Aquí, presentamos un protocolo para inducir hipertensión ocular y neurodegeneración glaucomatosa en los ojos del ratón por inyección intracameral de aceite de silicona y el procedimiento para la eliminación de aceite de silicona de la cámara anterior para devolver la presión intraocular elevada a Normal.
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Artículo de método
Un modelo de hipertensión ocular inducida por aceite de silicio reversible en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La presión intraocular elevada (PIO) es un factor de riesgo bien documentado para el glaucoma. Aquí describimos un método novedoso y eficaz para inducir consistentemente la elevación estable de la PIO en ratones que imita la complicación postoperatoria del uso de aceite de silicona (SO) como agente de tamponade en cirugía vitreoretiniana humana. En este protocolo, SO se inyecta en la cámara anterior del ojo del ratón para bloquear la pupila y evitar la entrada de humor acuoso. La cámara posterior acumula humor acuoso y esto a su vez aumenta el IOP del segmento posterior. Una sola inyección de SO produce elevación de Pio fiable, suficiente y estable, que induce una significativa neurodegeneración glaucomatosa. Este modelo es una verdadera réplica del glaucoma secundario en la clínica oftalmológica. Para imitar aún más el entorno clínico, SO se puede extraer de la cámara anterior para reabrir la vía de drenaje y permitir la entrada de humor acuoso, que se drena a través de la malla trabecular (TM) en el ángulo de la cámara anterior. Debido a que la PIO vuelve rápidamente a la normalidad, el modelo se puede utilizar para probar el efecto de reducir la PIO en las células ganglionas de la retina glaucomatosa. Este método es sencillo, no requiere equipos especiales ni procedimientos de repetición, simula de cerca situaciones clínicas y puede ser aplicable a diversas especies animales. Sin embargo, pueden ser necesarias modificaciones menores.
Introducción
La pérdida progresiva de las células ganglionares de la retina (RGC) y sus axones es el sello distintivo del glaucoma, una enfermedad neurodegenerativa común en la retina1. Afectará a más de 100 millones de personas de 40 a 80 años para 20402. La PIO sigue siendo el único factor de riesgo modificable en el desarrollo y progresión del glaucoma. Con el fin de explorar la patogénesis, progresión, y tratamientos potenciales del glaucoma, es imperativo un modelo de hipertensión ocular experimental/glaucoma experimental confiable, reproducible e inducible que recanda las características clave de los pacientes humanos.
IOP depende de la entrada de humor acuoso a la cámara anterior desde el cuerpo ciliar en la cámara posterior y la salida a través de la malla trabecular (TM) en el ángulo de la cámara anterior. Al llegar a un estado estable, se mantiene el IOP. Cuando la entrada excede o es menor que la salida, el IOP sube o baja respectivamente. Al disminuir la salida acuosa, ya sea obiencándose el ángulo de la cámara anterior o dañando la TM, se han establecido varios modelos de glaucoma3,4,5,6,7,8,9,10. Estos modelos se asocian normalmente con daño irreversible en el tejido ocular, y el alto IOP en la cámara anterior también causa complicaciones no deseadas como edema corneal e inflamación intraocular, que hacen que la imagen de la retina y los ensayos de la función visual sean difíciles de realizar e interpretar.
Para desarrollar un modelo que supere estas deficiencias, nos centramos en el glaucoma secundario bien sudocumentado causado por el aceite de silicona (SO) que se produce como una complicación postoperatoria de la cirugía vitreoretiniana humana11,12. SO se utiliza como un tamponade en cirugías de retina debido a su alta tensión superficial. Sin embargo, SO puede oclusión físicamente la pupila porque es más ligera que los fluidos acuosos y vítreos, lo que impide el flujo acuoso en la cámara anterior. La obstrucción causa elevación de la PIO en la cámara posterior debido a la acumulación de humor acuoso. Esto nos motivó a desarrollar y caracterizar un novedoso modelo de ratón de hipertensión ocular basado en la inyección intracameral SO y el bloque pupilar13,con características clave del glaucoma secundario: bloque pupilar efectivo, elevación significativa de la PIO que puede volver a la normalidad después de la eliminación de SO, y neurodegeneración glaucomatosa.
Aquí presentamos un protocolo detallado para la hipertensión ocular inducida por SO en el ojo del ratón, incluyendo la inyección y extracción de SO y la medición de la PIO.
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Protocolo
Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Stanford.
