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Artículo de método

Diseño de un Stent Traqueal De la Droga-Eluting Biocompatible en Ratones con Estenosis Laringotraqueal

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DOI:

10.3791/60483

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21 de enero de 2020

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1Department of General Surgery, University of California, San Francisco, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Johns Hopkins School of Medicine

En este artículo

Resumen

La estenosis laringotraqueal es el resultado de la deposición patológica de cicatrices que estrecha críticamente las vías respiratorias traqueales y carece de terapias médicas eficaces. Utilizando un stent PLLA-PCL (70% poli-L-lactide y 30% policaprolactone) como un sistema local de administración de fármacos, se pueden estudiar posibles terapias destinadas a disminuir la proliferación de cicatrices en la tráquea.

Resumen

La estenosis laringotraqueal (LTS) es un estrechamiento patológico de la subglotis y la tráquea que conduce a la obstrucción extratorácica y a una dificultad respiratoria significativa. LTS es el resultado de una lesión mucosa de un cuerpo extraño en la tráquea, que conduce a daño tisular y una respuesta inflamatoria local que va mal, lo que conduce a la deposición de tejido cicatricial patológico. El tratamiento para LTS es quirúrgico debido a la falta de terapias médicas eficaces. El propósito de este método es construir un stent biocompatible que se puede miniaturizar para colocar en ratones con LTS. Demostramos que una construcción PLLA-PCL (70% poli-L-lactide y 30% policaprolactona) tenía una resistencia biomecánica óptima, era biocompatible, factible para un stent de colocación in vivo y capaz de eludir el fármaco. Este método proporciona un sistema de administración de fármacos para probar varios agentes inmunomoduladores para inhibir localmente la inflamación y reducir la fibrosis de las vías respiratorias. La fabricación de los stents toma de 28 a 30 h y se puede reproducir fácilmente, lo que permite experimentos con grandes cohortes. Aquí incorporamos el fármaco rapamicina dentro del stent para probar su eficacia en la reducción de la fibrosis y la deposición de colágeno. Los resultados revelaron que las tiendas PLLA-PCL mostraron una liberación confiable de rapamicina, eran mecánicamente estables en condiciones fisiológicas y eran biocompatibles, induciendo poca respuesta inflamatoria en la tráquea. Además, los stents PLLA-PCL que eluyen la rapamicina redujeron la formación de cicatrices en la tráquea in vivo.

Introducción

La estenosis laringotraqueal (LTS) es un estrechamiento patológico de la tráquea más a menudo debido a una lesión iatrogénica después de la intubación. La combinación de la colonización bacteriana, la respuesta del cuerpo extraño a una traqueotomía o tubo endotraqueal, y los factores específicos del paciente conducen a una respuesta inflamatoria aberrante. Esta respuesta inmunitaria maladaptista conduce a la deposición de colágeno en la tráquea, lo que resulta en estrechamiento luminal de la tráquea y la estenosis posterior1,2. Como el tratamiento actual para esta enfermedad es principalmente quirúrgico, se ha estudiado el desarrollo de un paradigma de tratamiento alternativo basado en la medicina dirigido a las vías inflamatorias y profibroticas aberrantes que conducen a la deposición excesiva de colágeno. La rapamicina, que inhibe el complejo de señalización mTOR, ha demostrado tener efectos inmunosupresores, así como un efecto antifibroblasto robusto. Sin embargo, cuando se administra rapamicina sistémicamente, efectos secundarios comunes (por ejemplo, hiperlipidemia, anemia, trombocitopenia) pueden pronunciarse3. El propósito de nuestra metodología es desarrollar un vehículo para la administración local de drogas factible para su uso en las vías respiratorias que disminuiría estos efectos sistémicos. Nuestras evaluaciones se centran en investigar la respuesta inmune local a la construcción de administración de fármacos, así como su capacidad para inhibir la función de fibroblastos y alterar el microambiente inmune local. Los resultados específicos de la enfermedad incluyen pruebas in vivo que evalúan marcadores de fibrosis.

