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Artículo de método

Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

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DOI:

10.3791/60455

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12 de diciembre de 2019

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1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

En este artículo

Resumen

Células neurales del tallo/progenitor exhiben varias dinámicas de expresión de los componentes de señalización de la muesca que conducen a diferentes resultados de los eventos celulares. Dicha expresión dinámica puede revelarse mediante monitoreo en tiempo real, no mediante análisis estáticos, utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible que permite la visualización de cambios rápidos en expresiones génicas.

Resumen

La señalización de muesca regula el mantenimiento de las células madre/progenitoras neuronales mediante interacciones células celulares. Los componentes de la señalización Notch exhiben expresión dinámica. El efector de señalización de muesca Hes1 y el ligando de muesca Delta-like1 (Dll1) se expresan de manera oscilatoria en células neurales del tallo/progenitor. Debido a que el período de la expresión oscilatoria de estos genes es muy corto (2 h), es difícil monitorear su expresión cíclica. Para examinar estos cambios rápidos en la expresión génica o la dinámica de proteínas, se requieren reporteros de respuesta rápida. Debido a su rápida cinética de maduración y alta sensibilidad, el reportero de bioluminiscencia luciferasa es adecuado para monitorear los cambios rápidos en la expresión génica en las células vivas. Usamos un reportero luciferasa desestabilizado para monitorear la actividad promotora y un reportero fusionado con luciferasa para la visualización de la dinámica de proteínas a una sola célula. Estos reporteros de bioluminiscencia muestran una rápida rotación y generan señales muy débiles; por lo tanto, hemos desarrollado un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible para detectar señales tan débiles. Estos métodos nos permiten monitorear varias dinámicas de expresión génica en células y tejidos vivos, que son información importante para ayudar a entender los estados celulares reales.

Introducción

El cerebro de los mamíferos se compone de un gran número de varios tipos de neuronas y células gliales. Todas las células se generan a partir de células neurales madre/progenitoras (NNP), que primero proliferan para expandir sus números, luego comienzan a diferenciarse en neuronas, y finalmente dan lugar a células gliales1,2,3,4,5. Una vez que las células se han diferenciado en neuronas, no pueden proliferar o aumentar su número, y, por lo tanto, el mantenimiento de los PNJ hasta etapas posteriores es importante. La señalización de muesca a través de interacciones célula-célula desempeña un papel importante en el mantenimiento de los PNJ6,7. Los ligandos de muesca interactúan con la proteína de membrana, Notch, en la superficie de las células vecinas y activa la proteína Notch. Después de la activación, se produce proteólisis de la proteína Notch, liberando así el dominio intracelular de Notch (NICD) de la membrana celular en el núcleo8,9,10. En el núcleo, NICD se une a las regiones promotoras de Hes1 y Hes5 (Hes1/5) y activa la expresión de estos genes. Hes1/5 reprime la expresión de los genes proneurales Ascl1 y Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Debido a que los genes proneurales inducen la diferenciación neuronal, Hes1/5 desempeña un papel esencial en el mantenimiento de los PNJ. Además, como los genes proneurales pueden activar la expresión del ligando Delatal como 1 (Dll1), Hes1/5 también reprime la expresión de Dll1. Por lo tanto, la expresión de Dll1 conduce a que las celdas vecinas sean negativas para Dll1 a través de la señalización Notch. De esta manera, las células inhiben que las células adyacentes sigan su mismo destino, un fenómeno conocido como inhibición lateral8. En el cerebro en desarrollo, la inhibición lateral juega un papel en la generación de varios tipos de células diferentes.

