Medición de microtúbulos dinámicos mediante microscopía de disco giratorio en husillos mitoticos Monopolar

Resumen

Aquí presentamos un método robusto y detallado de análisis de dinámica de microtúbulos en células sincronizadas en prometiafase utilizando microscopía confocal de disco giratorio de células vivas y procesamiento de imágenes basado en MATLAB.

Resumen

Describimos una modificación de un método establecido para determinar la dinámica de microtúbulos en células vivas. El protocolo se basa en la expresión de un marcador codificado genéticamente para los extremos positivos de los microtúbulos (EB3 etiquetado con proteína fluorescente tdTomato) y la imagen de células vivas de alta velocidad y alta resolución mediante microscopía confocal de disco giratorio. La sincronización del ciclo celular y el aumento de la densidad de los microtúbulos se logran mediante la inhibición de la separación centrosómica en células mitoticas, y el análisis del crecimiento se realiza utilizando el software U-Track de código abierto. El uso de una proteína fluorescente brillante y de cambio de rojo, en combinación con la menor potencia láser y el tiempo de exposición reducido necesario para la microscopía de disco giratorio reducen la fototoxicidad y la probabilidad de artefactos inducidos por la luz. Esto permite tomar imágenes de un mayor número de células en la misma preparación mientras se mantienen las células en un medio de crecimiento bajo condiciones de cultivo estándar. Debido a que el análisis se realiza de forma automática supervisada, los resultados son estadísticamente robustos y reproducibles.

Introducción

Los microtúbulos (MT) son estructuras altamente dinámicas que se encuentran en prácticamente todas las células eucariotas y en algunas bacterias^1. Junto con la actina y los filamentos intermedios, esculpen el citoesqueleto^2,3. División celular⁴, transporte de moléculas⁵, flagelante golpeando⁶, la sensación del entorno circundante a través del cilium primario⁷, audición (kinocilium)^8,9, embriogénesis^10,

Protocolo

1. Sembrado de células helancos

1. Preparar 2 ml de solución de fibronectina de 5 g/ml en solución salina tamponada de fosfato (PBS) y añadir 450 ml de ella en cada pocal de un cubreobjetos de 4 cámaras bien (#1.5). Incubar el tobogán durante 15 min a 37oC y 5%_CO2.
2. Enjuague las células de HeLa de crecimiento asíncrono con solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) e incubar con trippsina-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) durante 5 min a 37 oC. Detener la reacción enzimática mediante la adición de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio complementado con 10% suero de becerro fetal inactivado por calor (FCS) en 3:1 (v:v) relació....

Resultados

Siguiendo el protocolo dado descrito en la Figura 1A, el plásmido pEB3-tdTomato se expresó transitoriamente en células HeLa de crecimiento asíncrono. Las células se sincronizaron 48 horas después de la transfección en prometafase a través del tratamiento DME(Figura 1B). Este paso aseguró que la medición de la dinámica MT siempre se realizaba en la misma fase del ciclo celular. Las películas de lapso de tiempo se procesaron y analizaron con U-Track v2.2.0 como se.......

Discusión

Aquí, describimos una modificación de un método establecido por primera vez por Ertych et al.⁴⁴. Junto con varias otras modificaciones, combinamos esta técnica de análisis de dinámica MT con imágenes confocales de disco giratorio dual. El uso del disco giratorio dual mejora la resolución de los TM en crecimiento al tiempo que reduce la fototoxicidad^36. Reducimos aún más el fotoblanqueo y el daño inducido por la luz láser de las células cambiando a un reportero fluorescente .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dimetilenastron	Merck	324622
DMEM sin rojo fenol	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Suero fetal bovino	Biochrom	S0415
Fibronectina Plasma bovino	Merck	F4759	Polvo estéril
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Sustituto de glutamina estable
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomate	Addgene	plásmido #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Azul Trypan	Merck	T8154-20ML
Solución de tripsina/EDTA	Biochrom	L2143	0,05%/0,02 % sin calcio y magnesio
µ- portaobjetos	Ibidi	80426	portaobjetos de 4 pocillos con cubreobjetos #1.5
Microscopio invertido Eclipse Ti	Nikon	NA
			CFI Apo TIRF 100xC
Aceite ACAL Laser Excahnger	Nikon		. 405, 458, 488, 514, 561 y 647 nm
Módulo de disco giratorio	Andor	Cámara CSU-W
	Andor	Cámara ambiental iXon Ultra 888
Cámara Okolab		Dark equipada con suministro de CO2, control de temperatura y humidificador
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		. Software de adquisición
MATLAB	Mathworks		Entorno informático
Prism 8	GraphPad		Software de análisis estadístico y visualización

Objetivo Nikon MRD01991 Caja láser Microscopio de disco giratorio