Los stents biodegradables para elución de fármacos se han utilizado en modelos animales de enfermedad en múltiples sistemas de órganos, incluidas las víasrespiratorias 4. Para el manejo de la estenosis o colapso de las vías respiratorias, investigaciones anteriores han utilizado silicona recubierta de drogas y stents a base de níquel5. Una construcción PLLA-PCL fue elegida para este método particular debido a su perfil de elución de fármacos y fuerza mecánica en condiciones fisiológicas durante un período de 3 semanas, que se ha demostrado en estudios publicados anteriores6. PLLA-PCL es también un material biocompatible y biodegradable ya aprobado por la FDA4. Se han estudiado stents biocompatibles que eluyen cisplatino y MMC en modelos animales grandes como conejos y perros. Sin embargo, en estos modelos animales, los stents no se colocaban en un modelo animal de enfermedad y se implantaban de forma transcervical. Este estudio proporciona un método único para evaluar un stent de elución de fármacos biocompatible colocado transoralmente en un modelo de ratón de lesión en las vías respiratorias y estenosis laringotraqueal. Un stent biocompatible que eluye un fármaco inmunomodulador localmente y puede ser miniaturizado para su estudio en un modelo murino es valioso para la investigación preclínica traslacional. Los intentos anteriores de utilización de stent con otras construcciones de material generaron respuestas robustas de cuerpos extraños que empeoran la inflamación subyacente que distingue LTS7. Esta metodología, hasta nuestro conocimiento, es la primera de su tipo en estudiar los efectos inmunomoduladores y antifibrométicos de un sistema de administración de fármacos basado en stent en un modelo murino de LTS. El modelo murino en sí ofrece varias ventajas para el estudio de los efectos de un fármaco inmunomodulador en la tráquea. Se pueden estudiar ratones modificados genéticamente y cohortes experimentales de ratones sanos y enfermos, lo que puede conducir a la reproducibilidad experimental y mejorar la rentabilidad. Además, la entrega del stent transoralmente en la tráquea del ratón imita la entrega clínica de tal stent en humanos, lo que pone de relieve aún más la ventaja traslacional de este método. Por último, la relativa facilidad con la que se puede producir el stent PLLA-PCL con el fármaco permite modificaciones para ofrecer terapias alternativas dirigidas a reducir la formación de cicatrices en la tráquea.

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Protocolo

NOTA: Todos los métodos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins (MO12M354).

1. Preparación de la rapamicina en PLLA-PCL

  1. Preparar dos viales de vidrio (con tapas) de soluciones de polímero PLLA-PCL 70:30 (viscosidad inherente 1.3 x 1.8 DL/G; Tabla de Materiales) soluciones, con un vial que contiene 1,0% de rapamicina y el otro sin rapamicina.
    1. Hacer una solución de polímero que contenga rapamicina al 1,0% añadiendo 6 mg de rapamicina a 600 mg de 70:30 PLLA-PCL en un vial de vidrio.
    2. Para la solución de polímero sin rapamicina (control), agregue sólo 600 mg de 70:30 PLLA-PCL al vial de vidrio.
  2. Bajo una campana de humos, añadir 6 ml de diclorometano a cada vial de vidrio.
    ADVERTENCIA: El diclorometano es un material corrosivo y sólo se deben utilizar pipetas de vidrio. Las precauciones de seguridad adecuadas incluyen protección personal para los ojos y guantes.
  3. Añadir 120 ml de glicerol a cada vial de vidrio (para una solución de glicerol del 2%).
    NOTA: La adición de glicerol permite una mayor flexibilidad y una mayor rigidez en la construcción del stent.
  4. Recapitule los viales de vidrio y permita que 70:30 PLLA-PCL con y sin rapamicina se disuelva y homogeneice durante 6 x 12 h.
    NOTA: Los viales de vidrio también se pueden colocar en una plataforma de agitación giratoria para una disolución más rápida.