La imagen en tiempo real a nivel de celda única revela expresiones dinámicas de los componentes de la señalización Notch en NPC15,16,17. La señalización de muesca activa la expresión de Hes1,pero la proteína Hes1 se une a su propio promotor y reprime su propia expresión. Además, Hes1 es una proteína extremadamente inestable, que se degrada por la vía ubiquitina-proteasoma; por lo tanto, la represión de su propio promotor es sólo de corta duración y luego la transcripción comienza de nuevo. De esta manera, la expresión de Hes1 oscila tanto a nivel de transcripción como traslacional en un ciclo de 2 h18. La expresión oscilatoria de Hes1, a su vez, induce la expresión oscilatoria de los genes diana aguas abajo, como Ascl1, Neurog2 y Dll1, a través de la represión periódica15,16,17,19. Mientras que los genes proneurales pueden inducir la diferenciación neuronal, su expresión oscilatoria no es suficiente para la diferenciación neuronal; más bien su expresión sostenida es esencial para la diferenciación neuronal. La expresión oscilatoria de genes proneurales es importante para mantener los PNJ en lugar de inducir la diferenciación neuronal14,15,16. La expresión de Dll1 oscila tanto a nivel de transcripción como traslacional durante diversas morfogénesis, como la neurogénesis y la somitogénesis. La expresión dinámica de Dll1 es importante para la morfogénesis normal y la expresión constante de Dll1 induce defectos en la neurogénesis y la somitogénesis17. Estos hallazgos demuestran la importante función que la dinámica de la expresión génica y la cinética proteica tienen en la regulación de diversos eventos de desarrollo (es decir, diferentes dinámicas de expresión producen diferentes resultados en los comportamientos celulares).

Para analizar la dinámica de la señalización de la muesca, el análisis estático de los tejidos y las células es insuficiente porque están cambiando constantemente. La toma de imágenes en tiempo real de células individuales es una poderosa herramienta para revelar la dinámica en la expresión génica. La expresión dinámica de las moléculas de señalización de Notch sufre respuestas cíclicas rápidas en el período de 2-3 h. Esta rápida expresión periódica presenta dos problemas difíciles para el monitoreo en tiempo real: (1) la expresión de las moléculas se suprime a niveles bajos, y (2) la rotación rápida requiere reporteros de respuesta rápida. Para superar estos problemas, previamente desarrollamos un método de imagen en tiempo real de bioluminiscencia20. Debido a que el reportero de bioluminiscencia tiene una mayor sensibilidad y un tiempo de maduración más corto que los reporteros fluorescentes, esta estrategia nos permite monitorear la dinámica rápida en las células vivas. Usando la visualización en tiempo real, encontramos que más genes mostraban una expresión dinámica de lo que habíamos pensado anteriormente. Además, ha aumentado el número de informes que muestran la expresión y la dinámica de proteínas en las células vivas y la importancia de estas dinámicas en diversos eventos biológicos, lo que sugiere un papel fundamental de la dinámica en las expresiones génicas21,22.

En este informe, se describe una manera de visualizar la expresión del ligando de la muesca Dll1 en los NNJ tanto en cultivos disociados como en cultivos de sectores corticales. Para monitorear la dinámica de la transcripción de Dll1 a niveles de una sola célula, generamos cultivos disociados de PNJ derivados del telencéfalo embrionario de ratones transgénicos que transportaban a un reportero pDll1-Ub-Fluc, un reportero de luciferasa desestabilizado impulsado por el promotor de Dll1. Para monitorear la dinámica de proteínas Dll1 in vivo, introdujimos el reportero de fusión Dll1-Fluc en los PNJ en la corteza y visualizamos la expresión del reportero en los PNJ en cultivos de rebanadas corticales. Las imágenes en tiempo real nos permitieron capturar las diversas características de la expresión génica y la dinámica de proteínas en células vivas a alta resolución temporal.

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Protocolo

Todo el procedimiento, incluidos los sujetos de animales, ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto de Vida Fronteriza y Ciencias Médicas de la Universidad de Kioto.