1. Inducción de hipertensión ocular por inyección intracameral de SO
- Prepare un micropipeta de vidrio para la inyección intracameral de SO tirando de un capilar de vidrio con un tirador de pipeta para generar una micropipeta. Corte una abertura en la punta de la micropipette y afila rinde aún más la punta con una máquina de biselado de micromolinillos para hacer un bisel de 35o 40o.
- Pulir los bordes del bisel y eliminar todos los residuos mediante el lavado con agua. Autoclave el micropipeta antes de su uso.
- Prepare la aguja de paracentesis para la entrada de la córnea. Para ello, coloque una aguja de 32 G en una jeringa de 5 ml en una cerradura Luer y acontezándola con cinta adhesiva. Doblar la punta del bisel de la aguja hacia arriba a 30o.
- Prepare primero el inyector SO uniendo y fijando una aguja de extremo contundente de 18 G en una jeringa de 10 ml. A continuación, coloque un tubo de plástico con la aguja de 18 G en un extremo y llene con SO según sea necesario a través del otro extremo.
- Fije la micropipeta esterilizada al tubo de plástico y empuje el émbolo de la jeringa para llenar toda la micropipeta con SO.
2. Inyección intracameral so para un ojo
- Coloque un ratón C57B6/J macho de 9 a 10 semanas de edad en una cámara de inducción con 3% de isoflurano mezclado con oxígeno a 2 L/min durante 3 min.
- Inyección intraperitoneal 2,2,2-tribromoetanol a 0,3 mg/g de peso corporal.
NOTA: A diferencia de la ketamina/xilazina, 2,2,2-tribromoetanol no causa dilatación obvia de la pupila. - Compruebe la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del bato y la falta de movimiento de los bigotes o la cola para determinar la fuerza anestésica.
- Coloque el ratón en posición lateral sobre una plataforma de cirugía. Para reducir su sensibilidad durante el procedimiento, aplique una gota de clorhidrato de proparacaína al 0,5% en la córnea antes de la inyección.
- Haga una incisión de entrada con la aguja de paracentesis de 32 G en el cuadrante superotemporal, a unos 0,5 mm del limbo.
- Túnel a través de las capas de la córnea durante aproximadamente 0,3 mm antes de perforar en la cámara anterior. Tenga cuidado de no tocar la lente o el iris.
- Retirar la aguja lentamente para liberar un poco de humor acuoso (alrededor de 1 x 2 l) de la cámara anterior a través del túnel (paracentesis).
- Espere 8 minutos para disminuir aún más el IOP. Esto se puede determinar midiendo el ojo de control contralateral.
- Inserte la micropipeta de vidrio precargada con SO a través del túnel corneal en la cámara anterior, con el bisel hacia abajo hasta la superficie del iris.
- Empuje el émbolo de la jeringa lentamente para inyectar SO en la cámara anterior hasta que la gota SO cubra la mayor parte de la superficie del iris, de 2,3 x 2,4 mm de diámetro.
- Deje el micropipeta en la cámara anterior durante 10 s más antes de retirarlo lentamente.
- Empuje suavemente el párpado superior para cerrar la incisión de la córnea para minimizar la fuga de SO.
- Aplique un ung mento antibiótico (bacitracina-neomicina-polimicina) en la superficie del ojo.
- A lo largo del procedimiento, con frecuencia humedezca la córnea con lágrimas artificiales.
- Mantenga el ratón en la almohadilla de calentamiento hasta que esté completamente recuperado de la anestesia.
3. Tan remoción
- Preparen el sistema de riego.
- Preparar la solución de riego de acuerdo con las instrucciones del fabricante y colocarla en la botella de riego. Elevar el frasco de solución de irrigación a 110-120 cm (81-88 mmHg) por encima de la plataforma de cirugía.
- Coloque un conjunto de administración IV en el frasco de solución de riego. Retire las burbujas de aire del tubo IV. Conecte una aguja de 33 G doblada a una cara de 20o hasta el tubo IV.
- Para preparar el sistema de drenaje, retire el émbolo de una jeringa de 1 ml. Fije una aguja de 33 G a la jeringa y doble la aguja a 20o.
- Retire EL de la cámara anterior.
- Inyección intraperitoneal 2,2,2-tribromoetanol (0,3 mg/g de peso corporal). Compruebe la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo para determinar la fuerza anestésica y la falta de movimiento de los bigotes o la cola.