2. Pruebas de elución de rapamicina

  1. Pipeta 1 ml de solución PLLA-PCL 70:30 que contiene 1% de rapamicina en un plato de Petri de vidrio.
    NOTA: Este volumen de la solución 70:30 PLLA-PCL que contiene 1% de rapamicina contendrá 120 g de rapamicina y representa la cantidad total de rapamicina en cada construcción. Se pueden utilizar volúmenes y concentraciones alternativos.
  2. Permita que 70:30 PLLA-PCL con 1% rapamicina se endurezca en un disco plano en el plato de vidrio Petri.
  3. Una vez endurecido, coloque el disco en 2 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7.4) e incubar en una cámara de 37 oC.
  4. Recoger y reemplazar PBS (2 ml) cada 24 h y utilizar PBS recogido para el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) del contenido de rapamicina.
  5. Utilice un muestreador automático y una columna HPLC C18 de 4,6 cm x 250 mm para ejecutar muestras a través del inyector de automuestrador junto con diluciones en serie de rapamicina para crear una curva estándar calibrada. Ejecute cada muestra en triplicado.
    NOTA: Las diluciones en serie de rapamicina que se probarán incluyen 10%, 1%, 0.1% y 0.01%.
  6. Utilice una fase móvil de agua de grado HPLC y acetonitrilo con volumen/volumen 10/90 con un caudal de 2,0 ml/min. Ajuste la absorbancia durante el HPLC para rapamicina a 280 nm.
    NOTA: La Figura 1 muestra la elución de rapamicina durante un período de 14 días.

3. Creación de stents de vías respiratorias de la urina PLLA-PCL de rapamicina

NOTA: Realice los pasos 3.2 a 3.9 utilizando materiales estériles y técnica estéril para evitar la contaminación que influiría en aplicaciones in vivo e in vitro.

  1. Prepare las soluciones PLLA-PCL que contengan rapamicina como se describe en la sección 1.
  2. Usando una pipeta Pasteur de vidrio con un globo de goma, aplique 1 ml de solución PLLA-PCL que contenga 1% de rapamicina en la cánula venosa de un angiocatéter a base de etileno a base de fluorado de 22 G(Tabla de materiales). Sostenga el angiocatéter en una mano y utilice la pipeta de vidrio para soltar la solución PLLA-PCL en el angiocatéter. Gire lentamente el angiocatéter para asegurar una cobertura homogénea del angiocatéter con la solución PLLA-PCL.
    NOTA: Al principio, la solución PLLA-PCL será delgada, pero a medida que el diclorometano se evapora durante la aplicación en el angiocatéter, la solución se volverá más viscosa para moldear sobre el angiocatéter. Girar continuamente el angiocatéter durante la aplicación es beneficioso. Este paso debe hacerse lenta y meticulosamente para asegurar el grosor constante del stent.
  3. Prop el angiocatéter moldeado con la punta del angiocatéter mirando hacia abajo y la empuñadura en el borde de una placa de vidrio Petri para el secado.
  4. Deje que los stents se sequen durante 24 horas en una campana de vacío a temperatura ambiente(Figura 2A).
  5. Retire la construcción del stent del angiocatéter subyacente girando suavemente el catéter subyacente y deslizándolo fuera del stent moldeado(Figura 2B).
  6. Compruebe el stent circunferencialmente en busca de defectos que puedan haber resultado durante el proceso de fundición. Si hay un defecto en el stent fundido, deséchelo.
  7. Recorte cada extremo del stent fundido con tijeras rectas finas para que los bordes sean axiales.
  8. Usando tijeras rectas finas, corte segmentos axiales de 3 mm del stent fundido para su uso en un modelo de ratón de LTS(Figura 2C).
    NOTA: Aproximadamente 8 stents se pueden hacer de un angiocatéter fundido, con cada stent de 3 mm que contiene 120 g de rapamicina.
  9. Cargue el stent de 3 mm en un nuevo catéter venoso de 22 para su uso en un modelo de ratón de LTS(Figura 1).

