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Artículo de método

Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato

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DOI:

10.3791/60466

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22 de febrero de 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University, 2Progenesis Technologies LLC, Robert C. Byrd Biotechnology Science Center, 3Department of Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos una condición de crecimiento para cultivar la pequeña variante de colonia de Pseudomonas aeruginosa. También describimos dos métodos separados para la detección y cuantificación del alginato de exopolisacárido producido por P. aeruginosa utilizando un ensayo tradicional de ácido urónico carbazol y un anticuerpo monoclonal específico de alginato (mAb) basado en ELISA.

Resumen

Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista, puede producir en exceso un alginato de exopolisacárido, lo que resulta en un fenotipo único llamado mucoidy. El alginato está relacionado con infecciones pulmonares crónicas que provocan un mal pronóstico en pacientes con fibrosis quística (CF). Comprender las vías que regulan la producción de alginato puede ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la formación de alginato. Otro fenotipo relacionado con la enfermedad es la variante de la pequeña colonia (SCV). El SCV se debe al lento crecimiento de bacterias y a menudo se asocia con una mayor resistencia a los antimicrobianos. En este artículo, primero mostramos un método de cultivo de una forma definida genéticamente de P. aeruginosa SCV debido a mutaciones en la biosíntesis de pirimidina. La suplementación de bases nitrogenadas, uracilo o citosina, devuelve el crecimiento normal a estos mutantes, demostrando la presencia de una vía de salvamento que barre las bases libres del medio ambiente. A continuación, analizamos dos métodos para la medición del alginato bacteriano. El primer método se basa en la hidrólisis del polisacárido a su monómero de ácido urónico seguido de derivatización con un reactivo cromogénico, el carbazol, mientras que el segundo método utiliza un ELISA basado en un mAb específico del alginato disponible comercialmente. Ambos métodos requieren una curva estándar para la cuantificación. También demostramos que el método inmunológico es específico para la cuantificación de alginato y puede utilizarse para la medición del alginato en las muestras clínicas.

Introducción

Las infecciones pulmonares crónicas con Pseudomonas aeruginosa son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística (CF). Durante la primera infancia, los pacientes son colonizados por múltiples patógenos bacterianos, incluyendo aislados no mucoides de P. aeruginosa1,2. La aparición de los aislados de la variante de la pequeña colonia (SCV), así como los aislados mucoides, es un marcador para el inicio de infecciones crónicas. Los aislados de SCV son altamente resistentes a los medicamentos3 debido a sus lentas tasas de crecimiento4, lo que los convierte en un grave elemento disuasorio en los regimientos de tratamiento y otras infecciones crónicas5 por P. aeruginosa. 6mostró un vínculo entre el SCV y la mucoimidicia vinculado por la biosíntesis de novo pirimidina. La inanidinación de pirimidina, debido a mutaciones en genes relacionados con la producción de pirimidina, dio lugar a fenotipo SCV en la cepa de referencia no mucoide PAO1 y el derivado mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).

A pesar de que la sobreproducción de alginato es un marcador de enfermedad importante para las infecciones pulmonares crónicas en la FQ, no está claro si existe una correlación directa entre la cantidad de alginato y la patología pulmonar, y no está claro si el alginato se puede utilizar como marcador de pronóstico para el tratamiento7. La producción de alginato está regulada principalmente por dos operons, un operon regulador (algUmucABCD)8,9 y el operon biosintético (algD operon)10,11. La producción de alginato está estrechamente regulada por el factor sigma AlgU9,12 (también conocido como AlgT) y la degradación del factor anti-sigma MucA13. La capacidad de monitorear la producción de alginato in situ a partir de las muestras de esputo de los pacientes puede ayudar en el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.

