzada para garantizar la repetibilidad y reproducibilidad dentro y entre los estudios34. Para un ensayo de fluctuación, hay tres consideraciones críticas. Los dos primeros se han establecido en el protocolo dado pero necesitarán solución de problemas (véase el cuadro 3) si el protocolo se adapta para trabajar con diferentes cepas o entornos. En primer lugar es elegir el marcador fenotípico adecuado. Para las bacterias, se recomienda estimar las tasas en uno de los dos marcadores loci, rpoB o gyrA,confiriendo resistencia a los antibióticos rifampicina y ácido nalidixic, respectivamente. El tamaño objetivo de las mutaciones a la resistencia a los antibióticos en estos dos loci es diferente. Hay 79 y 20 mutaciones únicas que confieren resistencia a la rifampicina37 y al ácido nalidixico40 respectivamente. En la práctica, esto significa que, en promedio, los mutantes resistentes a la rifampicina se observan con más frecuencia. Por lo tanto, la primera pregunta (Q1 en la Figura 3) que debe responderse es si la cepa es o no un mutador. Cuando se estudian mutadores constitutivos, donde se esperan muchas colonias mutantes observadas, es mejor usar un marcador con un tamaño objetivo más pequeño (por ejemplo, ácido nalidixico). Véase la Figura 2B, donde se estimaron las tasas de mutación del mutT delmutT de la comediante E. coli K-12 BW25113 utilizando el ácido nalidixico como marcador. Cuando se trabaja con cepas bacterianas no mutadoras que tienen una tasa de mutación de tipo salvaje (es decir, normal), la rifampicina es una mejor opción (ver Figura 2A). Si por alguna razón se necesitan mutantes más observados, un marcador relevante es la resistencia a una cicloserina. Para este marcador, pueden surgir mutaciones de resistencia en más de diez genes41,lo que significa que el tamaño objetivo es incluso mayor que para la rifampicina. Al estudiar la levadura y la arquea se recomienda estimar las tasas de mutación en proteínas ribosomales 25S y URA3, confiriendo resistencia a la higromicina B y al ácido 5-fluoro-orotico (5-FOA), respectivamente.

La segunda consideración crítica es el volumen de cultivos paralelos. El volumen a utilizar depende del número real de mutantes observados. El número esperado de mutantes observados se ve afectado por el tamaño objetivo del marcador fenotípico elegido, la capacidad de la cepa para reparar y evitar mutaciones (la tasa media de mutación) y la capacidad de transporte del medio ambiente, que se ve afectada tanto por los medios utilizados como por el volumen de cultivo. Si no hay cultivos paralelos que contengan colonias mutantes resistentes a la rifampicina, se debe utilizar la cicloserina o aumentar el número de células chapadas. Esto se puede lograr mediante la adición de más glucosa a un medio mínimo o mediante el crecimiento de células en un entorno más rico (o completo). Sin embargo, en muchos casos, tal aumento en la densidad de población se asocia con una reducción en la tasa de mutación, lo que resulta en un aumento limitado, si lo hay, en el número de colonias mutantes observadas10. Si aumentar los nutrientes no es una solución, entonces aumentar el número de células aumentando el volumen de cada cultivo paralelo es una opción. Cuando el medio ambiente incluye sales mínimas con azúcar como única fuente de carbono y energía (es decir, la respuesta a Q2 en la Figura 3 es "medio mínimo"), entonces se deben utilizar volúmenes entre 0,5 y 1,5 ml. Si el entorno es enriquecido, los volúmenes de referencias culturales paralelas deben estar entre 0,35 y 1 ml. La última pregunta se refiere a la mediana del número de colonias resistentes. Si se observan muy pocas colonias mutantes (es decir, la respuesta a Q3 en la Figura 3 es 0) y el entorno no debe modificarse, entonces se debe aumentar el volumen de cultivos paralelos o utilizar el antibiótico con un tamaño objetivo más grande (por ejemplo, cicloserina). Por otro lado, si se observan muchas colonias mutantes en todas las placas selectivas (más de 150 euros por placa, véase la figura 3), entonces se debe disminuir el número de células chapadas, lo que generalmente significa usar un volumen más bajo o cambiar a un antibiótico con un tamaño objetivo más pequeño (por ejemplo, ácido nalidixico).

