Una lesión de globo segmentario controlada por presión arterial carótida de rata con aplicación terapéutica periavential

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) siguen siendo la principal causa de muerte en todo el mundo^1. La aterosclerosis es la causa subyacente de la mayor parte de la morbilidad y mortalidad relacionadas con la ECV. La aterosclerosis es la acumulación de placa dentro de las arterias que resulta en un lumen estrechado, dificultando la perfusión adecuada de sangre a los órganos y tejidos distales^2. Las intervenciones clínicas para el tratamiento de la aterosclerosis grave incluyen angioplastia con o sin colocación de stent. Esta intervención consiste en avanzar un catéter de globo hacia el lugar de la placa, e inflar el globo para comprimir la placa a la pared arterial, ensanchando el área luminal. Este procedimiento daña la arteria, sin embargo, iniciando la respuesta a lesiones arteriales³. La activación prolongada de esta respuesta a lesiones conduce a la restenosis arterial, o rea estrechamiento, secundaria a la hiperplasia neointimal y la remodelación de los vasos. Durante la angioplastia, la capa intimal se denuda de células endoteliales que conducen al reclutamiento inmediato de plaquetas y a la inflamación local. La señalización local induce cambios fenotípicos en las células musculares lisas vasculares (VSMC) y fibroblastos adventitiales. Esto conduce a la migración y proliferación de VSMC y fibroblastos hacia adentro hacia el lumen, lo que conduce a la hiperplasia neointimal^4,5. Las células progenitoras circulantes y las células inmunes también contribuyen al volumen total de restenosis^6. En su caso, los stents que eluden fármacos (DES) son el estándar actual para inhibir la restenosis^7. Sin embargo, el DES inhibe la redotelización arterial, creando así un ambiente pro-trombótico que puede resultar en trombosis tardía en el stent^8. Por lo tanto, los modelos animales son integrales tanto para entender la fisiopatología de la restenosis, como para desarrollar mejores estrategias terapéuticas para prolongar la eficacia de los procedimientos de revascularización.

Varios modelos animales grandes y pequeños⁹ se utilizan para estudiar esta patología. Estos incluyen lesión de balón^3,10 o lesión de alambre¹¹ del lado luminal de una arteria, así como ligadura parcial¹² o colocación del manguito¹³ alrededor de la arteria. Tanto el balón como la lesión del alambre denudan la capa endotelial de la arteria, imitando lo que ocurre clínicamente después de la angioplastia. En particular, los modelos de lesiones por balón utilizan herramientas similares a las del entorno clínico (es decir, catéter de globo). La lesión del globo se realiza mejor en modelos de ratas, ya que las arterias de rata son de un tamaño adecuado para los catéteres de globo disponibles comercialmente. Aquí describimos una lesión arterial segmental controlada por presión, una versión bien establecida y modificada de la lesión del globo arterial carótido de rata. Este enfoque controlado por presión imita estrechamente el procedimiento de angioplastia clínica, y permite la formación reproducible de hiperplasia neointimal dos semanas después de la lesión^14,15. Además, esta lesión arterial controlada por presión resulta en una restauración completa de la capa endotelial 2 semanas después de la cirugía^16. Esto contrasta directamente con el modelo original de lesiones en globo, descrito por Clowes, donde la capa endotelial nunca vuelve a la cobertura completa^3.

Después de la cirugía, las terapias pueden aplicarse o dirigirse hacia la arteria lesionada a través de varios enfoques. El método descrito aquí utiliza la aplicación periavential de una molécula pequeña incrustada en una solución de gel plurónico. En concreto, aplicamos una solución de 100 μM de aldehído cinámico en gel Pluronic-F127 al 25% inmediatamente después de una lesión para inhibir la formación de hiperplasia neointimal^15. Pluronic-F127 es un gel termo reversible no tóxico capaz de suministrar medicamentos localmente de forma controlada^17. Mientras tanto, la lesión arterial es local, por lo tanto la administración local permite probar un principio activo mientras minimiza los efectos fuera del objetivo. Sin embargo, la entrega efectiva de un método terapéutico con este método dependerá de la química de la molécula pequeña o biológico utilizado.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