1. Reporteros de bioluminiscencia

NOTA: El reportero de luciferasa es adecuado para medir la dinámica rápida de la actividad promotora mediante la fusión de la señal de degradación. Además, el reportero de fusión de luciferasa permite monitorear la dinámica proteica en una sola célula. Ambos tipos de reporteros están disponibles para el cultivo monocapa (cultivo de disociación) y el cultivo de tejidos (cultivo de rebanadas).

  1. Reportero de monitoreo de la actividad promotora de Dll117
    NOTA: Para monitorear los rápidos cambios en la expresión génica, el reportero de respuesta rápida e inestable es esencial. La luciferasa de luciérnaga (Fluc) muestra una rápida maduración en comparación con los reporteros de fluoresceína. Debido a que la ubiquitina fusionó el reportero de luciferasa (Ub-Fluc) muestra una rápida degradación y un rápido volumen de negocios, es muy útil monitorear la expresión génica dinámica en las células vivas20.
    1. Utilice el reportero deluciferase desestabilizado por el promotor Dll1, luciferasa ubiquitinada (pDll1-Ub-Fluc, Figura 1Un panel superior), para monitorear los cambios rápidos en la expresión de Dll1 a nivel de transcripción17.
    2. Generar una línea de ratón transgénica que lleve pDll1-Ub-Fluc para la expresión estable de este reportero.
  2. Reportero para el seguimiento de la dinámica de proteínas Dll117.
    1. Para la generación de ratones knock-in, inserte el ADNa de luciferasa en los 3 otermini de la región de codificación Dll1 para que se exprese la proteína de fusión Dll1-luciferasa (Reportero de Dll1-Fluc, Figura 1A,panel inferior)17.
    2. Supervise la dinámica de expresión de Dll1 a niveles de proteínas midiendo la actividad de la luciferasa.
    3. Para monitorear la dinámica de la proteína Dll1 a niveles de tejido, introduzca el reportero Dll1-Fluc en los PNJ en el telencéfalo embrionario por electroporación uterina.

2. Sistema de imágenes de bioluminiscencia

  1. Construya un sistema de imágenes en vivo de bioluminiscencia utilizando un microscopio invertido instalado con una cámara CCD refrigerada por agua de alta sensibilidad. Con el fin de reducir el ruido y obtener alta sensibilidad, enfríe la cámara con agua fría proporcionada por el circulador de agua a una temperatura optimizada de -90 oC.
  2. Para la toma de imágenes de células vivas/tejidos, instale el sistema de incubación, controlando la temperatura y el gas mezclado, en la etapa del microscopio.
  3. Para obtener imágenes de la expresión del reportero desestabilizado de luciferasa, utilice un ángulo numérico alto (NA: 1.30) lente objetivo de inmersión en aceite 40x. La distancia de trabajo de esta lente es de 0,2 mm, está disponible no sólo para el cultivo celular monocapa, sino también para el cultivo de rebanadas.
  4. Para la supervisión dual de la expresión del reportero de luciferasa y fluoresceína, instale el dispositivo de iluminación LED en la trayectoria de luz del microscopio.
  5. Controle las imágenes de lapso de tiempo con un software asociado con el microscopio (por ejemplo, el programa de adquisición multidimensional del software MetaMorph).
  6. Preparar todo el sistema en una habitación oscura, porque la señal del reportero luciferasa desestabilizado es muy débil, y para evitar la luz extraña evitar la adquisición.