4. Inducción de estenosis laringotraqueal en ratones

  1. Antes de realizar estudios in vivo sobre ratones, obtenga la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales.
  2. Anestetizar un macho de 9 semanas de edad C57BL/6 mediante la inyección intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg).
    NOTA: Se pueden sustituir otras cepas de ratones, pero se recomienda que el peso de los ratones esté entre 20 y 27 g.
  3. Aleatorizar ratones en un grupo experimental (lesión quimiomecánica con una colocación de un 1% de stent PLLA-PCL que contiene rapamicina) y dos grupos de control: 1) lesión quimiomecánica con la colocación de un stent PLLA-PCL, 2) lesión quimiomecánica sin el colocación de un stent.
  4. Coloque un ratón sobre una plataforma quirúrgica en una posición supina. Utilice un pequeño bucle de hilo fijado en la parte superior de la plataforma para extender la columna cervical mediante el bucle alrededor de los incisivos centrales.
  5. Fije las manos y las piernas del ratón a la mesa usando trozos de cinta de 2 pulgadas. Pellizca la pata del ratón para asegurarse de que ha tenido anestesia adecuada.
  6. A continuación, se premata el sitio quirúrgico. Se debe retirar el pelaje que cubre y limpiar la piel (alternar el exfoliante de yodo o clorhexidina con alcohol o desinfectante de piel diluida) tres veces. El área debe estar cubierta y se deben usar guantes estériles. Los instrumentos esterilizados deben colocarse sobre una superficie estéril cuando no estén en uso.
  7. Haga una incisión vertical de línea media de 1,5 cm en el cuello del ratón utilizando tijeras de iris curvadas finas. Divide el timo que se recubre y detalla los dos lóbulos resultantes para visualizar la tráquea. Divida los músculos de escopioide y esternotiroideo (trampa) en el accesorio superior bilateralmente.
    NOTA: Todo el complejo laringotraqueal debe estar completamente expuesto después de esto.
  8. Pasar un angiocatéter de 22 G transoralmente a través de la laringe a la tráquea. Utilice pequeños fórceps para aplicar presión a la laringe anterior del ratón para ayudar en la colocación correcta del angiocatéter. Visualice el angiocatéter blanco a través de la tráquea para asegurar una colocación correcta (no esofágica).
    NOTA: La tráquea del ratón es extremadamente delgada y el angiocatéter blanco se visualizará a través de la tráquea translúcida.
  9. Pase un cepillo de alambre recubierto de bleomicina a través del angiocatéter insertado.
  10. Retire lentamente el angiocatéter para que sólo quede el cepillo de alambre en la tráquea.
  11. Aplique la contrapresión usando fórceps finos en la tráquea para interrumpir mecánicamente el lumen traqueal con el cepillo de alambre.
  12. Vuelva a insertar el angiocatéter en la tráquea sobre el cepillo de alambre.
  13. Retire el cepillo de alambre y vuelva a aplicar la bleomicina.
  14. Repita los pasos 4.8 a 4.12 un total de 5x. Aplique bleomicina al cepillo entre cada aplicación.
    NOTA: La validación y descripción de este modelo se puede encontrar en Hillel et al.8.
  15. Retire el angiocatéter de la tráquea del ratón.
    NOTA: Si no se va a colocar ningún stent, la incisión se puede cerrar con pegamento tisular.

5. Colocación de stent PLLA-PCL transoral en ratones

  1. Cargue un stent fundido de 3 mm en un angiocatéter 22 G vacío(Figura 3A).
    NOTA: El stent debe descansar a 5 mm de la punta del angiocatéter.
  2. Dibuja una delgada línea vertical negra en el stent fundido de 3 mm.
    NOTA: Esta línea permite una mejor visualización del stent en la tráquea.
  3. Intubar transoralmente el ratón con el angiocatéter que ha sido precargado con el stent.
  4. Visualizar el stent en el angiocatéter en la tráquea a través de la incisión transcervical(Figura 3B).
    NOTA: La tráquea es muy delgada, lo que permite visualizar el tinte negro en el stent a través de la tráquea. Utilícelo para confirmar la correcta colocación traqueal.
  5. Sostenga el stent en su lugar agarrando la tráquea a través de la incisión transcervical con fórceps finos.
  6. Retire el angiocatéter transoralmente mientras mantiene un agarre en el stent con los fórceps finos.
    NOTA: Es extremadamente importante no aplicar demasiada fuerza al stent para no aplastar el lumen cuando se retira el angiocatéter. Sin embargo, se requiere suficiente fuerza para asegurar se requiere que el stent no se retire con el angiocatéter. Se puede utilizar un sialendoscopio de 0,8 mm para visualizar la ubicación y la colocación del stent en la tráquea.
  7. Cierre la incisión transcervical con pegamento tisular.
  8. Permita que cada ratón se recupere a su nivel de actividad original antes de colocarlo de nuevo en su jaula.