1. Procedimientos preoperatorios

1. Esterilizar instrumentos quirúrgicos. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Si realiza varias cirugías el mismo día, esterilizar instrumentos entre cirugías utilizando un esterilizador de cuentas secas.
2. Preparar terapéutico en gel Pluronic-127 al 25% (diluido en agua destilada estéril).
3. Coloque un catéter de globo Fogarty de 2F en el insuflador y coloque el extremo del globo del catéter en una jeringa de 1 ml llena de solución salina.
4. Induzca la anestesia colocando la rata en una cámara con un 5% de isoflurano.
   1. Retire la rata de la cámara y registre el peso de la rata. Use cortapelas para afeitarse el pelaje en la región ventral del cuello.
   2. Coloque la rata de nuevo en la cámara con un 5% de isoflurano para asegurar la inducción de anestesia.
5. Coloque la rata supina en una plataforma quirúrgica, insertando la cara en el cono nasal para que la cara de la rata esté hacia el cirujano.
   1. Reduzca la anestesia inhalacional al 1,5% de isoflurano. Verifique la profundidad de la anestesia mediante un reflejo de pellizcar los dedos del pie en los cuatro pies.
   2. Tape las cuatro patas hasta la plataforma quirúrgica.
6. Encienda la lámpara de calor.
7. Inyectar Atropina (0,01 mg/kg) subcutáneamente para reducir las secreciones de las vías respiratorias.
8. Inyectar carprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea para el control profiláctico del dolor. Si los antiinflamatorios no son aceptables para el experimento, consulte los pasos 3.2.2 y 3.2.3.
9. Aplique ungüento ocular lubricante en ambos ojos con un hisopo de algodón estéril para evitar que las córneas se sequen durante la cirugía.
10. Frotar el cuello tres veces en un movimiento circular alternando entre un 70% de alcohol etílico seguido de Betadine desde el centro de la región afeitada hacia afuera para esterilizar el sitio de la incisión.
11. Infiltrarse en la línea de incisión s.c. con 0.25% bupivacaína.
12. Ponte guantes quirúrgicos estériles antes de manipular instrumentos y suministros quirúrgicos estériles.
13. Poner todos los instrumentos quirúrgicos autoclavados en una hoja quirúrgica estéril.
14. Cortar tres hebras independientes de 1 pulgada de sutura estéril de 7-0 Prolene.
15. Coloque hisopos de algodón y gasa en la hoja quirúrgica.
16. Cubre a la rata con una lámina quirúrgica estéril que solo expone la región esterilizada del cuello.
17. Corte una abertura pequeña adicional en la hoja que expone parte del cono nasal. Este será el sitio para grabar el catéter del globo durante la lesión.

