Artículo de método
Células neurales del tallo/progenitor exhiben varias dinámicas de expresión de los componentes de señalización de la muesca que conducen a diferentes resultados de los eventos celulares. Dicha expresión dinámica puede revelarse mediante monitoreo en tiempo real, no mediante análisis estáticos, utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible que permite la visualización de cambios rápidos en expresiones génicas.
La señalización de muesca regula el mantenimiento de las células madre/progenitoras neuronales mediante interacciones células celulares. Los componentes de la señalización Notch exhiben expresión dinámica. El efector de señalización de muesca Hes1 y el ligando de muesca Delta-like1 (Dll1) se expresan de manera oscilatoria en células neurales del tallo/progenitor. Debido a que el período de la expresión oscilatoria de estos genes es muy corto (2 h), es difícil monitorear su expresión cíclica. Para examinar estos cambios rápidos en la expresión génica o la dinámica de proteínas, se requieren reporteros de respuesta rápida. Debido a su rápida cinética de maduración y alta sensibilidad, el reportero de bioluminiscencia luciferasa es adecuado para monitorear los cambios rápidos en la expresión génica en las células vivas. Usamos un reportero luciferasa desestabilizado para monitorear la actividad promotora y un reportero fusionado con luciferasa para la visualización de la dinámica de proteínas a una sola célula. Estos reporteros de bioluminiscencia muestran una rápida rotación y generan señales muy débiles; por lo tanto, hemos desarrollado un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible para detectar señales tan débiles. Estos métodos nos permiten monitorear varias dinámicas de expresión génica en células y tejidos vivos, que son información importante para ayudar a entender los estados celulares reales.
El cerebro de los mamíferos se compone de un gran número de varios tipos de neuronas y células gliales. Todas las células se generan a partir de células neurales madre/progenitoras (NNP), que primero proliferan para expandir sus números, luego comienzan a diferenciarse en neuronas, y finalmente dan lugar a células gliales1,2,3,4,5. Una vez que las células se han diferenciado en neuronas, no pueden proliferar o aumentar su número, y, por lo tanto, el mantenimiento de los PNJ hasta etapas posteriores es impor....
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Todo el procedimiento, incluidos los sujetos de animales, ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto de Vida Fronteriza y Ciencias Médicas de la Universidad de Kioto.
1. Reporteros de bioluminiscencia
NOTA: El reportero de luciferasa es adecuado para medir la dinámica rápida de la actividad promotora mediante la fusión de la señal de degradación. Además, el reportero de fusión de luciferasa permite monitorear la dinámica proteica en una sola célula. Ambos tipos de reporteros están disponibles para el cultivo monocapa (cultivo de disociación) y el cultivo de tejidos (cu....
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Las expresiones de los genes Hes1/7 exhiben ciclo de oscilación de 2 h en varias líneas celulares y durante la somitogénesis. Además, el período de oscilación es muy corto y tanto sus ARNm como sus proteínas son extremadamente inestables con la vida media de alrededor de 20 min. Si se utiliza un reportero de respuesta lenta, no podemos rastrear una dinámica tan rápida, y si se utiliza un reportero estable, se acumula gradualmente mientras la expresión génica oscila. Por lo tanto, el reportero debe ser rápidament.......
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Los componentes de la señalización Notch muestran expresiones oscilatorias en sincronía durante la somitogénesis pero fuera de sincronía durante la neurogénesis, lo que lleva a las dificultades para capturar la dinámica de expresión mediante análisis estático en este último caso. Por lo tanto, se requiere monitoreo en tiempo real para revelar la dinámica de expresión de los componentes de señalización Notch, como Hes1 y Dll1. Debido a que los períodos de las expresiones de las oscilaciones Hes1.......
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Los autores no tienen ningún interés financiero conflictivo.
Agradecemos a Yumiko Iwamoto por apoyar la producción del vídeo. También estamos agradecidos a Akihiro Isomura por la discusión y los apoyos del análisis de imágenes, Hitoshi Miyachi por apoyos técnicos para la generación de animales transgénicos, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) y Ouin Kunitaki (Andor Japan) para el apoyo técnico y las discusiones del sistema de imágenes de bioluminiscencia. Este trabajo fue apoyado por Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. y MEXT....
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de imágenes de bioluminiscencia | |||
| agua enfriada (enfriador) | Julabo | Modelo: F12-ED | |
| Cámara CCD refrigerada | Tecnología Andor | Modelo: iKon-M 934 | |
| Sistema de incubadora | TOKAI HIT | Modelo: INU-ONICS | |
| Microscopio invertido | Olympus | Modelo: IX81 | |
| Microscopio invertido | Olympus | Modelo: IX83 | |
| Dispositivo de iluminación LED | CoolLED | Modelo: pE1 | |
| MetaMorph | DISPOSITIVOS MOLECULARES | Modelo: 40000 | |
| Controlador de mezcla de gases | Tokken | Modelo: TK-MIGM OLO2 | |
| Lente objetivo | Olympus | Modelo: UPLFLN 40X O | |
| Preparativos para la disección | |||
| microscopio de disección | Nikon | : SMZ-2B | |
| Microscopio estereoscópico de fluorescencia | Modelo Leica | : MZ16FA | |
| Pinzas finas | DUMONT | INOX No.5 | |
| > fuertes | |||
| Pinza | |||
| Placa de Petri de plástico de 10 cm | Greiner | 664160-013 | |
| Placa de Petri de plástico de 35 mm | Greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reactivos para NPC cultivo de disociación | |||
| B27 suplemento | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Solución madre: 1 μ g/ml en 0,1% BSA/PBS |
| D-luciferina | Nacalai Tesque | 01493-85 | Solución madre: 100mM en solución salina al 0,9% |
| DNasa | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Solución madre: 1000U/ml en EBSS EBSS |
| Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | ||
| Plato con fondo de vidrio | IWAKI | 3910-035 | |
| Suplemento N2 (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetil-cisteína | Sigma | A-9165-25G | |
| Papaína | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 Solución madre: 7U/ml en EBSS | |
| Penicilina/Streptmycina | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lisina | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml en DW |
| Preparativos para la electroporación intrauterina | |||
| 50 ml jeringa | TERUMO | 181228T | |
| Electrodo | Neppagene | 7 mm | |
| Electroporador | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Pinzas | |||
| de gasa | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capilar | Hecho internamente | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Pinzas | |||
| Tijeras, Micro tijeras | |||
| sutura | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xilacina | Bayer | Seractal | |
| Preparados para el cultivo de rebanadas | |||
| 10 cm placa de Petri de plástico | Greiner | 664160-013 | |
| Placa de Petri de plástico de 35 mm | Greiner | 627160 | |
| Inserto de cultivo | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Suero fetal bovino | Sigma | 172012-500ML | |
| Pinza | fina DUMONT | INOX No.5 | |
| Pinza | |||
| Suero de caballo | Gibco | 16050-122 | |
| Micro bisturí | Alcon | calibre 19 V-Lance | |
| Incubadora multigás | Panasonic | Medios MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 Hecho | en casa | . NPC disociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pinzas | |||
| Tijeras, Micro tijeras Tabla | |||
| caucho de silicona | Hecho en casa |
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