Aquí, describimos una condición de crecimiento que detecta la presencia de SCV causado por mutantes que no pueden sintetizar la pirimidina de novo. La suplementación de uracilo y/o citosina, la base nitrogenada de nucleótido de pirimidina, al medio activa la vía de salvamento, restaurando así el crecimiento normal en mutantes. Este método de crecimiento para estos mutantes específicos del SCV se puede utilizar como método de cribado para identificar mutaciones de pirimidina en muestras de pacientes. Además, discutimos dos métodos para la detección y medición de alginato producido y secretado por P. aeruginosa. El primero es el método tradicional14,15,16 de degradar el polisacárido utilizando una alta concentración de ácido y luego añadir un indicador colorimétrico para cuantificar la concentración en la muestra. El segundo método, desarrollado en nuestro laboratorio, utiliza el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-alginato (mAb) desarrollado por QED Biosciences. El método ELISA demuestra ser más específico y sensible que el ensayo de ácido urónico y permite un uso más seguro debido a la evitación del ácido sulfúrico altamente concentrado. Con la capacidad de la ELISA para ser utilizado directamente en muestras de esputo del paciente para medir el alginato, se puede desarrollar como una herramienta de diagnóstico de monitoreo para seguir la cantidad de alginato presente en los pulmones en diferentes períodos de la infección.

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Protocolo

1. Condiciones de crecimiento del SCV y activación fisiológica de la vía de salvamento

  1. Detección de SCV.
    1. Las cepas p. aeruginosa PAO1, PAO1pyrD,PAO581 y PAO581en placas de agar de aislamiento Pseudomonas (PIA) precalentadas y crecen a 37oC durante 48 h. En la placa de crecimiento identificar un aislado de colonia única que tiene el fenotipo SCV (tamaño de la colonia de 1 x 3 mm en comparación con el tamaño normal de la colonia de 3 x 5 mm).
    2. Repita el paso 1.1.1 para obtener un aislado puro del SCV.
      NOTA: El crecimiento puede requerir hasta 72 h debido a la lenta tasa de crecimiento de las colonias de SCV.
  2. Activación fisiológica de la vía de salvamento.
    1. Usando un bucle de inoculación estéril, escoja la colonia SCV de la placa PIA y la raya en un PIA precalentado complementado con 0,1 mM de uracilo. Cultivar la placa a 37oC durante 24 x 48 h.
      NOTA: Todas las placas PIA utilizadas en este protocolo contienen 20 ml/L de glicerol añadido a la mezcla antes del autoclave. Después de la autoclave y después de la temperatura de la mezcla es inferior a 55 oC añadir 11,21 mg/L de uracilo (0,1 mM) al medio líquido antes de verter las placas. Este método ayudaría a identificar mutaciones de pirimidina que causan fenotipo SCV en P. aeruginosa. Si el fenotipo SCV es el resultado de dicha mutación, entonces el crecimiento normal de la colonia y el tamaño (3 x 5 mm) se observarían en las placas PIA suplementadas con uracilo. Si las cepas tenían la capacidad de producir alginato, entonces el fenotipo mucoide también volverá sobre la suplementación de uracilo.