3. Cultivos de disociación del tallo/progenitor neural (NPC)

  1. Preparación de medios de cultivo, platos y reactivos para la cultura de disociación del PNJ
    1. Preparar medios N2/B27 para el cultivo de células neurales del tallo/progenitor con una concentración final de 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetilcisteína, 10 ng/mL bFGF y 50 U/mL Penicilina/Streptomicina en medios DMEM/F12.
    2. Preparar la solución de papaína para la disociación que contiene 7 U/ml de papaína, 0.006% DNase y 1 mM N-acetilcisteína en medios EBSS.
    3. Prepare 100 mM de solución de luciferina sódica para la toma de imágenes de luminiscencia. Diluir 100 mM de solución de luciferina en medios N2/B27 a una concentración final de 1 mM.
      NOTA: Luciferin muestra autofluoresceína sí mismo. En el caso de la luciferasa-fluorescencia de imágenes duales, especialmente EGFP, reducir la concentración de luciferina a 0,5 mM es mejor.
    4. Recubrir un recipiente inferior de vidrio de 35 mm (diámetro de vidrio 27 mm) con 40 g/ml de solución de poli-L-lisina (PLL) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar las placas 3x con PBS y dejar que se seque.
  2. Disección de embriones y disociación de PNJ
    1. Después de eutanasia restar un ratón transgénico pDll1-Ub-luc embarazada (día embrionario 12.5 (E12.5)) por asfixia deCO2 y luxación cervical, cortar a través del abdomen y sacar el útero.
      NOTA: Los investigadores deben seguir las regulaciones y directrices del comité de investigación animal de su institución. Si se utilizan anestesia o analgésicos, úselos correctamente.
    2. Transfiera el útero en una placa Petri de 10 cm que contenga 25 ml de PBS helado. Sacar los embriones del útero en PBS helado, usando microtijeras y fórceps finos.
    3. Cortar la cabeza de cada embrión usando tijeras y transferirla a platos Petri de 10 cm que contengan DMEM/F12 helado. Retire la epidermis y el cartílago que rodean el cerebro y transfiera el cerebro a una placa Petri de 35 mm que contenga hielo frío de 3 ml de medios N2/B27.
    4. Cortar el telencéfalo derecho e izquierdo del diencéfalo(Figura 1Ba-f, C,D). Retire las meninges que cubren la superficie del telencéfalo utilizando fórceps finos(Figura 1Bi). Usando fórceps finos de nuevo, saque la parte dorso-lateral de la corteza del telencéfalo(Figura 1Bg,h,j-l E).
    5. Transfiera los tejidos a nuevos tubos de 1,5 ml con una pipeta P1000 y retire cualquier medio adicional con una pipeta P200. Añadir 0,1 ml de solución de papaína por tejido cerebral (un par de corteza). Después de 15 min de incubación a 24oC, pipetee suavemente las muestras 10 veces con la pipeta P1000. Incubar las muestras de nuevo durante 15 min a 24 oC.
    6. Pipetear suavemente las muestras 10 veces con la pipeta P1000. Centrifugar las muestras durante 3 min a 400 x g y temperatura ambiente (RT). Descarta el sobrenadante.
    7. Añadir 1 ml de medios DMEM/F12 al pellet. Pipetear suavemente 10 veces con pipeta P1000. Centrifugar las muestras durante 3 min a 400 x g y RT. Deseche el sobrenadante. Repita esto al menos 2 veces más.
    8. Al pellet, añadir 0,5 ml de medios N2/B27 que contengan 1 mM de luciferina y mezclar bien. Sembrar las células (1 x 106 células) a un plato inferior de vidrio recubierto de PLL. Cultivo de las células en la incubadora de CO2 durante 1 h. Una vez que las células se adhieran al plato, agregue 2 mL de medios N2/B27, que contengan 1 mM de luciferina.
  3. Visualización de la expresión del reportero luciferasa en la cultura de disociación del PNJ
    1. Inicie el sistema de imágenes en vivo de luminiscencia antes de realizar la disección. Para el cultivo de NPC, ajuste la temperatura de la incubadora de etapas a 37 oC y ajuste el ajuste de la mezcla de gas 20% O2, 5% CO2.
    2. Ponga el aceite de inmersión en la lente objetivo. Coloque la muestra en la etapa del microscopio. Vea el campo manualmente y elija la mejor posición y el foco de las celdas de interés. Haga clic en vivo para adquirir la imagen de prueba.
    3. Ejecute la adquisición de lapso de tiempo mediante adquisiciones de 2 dimensiones (luminiscencia y campo brillante) durante 24 horas con el programa de adquisición multidimensional. Seleccione El programa Adquisición multidimensional y establezca la configuración de adquisición de la siguiente manera (paso 3.3.6).
    4. Para la adquisición de imágenes luminiscencias, utilice los siguientes ajustes de cámara: velocidad de transferencia baja (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, tiempo de exposición de 10 min/5 min. Para la adquisición de imágenes de campo brillante, utilice los siguientes ajustes: velocidad de transferencia intermedia (1 MHz), 1 x 1 binning y tiempo de exposición de 100 ms.