- Coloque el ratón sobre una plataforma de cirugía y fíjelo en la posición lateral con cinta adhesiva. Aplicar una gota de 0.5% clorhidrato de proparacaína a la córnea para reducir su sensibilidad.
- Haga dos incisiones en el cuadrante temporal de la córnea entre las 2 y las 5 en el borde de la gota SO utilizando la aguja de paracentesis de 32 G prefabricada.
- Inserte una aguja de riego de 33 G conectada a una solución de riego a través de una incisión corneal, velocidad máxima.
- Inserte otra aguja de drenaje de 33 G unida a la jeringa sin un émbolo a través de la otra incisión corneal para permitir que la gota SO salga de la cámara anterior mientras regará con solución de riego.
- Retire la aguja de drenaje y, a continuación, la aguja de riego.
- Inyecte una burbuja de aire en la cámara anterior para mantener su profundidad normal y presione para cerrar la incisión corneal.
- Aplique pomada antibiótica en ambos ojos.
- Mantenga el ratón en la almohadilla de recuperación de calentamiento hasta que esté completamente recuperado de la anestesia.
4. Medición de la PIO una vez a la semana
- Coloque el ratón en una cámara de inducción perfundida con 3% de isoflurano mezclado con oxígeno a 2L/min durante 3 min.
- Inyección intraperitoneal y ketamina (0,01 mg de xilazina/g, 0,08 mg de ketamina/g).
- Mantenga la córnea húmeda aplicando lágrimas artificiales durante todo el procedimiento.
- Espere unos 15 minutos para permitir que la pupila se dilata por completo.
- Mida el IOP de ambos ojos usando un tonómetro de acuerdo con las instrucciones del producto. Lleve el tonómetro cerca del ojo del ratón. Mantenga la distancia desde la punta de la sonda hasta la córnea del ratón a unos 3 x 4 mm. Pulse el botón de medición 6x para generar una lectura. Se obtienen tres lecturas generadas por máquina de cada ojo para adquirir la PIO media.
- Sacrificar a los animales a las 8 semanas después de la inyección de SO y realizar inmunohistoquímica de la retina de montaje completo, conteo de RGC, secciones semidelgadas del nervio óptico (ON) y cuantificación de los axones supervivientes, que se han descrito antes de13.
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Resultados
Poco después de la inyección podemos identificar fácilmente ratones que no producen hipertensión ocular estable debido a que las gotas SO son demasiado pequeñas (1,5 mm)13. Estos animales están excluidos de experimentos posteriores. Después de los procedimientos de inyección, más del 80% de los ratones inyectados en SO terminan con gotas de más de 1,6 mm. Medimos el IOP de estos ojos del ratón una vez a la semana durante 8 semanas después de una sola inyección de SO. El PIO del ojo que recibe SO s...
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Discusión
Aquí demostramos un procedimiento simple pero eficaz para inducir la elevación sostenida de la PIO en el ojo del ratón por inyección intracameral de SO. Este procedimiento puede ser aprendido rápidamente por cualquier persona con experiencia en microdisección bajo un microscopio. El principal riesgo potencial de falla es la fuga de SO de la incisión corneal. Sin embargo, una de las ventajas de usar SO es que debido a que la gota de aceite es visible y medible, podemos identificar fácilmente ratones que recibieron gotas d...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por las subvenciones DE NIH EY024932, EY023295 y EY028106 a YH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.5% clorhidrato de proparacaína | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G aguja | BD | con bisel regular, longitud de la aguja:25.4 mm | |
| 2,2,2-tribromoetanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD 320122 | BD Nano Aguja de pluma ultrafina-32G 4mm | |
| aguja oftalmológica 33G | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Inyección (xilacina) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificiales | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Gotas Oftálmicas Lubricantes BSS |
| PLUS Solución de irrigación | Alcon Laboratories | ||
| Extractor de micropipetas de vidrio de doble etapa | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurano | VetOne | 502017 | isoflurano, USP, 250 ml/frasco |
| IV Sets de administración | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| CLORHIDRATO DE KETAMINA INYECCIÓN VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml | |
| máquina biseladora de micromolienda | NARISHIGE | EG-401 | |
| Tubo de EVA en miniatura | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 pies de longitud |
| aceite de silicona (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Capilares de vidrio estándar | WPI / Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100 mm) OD 1,5 mm ID 0,84 mm |
| Tonómetro TonoLab | Colonial Medical Supply, Finlandia | ||
| pomada antibiótica veterinaria | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP pomada oftálmica, Vetropolycin |
Referencias
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