2. Procedimientos operativos

1. Durante todo el procedimiento quirúrgico, evalúe la profundidad de la anestesia mediante el seguimiento de la frecuencia respiratoria (la tasa debe ser consistente y considerada normal), así como pellizcar los dedos del pie cada 15 minutos. Si la frecuencia respiratoria aumenta o hay una respuesta a la pellizco del dedo del pie, entonces detenga la manipulación quirúrgica y aumente el isoflurano hasta un 2,5%.
2. Exponer la arteria carótida común (CCA).
   1. Haga una incisión superficial, recta y longitudinal del escote entre los huesos de la mandíbula de la rata. La incisión tendrá aproximadamente 1,5-2 cm de longitud.
   2. Haga una incisión a través del tejido conectivo debajo de la piel hasta que la capa muscular esté expuesta. Desplazar las glándulas salivales debajo de la piel para acceder al tejido muscular.
   3. Separe sin rodeos el tejido conectivo del músculo insertando tijeras cerradas entre la capa muscular y el tejido conectivo y abriendo suavemente la tijera mientras tira de la piel hacia arriba.
3. Diseccionar los dos músculos visibles (esternohiide y esternóstoide) longitudinalmente a lo largo del lado izquierdo de la tráquea hasta que se observa un tercer músculo (omohído) que corre perpendicular a los dos músculos superficiales.
4. Utilice fórceps para crear una ventana que separa este músculo perpendicular (omohído) del músculo longitudinal (estenohído) corriendo sobre la tráquea. Realice suavemente esta separación para evitar traumatismos contundentes en la tráquea.
5. Alcanza fórceps debajo del músculo perpendicular y corta para separar los dos músculos longitudinales y exponer el CCA.
6. Diseccionar el CCA.
   1. Diseccionar la CCA cerca de la bifurcación hasta que se expongan la arteria carótida interna (ICA) y la arteria carótida externa (ECA).
   2. Diseccionar la arteria tiroidea superior (STA), que se ramifica del TCE.
   3. Utilizando las suturas de proleno precortado, ligar el STA y el TCE cerca de su respectiva bifurcación. Deje la mayoría de la sutura a un lado del nudo y agarre cada sutura con una hemostat curva.
   4. Termina de diseccionar alrededor del ICA, alcanza fórceps debajo y alrededor del ICA, y usa una abrazadera vascular no aplastante para lograr el control distal. Sujete la arteria occipital junto con el ICA.
   5. Disecciona el CCA proximal a la bifurcación, asegurando separar el nervio vago de la CCA.
   6. Alcanza fórceps debajo y alrededor de la CCA y usa una abrazadera vascular no aplastante para lograr un control proximal. Coloque la abrazadera al menos 5 mm de la bifurcación.
7. Realice lesiones en el globo.
   1. Maniobrar los hemostats curvos que sostienen cada rama de arteria ligada para exponer la bifurcación entre el TCE y la rama superior.
   2. Disecciona suavemente el tejido en la bifurcación y luego hace una incisión de arteriotomía entre el TCE y la rama superior usando tijeras de microdisección.
   3. Use un hisopo de algodón para sacar toda la sangre de la CCA y limpiar el sitio de arteriotomía.
   4. Inserte el catéter de globo sin inflar a través de la arteriotomía y avance hacia la CCA hasta que el extremo proximal del globo haya pasado la bifurcación.
   5. Cinta catéter al cono nasal para que el globo no se escape de la arteria durante la inflación.
   6. Infla lentamente el balón a 5 atmósferas de presión y deja en la CCA durante 5 minutos para inducir lesiones arteriales. Asegúrese de que la presión se mantenga constante durante todo el 5 min.
   7. Después de 5 min, desinflar el globo y retirar suavemente de la CCA a través de la arteriotomía.
   8. Enjuague el CCA apretando suavemente la abrazadera en el CCA. No retire la abrazadera.
   9. Ligar el TCE proximal a la arteriotomía y luego retirar las abrazaderas de la CCA y el ICA para restaurar el flujo sanguíneo a través de la CCA al ICA. Asegúrese de que no haya sangrado visible alrededor de la arteriotomía y de que el CCA esté pulsando.
8. Aplicar 100 μL de vehículo de gel terapéutico o plurónico solo periaventialmente a lo largo de la CCA lesionada. Para ello, aplique 50 μL en el lado izquierdo de la CCA y, a continuación, 50 μL en el lado derecho de la CCA para garantizar el recubrimiento uniforme de la arteria lesionada.
9. Cierre el sitio de la herida.
   1. Corte el exceso de suturas de proleno.
   2. Cierre la herida usando capas de vicryl interrumpidas 4-0 o 6-0 a lo largo del tejido conectivo.
   3. Termina de cerrar la herida usando sutura de nylon 4-0 a lo largo de la piel.