2. Ensayo de ácido urónico carbazol

  1. A partir de un cultivo puro de cepa deseada para ser probado, identificar una sola colonia. Usando un palillo de dientes estéril, escoja la colonia y coloque el palillo de dientes en un tubo de ensayo de cultivo que contenga 5 ml de caldo de aislamiento Pseudomonas (PIB). Crecer en una incubadora de coctelera a 37oC durante 24 h.
    NOTA: Las siguientes cepas PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA,PAO581carBy PAO581pyrD se cultivaron en placas PIA o placas PIA complementadas con uracilo de 0,1 mM para cosechar alginato para la medición.
  2. En una placa PIA precalentada añadir 150 l de caldo PIB cultivado (para placas de 15 mm x 100 mm) o 450 l de caldo (para placas de 15 mm x 150 mm). Usando un esparcidor de células estériles, esparza el caldo sobre el plato. Cultivar la placa a 37oC durante 24 h.
    NOTA: Aspirar cualquier exceso de líquido, si lo hay, de la placa usando un pipeta inclinando la placa hacia un lado. Las placas PIB y PIA utilizadas en el protocolo contienen 20 ml/L de glicerol para ser utilizados por las células como fuente de carbono para ayudar en la producción de alginato.
  3. Usando un controlador de pipeta y una pipeta estéril de 50 ml, agregue 0.85% NaCl al césped cultivado y recoja la muestra desguazando la placa usando un esparcidor de células. Aspirar la muestra usando un nuevo pipeta de 50 ml en un tubo de recogida de 50 ml. Vortex la muestra en alto para mezclar y colocar las muestras en hielo.
    NOTA: El volumen de NaCl añadido 0.85% varía dependiendo del tamaño de la placa. Para placas de 15 mm x 100 mm, utilice 10 x 30 ml y, para placas de 15 mm x 150 mm, utilice 20 x 50 ml.
  4. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600) de las muestras añadiendo 1 ml de la muestra a una cubeta desechable y leyendo el OD utilizando un espectrofotómetro. Repita este paso 2x para obtener un triplicado de lecturas para cada muestra.
  5. Añadir 3 ml de la solución de ácido sulfúrico/borato en tubos de cultivo y dejar sentarse en el hielo. Añadir 350 l de la muestra recogida lentamente a la mezcla ácida en los tubos de ensayo y vórtice en baja brevemente.
    1. Prepare el stock de borato añadiendo 10.099 g de hidróxido de potasio (KOH) en polvo a 45 ml de agua. Añadir 24,74 g de ácido bórico (H3BO3) a la mezcla y llevar el volumen a 100 ml.
    2. Colocar 1 L de botella en un fregadero con hielo y llenar la botella con 500 ml de ácido sulfúrico concentrado. Añadir LENTAMENTE 15 ml del stock de borato preparado. Deje que la botella se enfríe.
    3. Añadir otros 10 ml de stock de borato para un total de 25 ml. Una vez enfriada la botella, lleve el volumen a 1 L.
      ADVERTENCIA: Este método se basa en el uso de ácido sulfúrico altamente concentrado. Se debe utilizar un equipo de protección personal adecuado para garantizar la seguridad y el protocolo de eliminación adecuado de la muestra.
      NOTA: Para un control positivo, una concentración conocida ded ácido -manurónico y/o muestras de alginato bacteriano conocidas cosechadas y purificadas a través de cepas productoras de alginato de P. aeruginosa (por ejemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para un control negativo utilizar 0.85% NaCl solución y / o PAO1algD (Deleción en el marco del gen algD que hace que las bacterias completamente incapaces de producir alginato). Se pueden hacer varios tubos de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare 3 x 5 tubos de cada muestra.
  6. Añadir 100 l de carbazol al 0,1% de carbazol en solución de etanol a la mezcla ácido/muestra. Tapar el tubo y el vórtice en un ajuste medio durante 5 s. Colocar en un baño seco a 55oC durante 30 min.
  7. Después de la incubación, retire los tubos y el vórtice brevemente en alto y deje enfriar durante 5 min.
    NOTA: El color a ver sería un tono de púrpura. El color se mantendrá estable para la medición durante 1 x 2 h.
  8. Lea el OD530 de cada tubo añadiendo 1 ml de la mezcla a una cubeta limpia y leyendo la DoDe de las muestras a 530 nm en un espectrofotómetro. Utilice el tubo con 0.85% NaCl como blanco para el espectrofotómetro.
  9. Preparar una curva estándar midiendo laDoS 530 de las diluciones en serie de las concentraciones conocidas de ácido D-Manurónico (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml y 8 g/ml). Repita 2x. Extraiga una ecuación lineal de estas lecturas.
    NOTA: La curva estándar solo debe realizarse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.
    1. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.