6. Preparación histológica de muestras

  1. Anestesiar ratones con anestésicos inhalados y sacrificar ratones con luxación cervical por protocolo animal después de 7, 14 o 21 días.
    NOTA: En función de la cronicidad del estudio, se pueden utilizar diferentes intervalos de tiempo (por ejemplo, 28, 30 días, etc.).
  2. Coloque un ratón en la plataforma quirúrgica como se describe en los pasos 4.4 y 4.5.
  3. Vuelva a abrir la incisión del cuello en el ratón utilizando tijeras de iris curvadas finas.
  4. Exponga la tráquea por paso 4.6.
  5. Divida la tráquea distal por debajo del nivel del stent utilizando tijeras de iris curvadas finas.
  6. Divida la tráquea proximal por debajo de la laringe y por encima del stent utilizando tijeras de iris curvadas finas.
    NOTA: Es importante dividir primero la tráquea distal para evitar que la tráquea se retraiga en el tórax.
  7. Separe la tráquea dividida del esófago posteriormente y retire la tráquea del ratón.
    NOTA: Los stents se conservarán dentro de la tráquea del ratón.
  8. Retire el stent de la tráquea y fije en 10% de formalina durante 24 h.
  9. Incruste muestras de tráquea de ratón fija sin foricina en parafina con el extremo distal orientado superiormente para que los cortes axiales de la tráquea se puedan hacer en el siguiente paso.
  10. Corta 5 secciones de la tráquea de ratón incrustada en parafina usando un microtome.
    NOTA: Los especímenes deben cortarse axialmente a partir de la tráquea distal.
  11. Obtenga una sección representativa de 5 m cada 250 m a lo largo de la longitud de la muestra.
  12. Completa la mancha de H&E en cada sección representativa.
    1. Deparaffinizar las diapositivas colocando en xileno 2x por diapositiva durante 3 min.
    2. Coloque los portaobjetos en etanol 100% durante 2 min, 95% etanol durante 2 min y 70% etanol durante 2 min para rehidratar.
    3. Lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 2 minutos.
    4. Mancha las diapositivas en hematoxilina durante 3 x 5 min.
    5. Lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 5 min.
    6. Coloque los portaobjetos en 1% de alcohol ácido durante 1 min.
    7. Lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 1 min.
    8. Enjuagar en 0,2% de agua de amoníaco durante 30 s.
    9. Enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 5 min.
    10. Mancha de eosina colocando diapositiva en la efloxina de eosina durante 30 s.
    11. Deshidratar los portaobjetos colocando 95% etanol durante 5 min, seguido de etanol absoluto 2x durante 5 min.
    12. Colocar en xileno 2x durante 5 min.
    13. Monte las correderas con medio de montaje basado en xileno.
  13. Mida el grosor de la lámina propria como se describe en Hillel et al.8.