3. Procedimientos postoperatorios

1. Coloque a la rata sola en una jaula limpia con la mitad de la jaula debajo de una lámpara de calefacción y monitoree hasta que la rata recupere suficiente conciencia para mantener la recumbencia severa. Mantenga a la rata en una jaula separada hasta que el animal esté completamente alerta y móvil antes de transferirla de vuelta a su jaula original.
2. Monitoree la rata diariamente durante los próximos tres días y luego tres veces por semana hasta la eutanasia. Eutanasia usando sobredosis de isoflurano seguida de toracotomía bilateral como se describe a continuación.
   1. Utilizar el Centro Nacional para el Refinamiento de Reemplazo y Reducción de Animales en La Investigación (NC3R) escala de mueca para identificar los niveles de dolor postoperatorio. Si algún animal parece estar experimentando dolor o desarrollar algún compromiso neurológico, transfiére inmediatamente.
   2. Para animales que no reciben carprofeno, administrar paracetamol 6 mg/ml en su agua potable 24 h antes de la cirugía a través de 48 h después de la cirugía. El paracetamol proporciona analgesia con efectos antiinflamatorios mínimos.
   3. Alternativamente, se pueden utilizar otras estrategias de analgesia con efectos antiinflamatorios mínimos, como la buprenorfina o la liberación prolongada de buprenorfina. Consulte al equipo veterinario de su institución.

4. Cosecha de tejidos e imágenes

1. Dos semanas después de la cirugía, eutanasia a la rata por sobredosis de anestesia (5% isoflurano). Alternativamente, eutanasiar ratas en un momento anterior para analizar los diversos aspectos de la respuesta a lesiones arteriales.
   1. Una vez que la respiración se detiene realizar la toracotomía bilateral como un método secundario de eutanasia.
2. Hacer una incisión lateral a través del abdomen, y luego cortar hacia arriba, a través del diafragma y las costillas, exponiendo la cavidad torácica.
3. Perfundir y arreglar las arterias.
   1. Inserte una cánula de 18 G unida a un sistema gravitacional de fijación de perfusión a través del ventrículo izquierdo. Mantenga una presión equivalente entre ratas marcando la altura del sistema de perfusión en relación con la sobremesa (elevación de 120 cm, equivalente a 91 ± 3 mmHg).
   2. Sujete la cánula junto con el ventrículo con una hemostat curva.
   3. Hacer un corte en el atrio derecho, abrir el circuito vascular, y comenzar la perfusión con PBS seguido de 2-4% paraformaldehído (alrededor de 250 mL cada uno).
   4. Preparar paraformaldehído diluido en PBS el día del sacrificio, o como mucho la noche antes del sacrificio. Si se prepara el día del sacrificio, asegúrese de que el paraformaldehído se haya enfriado a temperatura ambiente antes de comenzar la perfusión. Almacene paraformaldehído a 4 °C.
4. Después de la fijación, extraiga las arterias carótidas izquierda y derecha y guárdelas a 4 °C durante 2 h en 2-4% paraformaldehído.
5. Transfiera las arterias al 30% de sacarosa y almacene durante la noche a 4 °C.
6. Después de 16-24 h, incrustar las arterias en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y congelar bloques de arterias incrustadas en OCT.
   1. Acondicione las arterias en OCT a temperatura ambiente durante 10 minutos. Coloque la arteria paralela al plano del criomold lleno de OCT, marcando el lado de la criomold a la que se enfrenta la bifurcación arterial. Congelación de nitrógeno líquido.
   2. Almacene bloques congelados a largo plazo a -80 °C.
7. Sección bloques congelados usando un criostato.
   1. Recoger seis secciones transversales arteriales de 5 μm de espesor por diapositiva, con la diapositiva 1 a partir de la bifurcación.
   2. Sección bloques congelados hasta que la hiperplasia ya no sea visible (alrededor de 100 diapositivas).
8. La mancha de hematoxilina y eosina (H&E) se desliza¹⁸
   1. Encuentra el área de lesiones manchando uno de cada diez toboganes a lo largo de toda la arteria a partir de la bifurcación (por ejemplo, diapositivas 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100).
   2. Manchar diapositivas adicionales alrededor del sitio de las lesiones para encontrar el tobogán con oclusión máxima (por ejemplo, las diapositivas 20, 30 y 40 tenían hiperplasia visible, por lo que las diapositivas de manchas 15, 25, 35 y 45).
   3. Manchar y cuantificar el tobogán con oclusión máxima y deslizamientos equidistantes antes y después de la diapositiva de oclusión pico (por ejemplo, oclusión pico que se encuentra en la diapositiva 35, luego manchar y cuantificar diapositivas 25, 45, etc.) para un total de 3-10 diapositivas por rata.
9. Para imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz, almacene las arterias durante la noche a 4 °C después de la fijación en el paso 4.4.
   1. Arteria de sonda con dilución de 1:500 de anticuerpo primario anti-CD31 de conejo en diluyente (pH 7.4) durante 3 días. A continuación, contrarresta la arteria con 1:500 dilución del anticuerpo secundario Alexa Fluor 647 del antitulato durante 2 días^19.
   2. Borre la arteria con iDISCO+²⁰.
   3. Imagen de la arteria utilizando una lámina de luz microscopio de fluorescencia²¹. Renderice imágenes utilizando software (por ejemplo, Imaris)¹⁹.
10. Cuantificar la hiperplasia neointimal. Realice la cuantificación de forma cegada si es posible.
    1. Utilice el software ImageJ para trazar el perímetro de la intima, lamina elástica interna (IEL) y lamina elástica externa (ANGUILA) de una arteria en cada una de las diapositivas 3-10 determinadas anteriormente (paso 4.8.3).
    2. Cuantifique el área de cada región trazada en ImageJ y exporte estos valores. La traza intima produce el área de lúmenes, la traza IEL produce el área IEL, y la traza EEL produce el área EEL.
    3. Promedia los valores obtenidos de las diapositivas de 3-10 para obtener la lesión promedio (% oclusión, relación intima:media (I:M), hiperplasia neointimal) por arteria carótida de rata.
       Hiperplasia neointimal = área IEL - Área de Lumen
       