4. En la electroporación utero

NOTA: Esto se realiza para la introducción del reportero Dll1-Fluc en las células progenitoras neuronales.

  1. Preparación de herramientas y reactivos para la electroporación
    1. Preparar micro capilares para la inyección de ADN en el ventrículo del telencéfalo embrionario. Estirar un capilar de hierba con calor y cortar y pulir la punta de la misma con la máquina de pulido.
    2. Preparar una mezcla de ADN con tinte (p. ej., azul Trypan). La concentración de cada ADN es de 1 g/l en PBS y añadir el tinte a una concentración final del 10%.
      NOTA: Utilice la mezcla de ADN para la visualización de la dinámica de proteínas Dll1 de la siguiente manera: Dll1-Fluc (Reportero de proteínaDll1, Figura 2E superior)y pEF-EGFP (EF promotor impulsado por vector de expresión EGFP, Figura 2E inferior), monitoreando la ubicación y morfología de las células transinfectadas.
    3. Preparar dos tipos de anestésicos: 3,88 mg/ml de pentobarbital y 0,12% de xilazina, en 1x PBS estéril.
    4. Utilice los instrumentos estériles y los guantes quirúrgicos durante el funcionamiento.
  2. Electroporación en el útero
    1. Anestetizar un ratón ICR embarazada en el tiempo (E12.5) por administración intraperitoneal de anestésicos con 500 ml de 3,88 mg/ml de pentobarbital y 500 ml de xilazina al 0,12%.
      NOTA: Los investigadores deben seguir la regulación de los experimentos con animales. Si uno necesita usar anestesia o medicamentos para aliviar el dolor, úselos correctamente.
    2. Corta el cabello y desinfecta la piel con exfoliación quirúrgica.
    3. Compruebe la falta de respuesta de pellizcar de dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo. Una vez que no se observe el reflejo del pedal, haga un corte de 2-3 cm a través del abdomen a lo largo de la línea media. Coloque las gasas alrededor de la parte diseccionada y moje las gasas con PBS caliente para no secar la incisión. Saque suavemente el cuerno uterino derecho con fórceps en forma de anillo y cuente el número de embriones.
    4. Inyectar 1-2 l del ADN mezclado en el ventrículo del telencéfalo de embriones suavemente con micro capilar.
      NOTA: Cuando la inyección es exitosa, se puede ver el color azul del tinte sobre la superficie del útero.
    5. Humedezca el útero y el electrodo antes de proporcionar los pulsos de voltaje, y luego sostenga suavemente la cabeza de un embrión. Ponga el electrodo cargado positivamente en el lado del hemisferio, en el que se inyectó el ADN. Asegúrese de que el estado del pulso de electroporación es de 30-50 V para 50 ms, el intervalo de los pulsos es de 1 s (50 ms de carga y 950 ms sin carga). Proporcione 5 pulsos a un embrión y compruebe que las burbujas se generan a partir del electrodo cargado negativamente.
      NOTA: Asegúrese de que la dirección del electrodo: el ADN se incorpora a las células en el lado del electrodo positivo. Durante este procedimiento, no mueva la posición del electrodo.
    6. Repita los pasos 4.2.3-4.2.4 para otros embriones y devuelva el cuerno uterino a la cavidad abdominal. Realizar el mismo procedimiento a los embriones en el cuerno uterino izquierdo.
    7. Después de volver a colocar el lado izquierdo, sutura la incisión por una sutura de seda (4-0) con una aguja (17 mm). Antes de cerrar completamente la incisión, coloque PBS caliente en la cavidad abdominal
      NOTA: El intervalo entre suturas es de alrededor de 2 mm.
    8. Después de terminar la cirugía, coloque el ratón en una almohadilla de calentamiento para la recuperación después de la anestesia. Casa el ratón individualmente.
      NOTA: Los investigadores deben seguir su regulación instiucional local de los experimentos con animales. Si uno necesita usar medicamentos para aliviar el dolor, úselos correctamente.