7. Biocompatibilidad de stent in vivo

  1. Prepare las secciones de tejido como en los pasos 6.1 a 6.4. No retire el stent de estas secciones traqueales para visualizar los cambios en la inflamación en relación con la ubicación del stent dentro del lumen de la tráquea.
    1. Para determinar la respuesta aguda del cuerpo extraño al stent, observe la actividad de los macrófagos y las células T utilizando marcadores CD3 y F4/80.
      NOTA: Otros marcadores también se pueden utilizar para determinar la reacción inflamatoria aguda al stent.
    2. Obtener secciones cortadas de 5 m de la tráquea incrustada en parafina en diapositivas hidrófilas más disponibles en el mismo(Tabla de materiales). Coloque dos secciones en cada diapositiva.
      NOTA: Estas secciones deben ser de un área de la tráquea donde se colocó el stent PLLA-PCL.
  2. Coloque las diapositivas en xileno 2x durante 5 min cada una.
  3. Coloque los portaobjetos en 100% etanol 2x durante 3 min cada uno.
  4. Coloque los portaobjetos en etanol al 95% durante 1 min.
  5. Coloque los portaobjetos en un estante de tinción histológica para que se sumerjan en el tampón de recuperación de antígenos(Tabla de materiales)y luego colóquelos en un vapor de verduras con agua hirviendo durante 20 minutos.
  6. Retire los estantes de tinción del vapor y deseche el búfer de recuperación de antígenos.
  7. Reemplace el búfer por 1 ml de PBS.
  8. Coloque los portaobjetos en una caja de tinción húmeda durante 1 min.
  9. Deseche el PBS e incubar los toboganes con el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco con un 10% de FBS durante 30 min.
  10. Deseche el DMEM y agregue una mezcla de dos anticuerpos primarios criados en diferentes especies. Cubrir los portaobjetos con película de parafina e incubar durante la noche a 4 oC en una habitación oscura.
    NOTA: En este protocolo se utilizaron conejo anti-CD3 y rata anti-F4/80(Tabla de Materiales).
  11. Lave los portaobjetos en PBS 3x durante 5 min.
  12. Incubar los portaobjetos con anticuerpos secundarios específicos de las especies de anticuerpos primarios(Tabla de Materiales)diluidos en DMEM con 10% DE FBS para 0,5 x 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
  13. Lave los portaobjetos en PBS 3x durante 5 min en la oscuridad.
  14. Monte los portaobjetos en los cubreobjetos con una gota de medio de montaje con 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Almacene los portaobjetos en la oscuridad a 20 oC o 4 oC.
  15. Observe las diapositivas manchadas en un microscopio confocal de escaneo láser y fotografíe.
  16. Cuantifique el número total de células que se tiñen con DAPI y los anticuerpos de interés para compararlos con la tráquea no lesionada.