Una vez elegido el volumen, lo mejor es que todos los cultivos paralelos en una placa de pozo de 96 profundidades tengan el mismo volumen. Esto permite una determinación más precisa del volumen real de cultivos paralelos a partir del peso de la placa. Cuando se comparan las tasas de mutación de un genotipo en particular entre diferentes entornos, es mejor utilizar de nuevo el mismo volumen de cultivos paralelos en todos los entornos. Si se utiliza ácido nalidixico para estimar las tasas de mutación de tipo silvestre (es decir, normal) o se utiliza algún otro marcador fenotípico que tenga un tamaño objetivo aún menor que el ácido nalidixico, el volumen debe aumentarse aún más. Una opción es hacer cultivos paralelos en tubos de 50 ml con volúmenes de hasta 15 ml. Por ejemplo, se prepararon cultivos paralelos de 10 ml en tubos de 50 ml al estimar la tasa de mutación de E. coli K-12 MG1655 al ácido nalidixico (ver Figura 2A). Los cultivos paralelos de 10 ml se enchaparon en el agar selectivo TA y se vertieron en grandes placas de 150 mm en lugar de platos Petri estándar de 90 mm. La desventaja de preparar cultivos paralelos en tubos de 50 ml es que el rendimiento es considerablemente menor en comparación con las tasas de mutación en una placa de pozo de 96 profundidades. Una solución es disminuir el número de referencias culturales paralelas. Sin embargo, esto afectará a la precisión para la estimación de m, que depende del número esperado de eventos mutacionales y el número de cultivos paralelos26. Obtener una distribución de mutantes observados con 14-17 culturas paralelas (como se hizo en la Figura 2),es un buen equilibrio entre un rendimiento sólido y un nivel de precisión aceptable26 del 20%. Un nivel de precisión medio del 17,5% es similar a la precisión mediana con un rango intercuartil del 16,4% (5,7%, 38,9 %, n a 580) calculado a partir de un conjunto de datos mucho más grande10. Por lo tanto, se recomienda que al preparar cultivos paralelos en 96 placas de pozos profundos o tubos de 50 ml la distribución de los mutantes observados se obtenga con al menos 14 cultivos paralelos. Cuando se estiman las tasas de mutación en diferentes entornos, se recomienda probar los niveles de precisión realizando un experimento multiplaca, donde los 96 cultivos paralelos en una placa se cultivan en el mismo entorno. Además, al preparar cultivos paralelos, es fundamental que la inócula contenga un número bajo de células, ya que reduce las posibilidades de que las células resistentes estén presentes en el inóculo. Los mutantes resistentes preexistentes no se quieren en el inóculo, porque aumentarán en número y crearán un césped en placas selectivas y la estimación de la tasa de mutación no será posible. Por ejemplo, en la mayoría de las poblaciones no mutadoras de E. coli, la tasa de mutación a la resistencia a la rifampicina está en el orden de 10-8. Por lo tanto, para evitar inocular el cultivo con un mutante resistente preexistente, se debe inocular con menos de 108 células (por ejemplo, 103x 104 células). El último paso crítico es asegurar que antes de que se incuban las placas de agar selectivas, la superficie del agar selectivo esté completamente seca. Los esparcidores no se pueden utilizar si se utilizan placas de 6 pocillos y el volumen inicial de un cultivo paralelo es de 1 ml, por ejemplo. Las placas deben dejarse sin cubrir en condiciones estériles para dejar que la superficie se seque. El tiempo que esto toma puede ser muy variable, dependiendo de las condiciones ambientales y el estado de las placas. Este tiempo debe minimizarse, pero puede ser de hasta varias horas.

El ensayo de fluctuación tiene restricciones inherentes. Ensayos marcadores fenotípicos de mutación sólo en un pequeño subconjunto del genoma. Por lo tanto, el ensayo requiere grandes poblaciones que pasan por un número suficiente de generaciones para observar suficientes mutaciones para estimar una tasa en absoluto. Esto significa que los ensayos de fluctuación sólo se pueden utilizar en organismos que son capaces de pasar por un gran número de generaciones rápidamente, como bacterias, levadura de panadero42,o células de mamíferos de cultivo líquido30. Además, las mutaciones son eventos raros que ocurren en las circunstancias bioquímicas específicas de una célula en particular. El hecho de que los ensayos de fluctuación aparecen en grandes poblaciones de células a lo largo del tiempo significa que esas circunstancias pueden diferir sustancialmente. Usando este ensayo, es por lo tanto difícil estudiar la progresión de las tasas de mutación de una población particular desde la fase de retraso a la fase exponencial temprana y tardía y finalmente a una fase estacionaria. Cualquier diferenciación de las tasas de mutación entre células individuales dentro de la población está completamente oculta del ensayo de fluctuación. La dinámica de mutación de una sola célula se puede estudiar con un seguimiento de una sola molécula de la proteína de reparación del ADN MutS43 o contando los focos de las proteínas MutL acumuladas44. Los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento también han hecho posible estimar directamente las tasas de mutación de los tríosdepadres-descendientes9,45 y pedigríes de multigeneración46. Estos avances metodológicos están empezando a permitir el recuento directo de mutaciones que ocurren dentro de una sola generación. Sin embargo, este enfoque directo necesita tecnologías costosas y de última generación como la microscopía de fluorescencia, los microfluídicos o la secuenciación del genoma completo. Por otro lado, el ensayo de fluctuación es relativamente barato y sólo se necesitan equipos de laboratorio estándar. Hacer más ensayos de fluctuación también facilitará la generación de nuevas hipótesis que pueden ser probadas con enfoques de una sola célula más directos.

