In vitro etablering af en genetisk manipuleret murine hoved og hals Cancer cellelinje ved hjælp af en adeno-associeret virus-Cas9 system
Summary
Udvikling af murine modeller med specifikke gener muteret i hoved og halscancer patienter er nødvendig for forståelsen af neoplasi. Her præsenterer vi en protokol for in vitro-omdannelse af primære murine tunge celler ved hjælp af en adeno-associeret virus-Cas9 system til at generere murine HNC cellelinjer med specifikke genomiske ændringer.
Abstract
Brugen af primære normale epitelceller gør det muligt at reproducerbart inducere genomiske ændringer, der kræves for cellulære transformation ved at indføre specifikke mutationer i onkogener og tumor suppressor gener, ved hjælp af klyngeopdelte regulerende hinanden kort palindromiske REPEAT (crispr)-baseret genom redigerings teknologi i mus. Denne teknologi giver os mulighed for nøjagtigt at efterligne de genetiske ændringer, der opstår i menneskelige kræftformer ved hjælp af mus. Ved genetisk omdanne murine primære celler, vi kan bedre studere kræft udvikling, progression, behandling, og diagnose. I denne undersøgelse, vi brugte CRE-inducerbar Cas9 mus tungen epitelceller til at muliggøre genomredigering ved hjælp af adeno-associeret virus (AAV) in vitro. Specifikt, ved at ændre KRAS, P53 og APC i normale tunge epitelceller, vi genereret en murine hoved og halscancer (HNC) cellelinje in vitro, som er tumorigent i syngeneiske mus. Den metode, der præsenteres her, beskriver i detaljer, hvordan man genererer HNC cellelinjer med specifikke genomændringer og forklarer deres egnethed til at forudsige tumorprogression i syngeneiske mus. Vi forestiller, at denne lovende metode vil være informativ og nyttig til at studere tumor biologi og terapi af HNC.
Introduction
HNC er en almindelig malignitet på verdensplan1. Modellering tilblivelsen af HNC neoplasi er i øjeblikket på et videnskabeligt vendepunkt2. Mens mange genetiske mutationer er blevet identificeret i HNC2,3,4 (f. eks. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 og RAS), er de specifikke kombinationer af genomændringer, der kræves i koncert for at inducere HNC, stadig uklare.
Den nuværende brug af humane HNC cellelinjer har bidraget væsentligt til at belyse mekanismerne i forbindelse med patogenese og behandling3. Men studiet af humane cellelinjer i immunkompromitterede murine systemer har sine begrænsninger, fordi disse systemer ikke adresserer in vivo neoplastisk proces, rollen af specifikke genmutationer og behandlingsrespons i et immun mikromiljø. Derfor er udvikling og etablering af murine cellelinjer med specifikke genetiske ændringer af afgørende betydning for at undersøge, hvordan forskellige gener bidrager til transformationsprocessen, og for at afprøve nye molekyle baserede terapier hos immunkompetente mus.
Genfunktions undersøgelser i biomedicinsk forskning er blevet væsentligt påvirket af fremskridt inden for DNA-redigeringsteknologier ved at indføre dobbelt strengene pauser (DSBs), for eksempel5. Disse teknologier, herunder brugen af zink finger nucleaser, transkriptionsaktivator-lignende Effector nucleaser, og grupperet regulerende hinanden korte palindromiske gentagelser (crispr/Cas9), giver mulighed for manipulation af ethvert gen af interesse på sin locus. De seneste CRISPR/Cas9-systemer består af en guide RNA (gRNA), der dirigerer Cas9 nuclease til at generere en DSB på et bestemt sted i genomet. Dette system har opnået stor anerkendelse i at modificere endogene gener i enhver celle eller målvæv, selv i de mest traditionelt vanskelige at behandle organismer5. Det har flere fordele i forhold til andre systemer på grund af sin enkelhed, hastighed og effektivitet.
I onkologi har CRISPR/CAS9-teknologien opfyldt behovet for effektivt at efterligne kræftceller. For at etablere dette system i HNC, vi manipulerede den potente KRAS onkogen og to vigtige tumor suppressor gener, APC og P536. Ifølge GENIE database7, denne kombination er sjælden i HNC. RAS-mutationer (HRAS, NTM og KRAS) er kun til stede i ~ 7% af alle HNC-populationer. Disse tumorer tendens til at være modstandsdygtig over for terapi8,9.
Levering af Cas9 og dens gRNA opnås gennem viral transduktion ved hjælp af enten AAVs eller lentivira. Rekombinant AAV er ofte den foretrukne metode til at levere gener til at målrette celler på grund af sin høje titer, mild immunrespons, evne til at overføre en bred vifte af celler, og generelle sikkerhed. Ved hjælp af et AAV-system, forskellige vævsspecifikke muse cellelinjer er blevet genereret, og nye cellelinjer er stadig ved at blive udviklet10,11,12. Men, et effektivt genomisk redigeringssystem, der kan generere murine HNC cellelinje modeller celler mangler at blive udviklet. I denne undersøgelse, vi søgte at udvikle et in vitro AAV-Cas9-baseret system til omdannelse af primære murine tunge celler i en tumorigent tilstand. Denne unikke CRISPR/Cas9 transformation protokol og den etablerede tumor cellelinje kan bruges til bedre at forstå biologi HNC induceret af en mangfoldighed af genomiske ændringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere metoder har tidligere været anvendt til at omdanne primære celler i kultur med varierende grader af succes25,26,27,28. De fleste af disse metoder bruger mus fibroblast celler til omdannelse14,17,18,19 eller bruge kræftfremkaldende stoffer såsom 4-nitroquinol…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Daniel Gitler for at give os pAd Delta 5 Helper plasmid. Dette arbejde blev finansieret af Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (til mig), de Forenede Stater-Israel binational Science Foundation (BSF, 2017323) (til mig og MS), Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (for mig), Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (for mig), og concern Foundation (#7895) (for mig). Fællesskabet: Alon-stipendiet til mig og BGU Kreitman-stipendierne til SJ og MP.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
Referencias
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O’Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