3. ELISA para la cuantificación de alginatos

  1. Repita los pasos 2.1 a 2.4 para obtener muestras para la medición del alginato.
    NOTA: Las cepas utilizadas fueron PAO1, PAO1algDy PAO1 que llevaban pHERD20T-algU.
  2. Usando una micropipette añadir 50 l de la muestra recogida a una placa de 96 pocillos sin tratar. Añadir 50 l de tampón de recubrimiento (tamtón de carbonato/bicarbonato pH 9.6) a los pozos. Incubar la placa a 37oC durante 2 h.
    NOTA: Para un control positivo, se puede utilizar una concentración conocida de ácido D-manurónico y/o una cepa productora de alginato estable conocida (por ejemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para un uso de control negativo 0.85% NaCl solución y / o PAO1algD (deleción en el marco del gen algD hace que la bacteria completamente incapaz de producir cualquier alginato). Se pueden hacer varios pozos de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare 3 x 5 pozos de cada muestra.
  3. Usando una botella de chorro, lave los pozos de la placa 2veces con 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) con 0.05% Tween 20 (PBS-T) llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
  4. Usando una micropipette añadir 200 l de tampón de bloqueo (10% de leche descremada en PBS-T) a los pozos. Incubar a 4oC durante la noche.
    NOTA: Envuelva la placa en película de parafina o envoltorio para ayudar a evitar cualquier evaporación en el refrigerador.
  5. Usando una botella de chorro lavar los pozos de la placa 2x con PBS-T llenando los pozos, y luego escurrirlos volteando la placa.
  6. Usando una micropipeta añadir 100 s de anticuerpo primario diluido (anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón) a los pozos e incubar a 37 oC durante 1 x 2 h.
    NOTA: Se proporcionó anticuerpoprimario primario (anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón) a una concentración de 0,5 g/ml (dilución de 1:2.000 de 1 mg/ml) en solución diluyente de anticuerpos (1% de leche desnatada en 1x PBS).
  7. Usando una botella de chorro lave los pozos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
  8. Usando una micropipeta añadir 100 s de anticuerpo secundario diluido a los pozos e incubar a 37 oC durante 1 x 2 h.
    NOTA: El anticuerpo secundario utilizado fue el anticuerpo poliratón de cabra perforado a una concentración de 0,25 g/ml (dilución de 1:2.000 de 0,5 mg/ml) en la solución diluyente de anticuerpos.
  9. Usando una botella de chorro lave los pozos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
  10. Con un micropipeta, añadir 100 ml de solución de TMB-ELISA(Tabla de materiales)e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
    NOTA: El color de una reacción positiva sería un tono de azul.
  11. Con una micropipeta, añadir 100 ml de solución de parada (2 N de ácido sulfúrico).
    NOTA: El color cambiará de azul a amarillo cuando se agregue la solución de parada. El color es estable hasta 30 minutos después de detener la reacción.
  12. Usando un lector de placas, lea el OD a 450 nm.
  13. Producir una curva estándar midiendo la DoC450 de las diluciones en serie de las concentraciones conocidas de ácido D-Manurónico (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml y 8 g/ml). Repita 2x. De estas lecturas extraer una ecuación lineal.
    NOTA: La curva estándar solo debe realizarse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.
    1. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.

4. Análisis estadístico de la medición del alginato

  1. En una hoja de software gráfica, establezca una columna con la ecuación lineal derivada de la curva estándar. Establezca los resultados del eje Y como la concentración de alginato y los resultados del eje X como el OD530 para el ensayo de ácido urónico y oD450 para ELISA para obtener las concentraciones de alginato en cada muestra.
  2. Para normalizar la cantidad de alginato en cada muestra a la cantidad por 5,5 x 108 CFU/ml (1 OD600),divida la concentración de cada muestra obtenida anteriormente por su respectivo valor OD600. Si se midieron varios OD600 para cada muestra, divida por la media de600OD .
  3. Realizar análisis estadísticos utilizando el software estadístico preferido (por ejemplo, GraphPad Prism 7.02).
  4. Abra el software. Elija Columna en Nueva tabla y gráfico y elija el conjunto de datos ANOVA unidireccional.
  5. Asigne un nombre a cada columna con la cepa probada y agregue las concentraciones de alginato debajo.
  6. Después de introducir todos los datos, haga clic en Analizar en el menú superior. Esto abrirá una ventana de configuración de análisis. Elija los parámetros adecuados para las pruebas e indique si es necesario ejecutar varias comparaciones.
    NOTA: Después del análisis, el conjunto de datos contendrá un valor p que ayudaría a determinar la significancia estadística de los datos. Los datos se considerarían estadísticamente significativos si el valor p es menor que el valor establecido (normalmente se establece el valor de valor para p < 0.01).
  7. En la pestaña de gráfico, elija el tipo Degráfico de barras. Esto trazará automáticamente los datos con el título indicado de la hoja de datos de entrada. Indique la significancia estadística de los datos según sea necesario mostrando el símbolo * sobre las líneas conectivas entre las barras de interés.

