La matriz extracelular descelularizada (dECM) puede proporcionar señales microambientales adecuadas para recapitular las funciones inherentes de los tejidos diana en una construcción diseñada. Este artículo aclara los protocolos para la descelularización del tejido pancreático, la evaluación del bioink dECM derivado del tejido pancreático y la generación de construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión.
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Artículo de método
Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D
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En este artículo
Resumen
Resumen
El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento prometedor para los pacientes que sufren de diabetes tipo 1 acompañado de hipoglucemia y complicaciones secundarias. Sin embargo, el trasplante de islotes todavía tiene varias limitaciones, como la baja viabilidad de los islotes trasplantados debido a la falta de injerto de islotes y entornos hostiles. Además, las células productoras de insulina diferenciadas de las células madre pluripotentes humanas tienen una capacidad limitada para secretar suficientes hormonas que pueden regular el nivel de glucosa en sangre; por lo tanto, se requiere encarecidamente mejorar la maduración mediante el cultivo de células con señales microambientales adecuadas. En este artículo, esclarecemos los protocolos para preparar un biocontenido de matriz extracelular descelularizada derivada del tejido pancreático (pdECM) para proporcionar un microambiente beneficioso que puede aumentar la sensibilidad a la glucosa de los islotes pancreáticos, seguido de describir los procesos para generar construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión basada en microextrusión.
Introducción
Recientemente, el trasplante de islotes pancreáticos se ha considerado un tratamiento prometedor para pacientes con diabetes tipo 1. La relativa seguridad y mínima invasividad del procedimiento son grandes ventajas de este tratamiento1. Sin embargo, tiene varias limitaciones como la baja tasa de éxito de islotes de aislación y los efectos secundarios de los fármacos inmunosupresores. Además, el número de islotes injertados disminuye constantemente después del trasplante debido al ambiente hostil2. Se han aplicado varios materiales biocompatibles como alginato, colágeno, ácido poli(láctico-coglicólico) (PLGA) o polietilen....
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Protocolo
Se recogieron tejidos pancreáticos porcinos de un matadero local. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Asan Medical Center, Seúl, Corea.
1. Descelularización de tejidos
- Preparar las soluciones para la descelularización.
NOTA: 1 solución salina con fosfato (PBS) utilizada en todas las preparaciones de la solución se diluye añadiendo agua destilada a 10x PBS.- Para la solución 1% Triton-X 100, disolver 100 ml de solución 100% Triton-X 100 en 900 ml de 1x PBS utilizando una barra de agitación magnética con la agitación a 150 rpm para 6 h. Hacer 4....
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Resultados
Descelularización de los tejidos pancreáticos
Desarrollamos el proceso de preparación de biotinta pdECM para proporcionar microambientes específicos del tejido pancreático para mejorar la funcionalidad de los islotes en una construcción de tejido bioimpreso 3D(Figura 2A). Después del proceso de descelularización, se eliminó el 97,3% del ADN DSDNA y los componentes representativos de ECM, como el colágeno y los GAG, se mant.......
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Discusión
Este protocolo describió el desarrollo de biotintas pdECM y la fabricación de construcciones de tejido pancreático 3D mediante el uso de técnicas de impresión de células 3D. Para recapitular el microambiente del tejido diana en la construcción de tejido diseñado 3D, la elección de biotinta es fundamental. En un estudio anterior, validamos que las biotintas dECM específicas del tejido son beneficiosas para promover la diferenciación de células madre y la proliferación10. En comparación con los polí.......
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Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el programa bio y tecnología médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) y "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisado por el IITP (Instituto de Planificación y Evaluación de Tecnologías de la Información y las Comunicaciones).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cabinas de seguridad biológica | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Congelador | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Agitador orbital digital | DAIHAN Scientific | DH. | |
| Horno seco | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Liofilizador | LABCONCO | 7670540 | |
| Nevera | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Rallador | ABM | 1415605793 | |
| Microscopios invertidos | Leica | DMi1 | |
| CRYSTE | PURISPIN 17R | ||
| Lector de microplacas | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrífuga | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Agitadores de placa calefactora múltiple | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR Medidor | |
| pH de sobremesa | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Reómetro | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Mezclador de vórtice | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scisjers | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materiales | |||
| Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL | Axygen | MCT-175-C | |
| vial de vidrio de 10 ml | Scilab | SL. VI1243 | |
| 40 y micro; colador de células m | Falcon | 352340 | |
| Vaso de precipitados de 5 L | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL tubo córneo | Falcon | 352070 | |
| 500 mL vaso de precipitados | Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL filtro de vacío con tapa de botella | Corning | 431118 | |
| contenedor de plástico de 500 mL | LOCK& LOCK | INL301 | |
| Placa de 96 pocillos | Falcon | 353072 | |
| Papel de aluminio | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Barra magnética | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortero y mortero | DAIHAN Scientific | SC. MG100 | |
| Pipeta multicanal | Eppendorf | 4982000314 | |
| Placa de Petri SPL | 10100 | ||
| Tiras indicadoras de pH | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Malla filtrante de tamiz | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Ácido peracético | Omegafarm | ||
| 70% etanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Agua | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Ensayo bioquímico | |||
| 1,9-Azul de dimetil-metileno cloruro de zinc doble sal | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Cloramina T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Sulfato de condroitina A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Ácido cítrico | Supelco | 46933 | |
| Cisteína-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Ácido acético glacial | Merok | 100063 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN QUÍMICOS | S2097 | |
| Papaína | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Ácido perclórico | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Acetato de sodio | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Hidróxido de sodio | Supelco | SX0607N | |
| Fosfato de sodio (monobásico) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Tolueno | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Biotinta | |||
| Caracterizada FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsina | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rosa de bengala | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medio | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| solución de Azul Trypan | Sigma-Aldrich | T8154 |
Referencias
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268(2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeu....
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Reimpresiones y permisos