       

La Figura 1 muestra todos los materiales y herramientas quirúrgicas utilizadas para realizar esta cirugía. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de secciones transversales arteriales lesionadas de dos semanas permite una visualización clara de la hiperplasia neointimal. La Figura 2 muestra imágenes representativas de las secciones transversales arteriales manchadas de H&E de una arteria sana, herida y tratada. La Figura 2 también describe cómo cuantificar el nivel de hiperplasia neointimal en una arteria lesionada utilizando ImageJ, un software de procesamiento de imágenes ampliamente utilizado. Con este enfoque, se traza el perímetro de la neointima, así como la lámina elástica interna y externa para cuantificar las áreas respectivas. El método de lesión segmental controlado por presión que describimos da como resultado una relación entre 0,80 y media con una desviación estándar de 0,29 (2 cirujanos diferentes y n=11 ratas). Tratamiento con aplicación periavential de CA en Pluronic resulta en una inhibición de la hiperplasia neointimal, como hemos demostrado antes (61% reducción en la oclusión porcentual)15.

La Figura 3 proporciona una ilustración para crear una arteriotomía óptima en la bifurcación del TCE y sta. Por último, la Figura 4 muestra cómo la microscopía de fluorescencia de la hoja de luz se puede utilizar para visualizar toda la región de lesiones a lo largo de la longitud de la arteria. La tinción CD31 para visualizar las células endoteliales que recubren la capa intimal se puede realizar en arterias fijas. Las arterias se pueden incrustar en 1% de agarose y borrarse utilizando el método iDISCO+ para homogeneizar el índice refractar de la muestra20. A continuación, las arterias se pueden imaginar en un microscopio de fluorescencia de hoja de luz y las imágenes se pueden renderizar utilizando software para cuantificar la relación I:M. Con este enfoque, obtuvimos una relación I:M de 0,86, que está de acuerdo con los resultados de H&E.

Tabla 1. Número comúnmente utilizado de secciones transversales arteriales para el análisis de hiperplasia.