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Resultados

La Figura 1 muestra las placas de PAO1 y PAO581 con o sin deleción en el marco en el gen de la pirretrosa (un gen en la vía de biosíntesis de pirimidina) que da como resultado el SCV6. El mutante PAO1 SCV fue restaurado al crecimiento normal en respuesta a la suplementación con uracilo(Figura 1A,B). Además, el mutante PAO581pyrDSCV fue devuelto a la mucoide con el mismo t...

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Discusión

Tanto el SCV como el alginato son marcadores importantes de la enfermedad implicados en varias infecciones crónicas. Por lo tanto, la capacidad de aumentar el SCV, así como estudiar la regulación y producción de alginato por P. aeruginosa es parte integral del descubrimiento de nuevos tratamientos para estas enfermedades crónicas.

Las cepas de SCV son notoriamente difíciles de cultivar debido a su tasa de crecimiento lento4 en comparación con otras cepas de

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Divulgaciones

El autor Hongwei D. Yu es el Director Científico y Cofundador de Progenesis Technologies, LLC.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ultra TMB-ELISA de 1 pasoThermo Scientific34028a través de Fisher Scientific
Etanol absoluto (200 pruebas)Fisher ScientificBP2818-4Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath LabnetNC0205808a través de Fisher
Scientific Placas de ensayo CoStar de 96 pocillos2021-12-20
Mesa de trabajo Vortex-Genie 2Industrias CientíficasG560
Productos de Investigación de Ácido BóricoCorporación Internacional.10043-35-3
Incubadora de armarioVWR1540
CarbazolSigmaC-5132
Tampón de carbonato-bicarbonatoSigmaC3041
Tubos de centrífuga (50 mL)Fisher Scientific05-539-13via Fisher
Scientific Tubos de ensayo para cultivosFisher Scientific14-956-6Dvia Fisher Cubeta Científica
de poliestireno (1,5 ml)Fisher Scientific14955127via Fisher Scientific
CytosineAcros Organics71-30-7
Bucles de inoculación desponiblesFisher Scientific22-363-597
Ácido D-Manurónico Sigma SódicoAldrichSMB00280
FMC AlginatoFMC2133
GlicerolFisher ScientificBP906-5para biología molecular
anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratónQED BiosciencesN/A Lote# :15725/15726
Polvo salino tamponado con fosfato (PBS)SigmaP3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRPAnticuerpo Thermo Scientific32230a través de Fisher Scientific
Hidróxido de potasioFisher Scientific1310-58-3a través
Fisher Scientific Prism 7GraphPad
Pseudomonas Agar de aislamiento (PIA)Difco292710a través de Fisher Scientific
Pseudomonas Caldo de aislamiento (PIB)Alpha BiosciencesP16-115a través de Fisher
Scientific Palillos de dientes redondosDiamanteCualquier marca
Alginato de algas marinas (Protanal CR 8133)FMC Corporation
Leche descremadaDifco232100a través de Fisher Scientific
SmartSpec Plus EspectrofotómetroBioRad170-2525o proveedor preferido
Cloruro de sodio (NaCl)SigmaS-5886
SpectraMax i3x Lector de microplacas multimodoMolecular Devicesi3xo proveedor preferido
Placa de Petri estéril de 100 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875713via Fisher Scientific
Ácido sulfúricoFisher ScientificA298-212
Ácido sulfúrico de grado técnico (2 soluciones normales de parada)R& D SystemsDY994
Tween 20SigmaP2287
UracilAcros Organics66-22-8
de

Referencias

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
  2. Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
  3. Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
  4. Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
  5. Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842(2018).
  6. Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
  7. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
  8. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
  9. Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
  10. Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
  11. Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
  12. Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
  13. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
  14. Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
  15. Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
  16. Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).

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