5. Preparación de cultivos de rebanadas de la corteza en desarrollo y visualización de la expresión de reportero luciferasa en las rebanadas corticales

  1. Preparación de medios de cultivo y reactivos para cultivos de rebanadas de la corteza
    1. Preparar medios enriquecidos para el cultivo de rodajas corticales que contengan un 5% de suero bovino fetal y un 5% de suero de caballo en medios N2/B27.
    2. Burbuja 100% O2 gas a través de medios DMEM / F12 para la disección y la fabricación de rodajas corticales.
      NOTA: Para utilizar el gas de oxígeno de forma segura, guarde el cilindro O2 en el gabinete del cilindro y supervise la concentración de oxígeno en el aire mediante un medidor de concentración de oxígeno.
    3. Diluir 100 mM de solución de sodio luciferina en medios enriquecidos a una concentración final de 1 mM.
      NOTA: Luciferin muestra autofluoresceína sí mismo. En el caso de la doble imagen luciferasa-fluorescencia, especialmente EGFP, menor concentración de luciferina (0,5 mM) es mejor.
    4. Fije la incubadora multigás a 37 oC por 40% O2 y 5% CO2.
  2. Disección de embriones y examen de la expresión de reportero fluorescente
    1. Después de eutanasia del ratón embarazada al que los reporteros (E13.5) son introducidos por electroporación utero (paso 4.2), cortar a través del abdomen y sacar el útero.
      NOTA: Los investigadores deben seguir la regulación de los experimentos con animales. Si usa anestesia o medicamentos para aliviar el dolor, úselos correctamente.
    2. Transfiera el útero a una placa Petri de 10 cm que contenga PBS. Sacar los embriones del útero en PBS, usando microtijeras y fórceps finos. Cortar la cabeza de cada embrión y transferir a una placa Petri de 10 cm que contiene medios DMEM/F12 burbujeados con 100% O2 gas. Retire la epidermis y el cartílago que rodean el cerebro en los medios DMEM/F12.
    3. Ponga el cerebro en la tapa de la placa Petri con fórceps en forma de anillo y coloque la tapa en la etapa del microscopio estereoscópico de fluorescencia. Compruebe la región de la corteza que expresa la proteína fluorescente bajo la luz de excitación(Figura 2A,B).
    4. Transfiera el cerebro a una tabla de corte de goma de silicona llena de 30 ml de medios DMEM/F12 burbujeados con 100% O2 de gas. Retire las meninges que cubren la superficie del telencéfalo por fórceps finos.
    5. Cortar el borde entre la parte medial y lateral del telencéfalo dorsal y separarense en dos hemisferios utilizando un cuchillo microquirúrgico o fórceps finos. Usando un cuchillo microquirúrgico, corta la corteza como rayas y haz rodajas corticales(Figura 2C,D). Rebanadas de pipeta con medio usando pipeta y transfiéralas a medios enriquecidos en un plato de 35 mm.
    6. Coloque las rodajas en las inserciones de cultivo en los platos de fondo de vidrio con medios enriquecidos. Corrija la dirección de las rodajas con fórceps finos. Configure la superficie de corte de las rodajas en la superficie de la plaquita de referencia. Retire el medio adicional con una pipeta. Incubar las rodajas en la incubadora multi-gas establecida en 40% O2 y 5% CO2 a 37oC durante 30 min.
    7. Añadir 300 l de medios enriquecidos que contengan 1 mM de luciferina al exterior del inserto de cultivo en el plato inferior de vidrio.
  3. Visualización de la expresión de reportero luciferasa en cultivos de sectores
    1. Inicie el sistema de imágenes en vivo de luminiscencia antes de iniciar la disección. Utilice la siguiente condición de cultivos de rodajas corticales: 40% O2, 5% CO2 y 37 oC.
    2. Ponga el aceite de inmersión en una lente objetivo 40x. Coloque el plato de muestra en la etapa del microscopio. Adquirir la imagen de prueba de fluorescente y establecer la posición y el plano de enfoque a la región de interés bajo la iluminación de la luz de excitación.
    3. Ejecutar la adquisición de lapso de tiempo por 3 adquisiciones dimensifiales (luminiscencia, fluorescencia y campo brillante) durante 24 h(Figura 2F-H). Para la adquisición de imágenes luminiscencias, utilice los siguientes ajustes de cámara: velocidad de transferencia baja (50 kHz), binning 2x2/4x4, tiempo de exposición de 10 min/5 min. Para la fluorescencia y la adquisición de imágenes de campo brillante, utilice los siguientes ajustes: velocidad de transferencia intermedia (1 MHz), binning 1x1 y tiempo de exposición de 100 ms.

