Aquí, describimos una condición de crecimiento para cultivar la pequeña variante de colonia de Pseudomonas aeruginosa. También describimos dos métodos separados para la detección y cuantificación del alginato de exopolisacárido producido por P. aeruginosa utilizando un ensayo tradicional de ácido urónico carbazol y un anticuerpo monoclonal específico de alginato (mAb) basado en ELISA.
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Artículo de método
Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato
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Resumen
Resumen
Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista, puede producir en exceso un alginato de exopolisacárido, lo que resulta en un fenotipo único llamado mucoidy. El alginato está relacionado con infecciones pulmonares crónicas que provocan un mal pronóstico en pacientes con fibrosis quística (CF). Comprender las vías que regulan la producción de alginato puede ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la formación de alginato. Otro fenotipo relacionado con la enfermedad es la variante de la pequeña colonia (SCV). El SCV se debe al lento crecimiento de bacterias y a menudo se asocia con una mayor resistencia a los antimicrobianos. En este artículo, primero mostramos un método de cultivo de una forma definida genéticamente de P. aeruginosa SCV debido a mutaciones en la biosíntesis de pirimidina. La suplementación de bases nitrogenadas, uracilo o citosina, devuelve el crecimiento normal a estos mutantes, demostrando la presencia de una vía de salvamento que barre las bases libres del medio ambiente. A continuación, analizamos dos métodos para la medición del alginato bacteriano. El primer método se basa en la hidrólisis del polisacárido a su monómero de ácido urónico seguido de derivatización con un reactivo cromogénico, el carbazol, mientras que el segundo método utiliza un ELISA basado en un mAb específico del alginato disponible comercialmente. Ambos métodos requieren una curva estándar para la cuantificación. También demostramos que el método inmunológico es específico para la cuantificación de alginato y puede utilizarse para la medición del alginato en las muestras clínicas.
Introducción
Las infecciones pulmonares crónicas con Pseudomonas aeruginosa son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística (CF). Durante la primera infancia, los pacientes son colonizados por múltiples patógenos bacterianos, incluyendo aislados no mucoides de P. aeruginosa1,2. La aparición de los aislados de la variante de la pequeña colonia (SCV), así como los aislados mucoides, es un marcador para el inicio de infecciones crónicas. Los aislados de SCV son altamente resistentes a los medicamentos3 debido a sus lentas tasas de crecim....
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Protocolo
1. Condiciones de crecimiento del SCV y activación fisiológica de la vía de salvamento
- Detección de SCV.
- Las cepas p. aeruginosa PAO1, PAO1pyrD,PAO581 y PAO581en placas de agar de aislamiento Pseudomonas (PIA) precalentadas y crecen a 37oC durante 48 h. En la placa de crecimiento identificar un aislado de colonia única que tiene el fenotipo SCV (tamaño de la colonia de 1 x 3 mm en comparación con el tamaño normal de la colonia de 3 x 5 mm).
- Repita el paso 1.1.1 para obtener un aislado puro del SCV.
NOTA: El crecimiento puede requerir hasta 72 h debido a la lenta tasa de crecimiento de las colonias de ....
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Resultados
La Figura 1 muestra las placas de PAO1 y PAO581 con o sin deleción en el marco en el gen de la pirretrosa (un gen en la vía de biosíntesis de pirimidina) que da como resultado el SCV6. El mutante PAO1 SCV fue restaurado al crecimiento normal en respuesta a la suplementación con uracilo(Figura 1A,B). Además, el mutante PAO581pyrDSCV fue devuelto a la mucoide con el mismo t.......
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Discusión
Tanto el SCV como el alginato son marcadores importantes de la enfermedad implicados en varias infecciones crónicas. Por lo tanto, la capacidad de aumentar el SCV, así como estudiar la regulación y producción de alginato por P. aeruginosa es parte integral del descubrimiento de nuevos tratamientos para estas enfermedades crónicas.
Las cepas de SCV son notoriamente difíciles de cultivar debido a su tasa de crecimiento lento4 en comparación con otras cepas de
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Divulgaciones
El autor Hongwei D. Yu es el Director Científico y Cofundador de Progenesis Technologies, LLC.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ultra TMB-ELISA de 1 paso | Thermo Scientific | 34028 | a través de Fisher Scientific |
| Etanol absoluto (200 pruebas) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath Labnet | NC0205808 | a través de Fisher | |
| Scientific Placas de ensayo CoStar de 96 pocillos | 2021-12-20 | ||
| Mesa de trabajo Vortex-Genie 2 | Industrias Científicas | G560 | |
| Productos de Investigación de Ácido Bórico | Corporación Internacional. | 10043-35-3 | |
| Incubadora de armario | VWR | 1540 | |
| Carbazol | Sigma | C-5132 | |
| Tampón de carbonato-bicarbonato | Sigma | C3041 | |
| Tubos de centrífuga (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher |
| Scientific Tubos de ensayo para cultivos | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Cubeta Científica |
| de poliestireno (1,5 ml) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Bucles de inoculación desponibles | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Ácido D-Manurónico Sigma Sódico | Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginato | FMC | 2133 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP906-5 | para biología molecular |
| anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón | QED Biosciences | N/A Lote | # :15725/15726 |
| Polvo salino tamponado con fosfato (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP | Anticuerpo Thermo Scientific | 32230 | a través de Fisher Scientific |
| Hidróxido de potasio | Fisher Scientific | 1310-58-3 | a través |
| Fisher Scientific Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Agar de aislamiento (PIA) | Difco | 292710 | a través de Fisher Scientific |
| Pseudomonas Caldo de aislamiento (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | a través de Fisher |
| Scientific Palillos de dientes redondos | Diamante | Cualquier marca | |
| Alginato de algas marinas (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Leche descremada | Difco | 232100 | a través de Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Espectrofotómetro | BioRad | 170-2525 | o proveedor preferido |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Lector de microplacas multimodo | Molecular Devices | i3x | o proveedor preferido |
| Placa de Petri estéril de 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Ácido sulfúrico | Fisher Scientific | A298-212 | |
| Ácido sulfúrico de grado técnico (2 soluciones normales de parada) | R& D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
Referencias
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J.
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Reimpresiones y permisos