Figura 1. Instrumentos y herramientas quirúrgicas. En el orden en el sentido de las agujas del reloj que comienza en la esquina superior izquierda de la imagen: (A) Hisopos de algodón; (B) Solución betadina; (C) Gasa; (D) 70% solución de alcohol etílico; (E) jeringas de 1cc con aguja; (F) Atropina; (G) Retractores; clips de papel doblados utilizados aquí; (H) Rimadyl; (I) Abrazadera de micro-serrefina aplicando fórceps; (J) Soporte de aguja; (K) 4-0 sutura de nylon; (L) 4-0 vicryl suture; (M) Cortinas estériles; (N) Tijeras Mayo; (O) Fórceps estándar; (P) Fórceps curvados finos; (Q) Tijeras de microdisección; (R) Micro abrazaderas de serreferina; (S) Tijeras finas; (T) pines T; (U) Hemostats curvos; (V) Tres suturas de proleno de 7-0 cortadas a aproximadamente 1 pulgada; (W) 100 μL de gel plurónico-127 al 25%; (X) Ungüento ocular lubricante; (Y) 2 catéter francés de embolectomía de globos en solución salina estéril; (Z) Insuflador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Hematoxilina y Eosina (H&E) tinción y análisis de secciones transversales de arteria carótida de rata. (A) Sección transversal de la arteria carótida derecha sana y sin lesiones. IEL = Lamina elástica interna, ANGUILA = Lamina elástica externa. (B)Sección transversal de dos semanas lesionada arteria carótida izquierda tratada con vehículo Pluronic-F127. (C) Sección transversal de dos semanas lesionada arteria carótida izquierda tratada con aldehído cinámico de 100 μM. Barra de escala = 100 μm. (D) Esquema de seccionamiento de arterias congeladas para cuantificar lesiones. La diapositiva 1 comienza en la bifurcación y se toman seis secciones arteriales de 5 μm de ancho por diapositiva. El seccionamiento normalmente continúa deslizándose 70, ya que la lesión generalmente ocurre antes de esta diapositiva. (E) Sección transversal de la arteria carótida izquierda lesionada tratada con vehículo plurónico (B). La línea negra más interna traza la neointima y delinea la zona luminal. La línea amarilla media delinea el área de la lamina elástica interna, o tunica intima. La línea azul exterior delinea el área de la lámina elástica externa, o tunica adventitia. Barra de escala = 100 μm. (F) Cálculos utilizados para medir el porcentaje de oclusión del vaso y la relación intima:media (I:M) basada en mediciones obtenidas de (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Creación de arteriotomía. Ilustración de los pasos para crear una arteriotomía adecuada y evitar un tracto falso. CCA = Arteria Carótida Común, ECA = Arteria Carótida Externa, ICA = Arteria Carótida Interna, OA = Arteria Occipital, STA = Arteria Tiroidea Superior. Aísle la bifurcación entre las ramas ECA y STA. Disecciona esta bifurcación hasta que el área cambie a un color más brillante, lo que indica el adelgazamiento de la pared arterial y, a continuación, crea una arteriotomía con tijeras de microdisección. Levante la arteriotomía utilizando fórceps finos para ayudar en la inserción de globos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Microscopía de fluorescencia de lámina de luz para visualizar lesiones arteriales. Secciones transversales longitudinales a lo largo de la longitud de la arteria carótida común de una rata Sprague Dawley de 14 semanas de edad con una sección transversal representativa a continuación. Las arterias están teñidas con CD31 y encimeras con AF647. (A) Secciones transversales de la arteria carótida derecha sana y sin lesiones. Blanco = CD31, Verde = Lamina elástica, L = Lumen, Barra de escala = 200-500 μm. (B) Secciones transversales de la arteria carótida izquierda lesionada tratada con vehículo Pluronic-F127. Las puntas de flecha indican regiones de hiperplasia neointimal. (C) Relación entre la intimidad y los medios de comunicación (I:M) de la arteria carótida lesionada y lesionada, con el valor exacto indicado para cada grupo (n=1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no hay conflictos de interés con respecto a la publicación de este manuscrito.