6. Procesamiento y análisis de imágenes

  1. Conecte cada imagen y haga las imágenes de pila. Haga clic en Importar secuencia de imágenes en el menú Archivo (Archivo ? Importación de la lista de importaciones Secuencia de imágenes) y elija la carpeta donde se guardan las imágenes adquiridas. Ponga algunas palabras contenidas en el nombre de archivo en la columna de File name contains.
  2. Para eliminar el ruido de los rayos cósmicos en las imágenes de bioluminiscencia, aplique el plug-in SpikeNoise Filter de ImageJ/Fiji. Abra las imágenes de pila y haga clic en Filtro SpikeNoise.
  3. Aplique el plug-in Savitzky Golay Temporal Filter para obtener una dinámica clara de la expresión del reportero. Abra las imágenes de pila y haga clic en Filtro temporal Golay savitzky.
  4. Para medir la intensidad de la expresión del reportero, aplique el complemento Z Axis Profile Plus a cada celda. Seleccione las celdas y establezca los ROI, la región de interés y haga clic en Z Axis Profile Plus.

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Resultados

Las expresiones de los genes Hes1/7 exhiben ciclo de oscilación de 2 h en varias líneas celulares y durante la somitogénesis. Además, el período de oscilación es muy corto y tanto sus ARNm como sus proteínas son extremadamente inestables con la vida media de alrededor de 20 min. Si se utiliza un reportero de respuesta lenta, no podemos rastrear una dinámica tan rápida, y si se utiliza un reportero estable, se acumula gradualmente mientras la expresión génica oscila. Por lo tanto, el reportero debe ser rápidament...

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Discusión

Los componentes de la señalización Notch muestran expresiones oscilatorias en sincronía durante la somitogénesis pero fuera de sincronía durante la neurogénesis, lo que lleva a las dificultades para capturar la dinámica de expresión mediante análisis estático en este último caso. Por lo tanto, se requiere monitoreo en tiempo real para revelar la dinámica de expresión de los componentes de señalización Notch, como Hes1 y Dll1. Debido a que los períodos de las expresiones de las oscilaciones Hes1...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún interés financiero conflictivo.