Existe un interés de larga data en el estudio de mutaciones, por lo que el ensayo de fluctuación probablemente seguirá siendo un método ampliamente utilizado. El número de citas del documento seminal de Luria y Delbrick5 en los últimos 4 años (2015-2018) ha estado entre las cinco primeras en el caso de las citas de este artículo. Sin embargo, debido a una gran cantidad de trabajo manual preciso necesario para llevar a cabo correctamente un ensayo de fluctuación, la mayoría de los estudios sólo llevan a cabo un puñado de ensayos de fluctuación. Esto, sin embargo, es insuficiente para revelar las dependencias ambientales de la tasa de mutación. Al agilizar los ensayos de fluctuación utilizando placas multipozo, como se explica en este documento, el rendimiento máximo actual posible es de 11 placas de pozos profundos (55 ensayos de fluctuación) en paralelo, como se describe aquí. Ejecutar dos conjuntos de ensayos de fluctuación escalonados por un día en paralelo, permite llevar a cabo hasta 110 ensayos por semana. Otro cambio de paso en el rendimiento todavía puede ser posible mediante la automatización de varios pasos de los ensayos de fluctuación desde el protocolo puramente manual dado. Además, para estudiar las dependencias ambientales de la tasa de mutación, la densidad de población debe tenerse en cuenta. Los resultados anteriores10 muestran que cuando se contabilizan factores conocidos que afectan a la tasa de mutación, el control de la densidad de población puede reducir la variación en las estimaciones de la tasa de mutación en más del 90%. Para controlar la densidad, recomendamos que Nt (utilizado para estimar la tasa de mutación) se determine independientemente del método utilizado para determinar la densidad de población. En bacterias, Nt puede ser determinado por la CFU y la densidad, por ejemplo, con un ensayo de luminiscencia basado en ATP10.

El alto rendimiento y el control de la densidad son esenciales a la hora de estudiar cómo el contexto ecológico de un organismo afecta a la tasa de mutación espontánea. Conocer la existencia de plasticidad de la tasa de mutación es importante, pero comprender sus causas y efectos son desafíos clave que deben cumplirse para incorporar la plasticidad de la tasa de mutación en un contexto biológico más amplio. El ensayo de fluctuación es una gran herramienta que se puede utilizar para probar muchas hipótesis, porque los resultados se obtienen rápidamente, y los ensayos son baratos en relación con otros métodos. La etapa está lista, por ejemplo, para estudiar las dependencias ambientales de la tasa de mutación en comunidades bacterianas y microbiomas. Adaptar el ensayo de fluctuación a los cocultivos puede probar la hipótesis de que las cepas influyen en las tasas de mutación de los demás a través de moléculas pequeñas. Hacer miles de ensayos de fluctuación con coculturas puede determinar si las cepas varían tanto en su capacidad para modificar las tasas de mutación de los demás como en su susceptibilidad a que otros modifiquen su tasa de mutación. Tal vez la variación entre las cepas de susceptibilidad a la manipulación de la tasa de mutación es atribuible a una variación genética específica. Esto puede transformar nuestros puntos de vista sobre cómo funciona la evolución en comunidades complejas, sobre todo en ejemplos de gran importancia como la forma en que surge la resistencia a los antimicrobianos.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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RK fue apoyado por BB/M020975/1 y la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Manchester. HR fue apoyado por BB/J014478/1. GG fue apoyado por BBSRC Doctoral Training Partnership BB/M011208/1. DRG fue apoyado por el número de premio UKRI MR/R024936/1.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL StarlabInternational GmbHS1615-5550
Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolioSigma-AldrichT8877-10g
Placas de 6 pocillos GreinerBio-OneREF 657102
90 mm Placas de Petri de triple ventilaciónThermoFisher ScientificREF
96 (Masterblock 2 mL)Greiner Bio-OneREF 780270
Sulfato de amonioFisher ChemicalA/6440/53
Bacto AgarBecton, Dickinson and CompanyREF 214010
Extracto de levadura BactoBecton, Dickinson and CompanyREF 212750
CicloserinaSigma-Aldrich1158005-250MGSolo para analizar un marcador fenotípico alternativo
D-Glucosa anhidraFisher ChemicalG/0500/61
50 mL Tubo de centrífugaCorningREF 430828
L-(+)-ArabinosaSigma-AldrichA3256-500g
Sulfato de magnesio heptahidratadoFisher ChemicalM/1050/53
Ácido nalidíxicoSigma-AldrichN8878-5GSolo para ensayar una alternativa marcador fenotípico
Fosfato de potasio dibásico trihidratoSigma-AldrichP5504-500g
Fosfato de potasio monobásicoSigma-AldrichP0662-500g
RifampicinaEMD Millipore Corp, USA557303-1GM
Cloruro de sodioFisher ChemicalS/3160/60
EspectrofotómetroJenway6320D
Clorhidrato de tiaminaSigma-AldrichT4625-25g
Citrato trisódico dihidratadoSigma-AldrichS1804-500g
TriptonaFisher Chemical1278-7099
120189

Referencias

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  46. Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes. Nature Communications. 8 (1), 303(2017).">Narasimhan, V. M., et al. Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes. Nature Communications. 8 (1), 303(2017).

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