Agradecimientos

Agradecemos a Yumiko Iwamoto por apoyar la producción del vídeo. También estamos agradecidos a Akihiro Isomura por la discusión y los apoyos del análisis de imágenes, Hitoshi Miyachi por apoyos técnicos para la generación de animales transgénicos, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) y Ouin Kunitaki (Andor Japan) para el apoyo técnico y las discusiones del sistema de imágenes de bioluminiscencia. Este trabajo fue apoyado por Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. y MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS) (JSPS 18K06254) (H.S.), Fundación Takeda (R.K. y H.S.), y Plataforma para Enfoques Dinámicos al Sistema Vivo del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sistema de imágenes de bioluminiscencia
agua enfriada (enfriador)JulaboModelo: F12-ED
Cámara CCD refrigeradaTecnología AndorModelo: iKon-M 934
Sistema de incubadoraTOKAI HITModelo: INU-ONICS
Microscopio invertidoOlympusModelo: IX81
Microscopio invertidoOlympusModelo: IX83
Dispositivo de iluminación LEDCoolLEDModelo: pE1
MetaMorphDISPOSITIVOS MOLECULARESModelo: 40000
Controlador de mezcla de gasesTokkenModelo: TK-MIGM OLO2
Lente objetivoOlympusModelo: UPLFLN 40X O
Preparativos para la disección
microscopio de disecciónNikon: SMZ-2B
Microscopio estereoscópico de fluorescenciaModelo Leica: MZ16FA
Pinzas finasDUMONTINOX No.5
> fuertes
Pinza
Placa de Petri de plástico de 10 cmGreiner664160-013
Placa de Petri de plástico de 35 mmGreiner627160
PBSNacalai Tesque14249-24
DMEM/F12invitrogen11039-021
Reactivos para NPC cultivo de disociación
B27 suplementoinvitrogen12587-010
bFGFinvitrogen13256-029Solución madre: 1 μ g/ml en 0,1% BSA/PBS
D-luciferinaNacalai Tesque01493-85Solución madre: 100mM en solución salina al 0,9%
DNasaWorthington Biochemical CorporationLK003172Solución madre: 1000U/ml en EBSS EBSS
Worthington Biochemical CorporationLK003188
Plato con fondo de vidrioIWAKI3910-035
Suplemento N2 (100x)invitrogen17502-048
N-acetil-cisteínaSigmaA-9165-25G
PapaínaWorthington Biochemical CorporationLK003178 Solución madre: 7U/ml en EBSS
Penicilina/StreptmycinaNacalai Tesque09367-34
Poly-L-lisinaSigmaP-628140 mg/ml en DW
Preparativos para la electroporación intrauterina
50 ml jeringaTERUMO181228T
ElectrodoNeppagene7 mm
ElectroporadorNeppageneCUY21 EDIT
Pinzas
de gasaKawamoto co.7161
Micro capilarHecho internamente
PBSNacalai Tesque14249-24
PentbarbitalKyoritsuseiyakuSomnopentyl
Pinzas
Tijeras, Micro tijeras
suturaAkiyama MEDICAL MFG. COF17-40B2
XilacinaBayerSeractal
Preparados para el cultivo de rebanadas
10 cm placa de Petri de plásticoGreiner664160-013
Placa de Petri de plástico de 35 mmGreiner627160
Inserto de cultivoMilliporePICM01250
DMEM/F12invitrogen11039-021
Suero fetal bovinoSigma172012-500ML
Pinzafina DUMONTINOX No.5
Pinza
Suero de caballoGibco16050-122
Micro bisturíAlconcalibre 19 V-Lance
Incubadora multigásPanasonicMedios MCO-5MUV-PJ
N2/B27 Hechoen casa. NPC disociatioin culture
PBSNacalai Tesque14249-24
Pinzas
Tijeras, Micro tijeras Tabla
caucho de siliconaHecho en casa
Circulador de Modelo en forma de anilloen forma de anillo Aguja de quirúrgico refen forma de anillo de cortar de

Referencias

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704(2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

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