8. Análisis cuantitativo de la expresión génica de la tráquea de ratón

  1. Recoja la tráquea del ratón como se describe en los pasos 6.1 a 6.7 y retire el stent.
    NOTA: Las tráqueas de ratón cosechadas se pueden almacenar en un congelador de -80 oC durante un máximo de 2 años.
  2. Desiccar el tejido traqueal cosechado en el paso 8.1 utilizando tijeras finas y homogeneizar aún más utilizando un homogeneizador de molino de cuentas con perlas cerámicas de 1,4 mm(Tabla de materiales)como parte de un kit de extracción de ARN basado en columnas disponible comercialmente (Tabla de materiales).
    NOTA: Ajustes del homogeneizador del molino de perlas a un ciclo de 40 s a 6 m/s.
  3. Extraiga el ARN del lisado traqueal utilizando un kit de extracción y purificación a base de columnas(Tabla de materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Cuantifique el ARN de cada muestra utilizando un espectrofotómetro(Tabla de materiales).
    NOTA: La pureza del ARN se evalúa utilizando la relación 260/230 nm con una lectura de muestra de ARN puro 2.0.
  5. Crear ADN complementario a partir del ARN extraído utilizando la transcriptasa inversa(Tabla de Materiales)y un termociclador con los siguientes ajustes: 5 min a 25 oC (cebado), 46 oC durante 30 min (transcripción inversa) y luego 95 oC durante 1 min (inactivación de la transcripción inversa).
  6. Diluir muestras de ADN complementarias con agua libre de RNase a una concentración de 10 a 25 ng/ml para su uso en PCR cuantitativo en tiempo real.
  7. Mezclar 1 l del ADN complementario (10 x 25 ng/ml) con 10 l de una mezcla maestra de PCR(Tabla de materiales),8 ml de ddH2O y 0,5 ml de imprimaciones delanteras y inversas de 10 oM para el gen de interés en un pozo de una placa pcR de 96pocillos (Tabla de materiales).
    NOTA: El volumen total en cada pozo debe ser de 20 l. Cada pocto de la placa de pozo 96 debe contener solo una muestra y un gen de interés.
  8. Repita los pasos 8.1–8.7 para todos los genes de interés y ejecute cada muestra para cada gen en triplicado.
    NOTA: Las imprimaciones delanteras y inversas específicas del gen(Tabla de materiales)para el colágeno 1, el colágeno 3 y el gen de referencia-actina se utilizan comúnmente para investigar marcadores de fibrosis.
  9. Coloque la placa de 96 pocillos en la máquina de PCR cuantitativa en tiempo real e inicie el siguiente protocolo: desnaturalización a 95 oC durante 15 s y anular y extienda a 60 oC durante 60 s durante 40 ciclos.
  10. Normalizar el valor umbral del ciclo (TC) para la detección de productos genéticos de cada gen de interés (GOI) al valor de TC para el gen de referencia -actina para todas las muestras para obtener un CT para cada GOI. A continuación, compare los valores de CT para cada GOI para las muestras tratadas y no tratadas para generar un CT.
    NOTA: El umbral de ciclo es el punto en la curva de amplificación cuando hay una cantidad predeterminada de producto genético ('Rn'). El valor de Rn para cada reacción debe determinarse para cada gen de interés y debe caer en la parte lineal de la curva de amplificación.
    NOTA: CT - CT (GOI) – CT (gen de referencia); • CT - CT (tratado) – CT (sin tratar).
  11. Calcule el cambio relativo en la expresión génica entre muestras tratadas y no tratadas como expresión de cambio de pliegue calculando 2.

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Resultados

La construcción biodegradable de stent PLLA-PCL cargada de rapamicina utilizada en este estudio fue capaz de eludir la rapamicina de una manera consistente y predecible en condiciones fisiológicas(Figura 1). La Figura 2 muestra el stent PLLA-PCL fundido alrededor de un angiocatéter de 22 G para su uso en un modelo murino de LTS. Para determinar si los efectos de la elución de rapamicina en la tráquea son eficaces en la atenuación de la fibrosis, los cambios medi...

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Discusión

Los pasos más críticos para construir y usar con éxito un stent de elución de drogas in vivo son 1) determinar la relación PLLA-PCL óptima para la tasa de elución de fármacos deseable, 2) determinar la concentración adecuada de fármaco a eluir, 3) moldear los stents alrededor del angiocatéter para uso in vivo, y 4) entrega transoralmente el stent en los ratones después de la inducción LTS sin causar obstrucción fatal de las vías respiratorias.

Si bien existen varios métodos para la administrac...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Instituto Nacional sobre la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio 1K23DC014082 y 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Este estudio también fue apoyado financieramente por la Sociedad Tríológica y el Colegio Americano de Cirujanos (Alexander Hillel), la American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) y una beca de capacitación T32 NIDCD (Kevin Motz).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1. Para stent
angiocatéter de calibre 22Jelco4050
DiclorometanoSigma Aldrich270997-100ML
GlicerolFisher Scientific56-81-5Disponible también en otros proveedores.
PDLGASigma Aldrich739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)Evonik Industries AG65053
RapamicinaLC LaboratoriesR-5000
2. Cirugía animal
alambreMill-Rose Company320101
3. Para tinción inmunohistoquímica
Abcamab93678También disponible en otros proveedores; se necesita pH ácido
DAPICell Signaling8961S
DMEMThermoFisher Scientific11965-092También disponible en otros proveedores.
FBS (Suero fetal bovino)MilliporeSigmaF4135-500ML
Anticuerpo anti-conejo-488de cabra Tecnología Lifa11008
Anticuerpo anti-rata-633de cabra Tecnología Lifa21094
Hidrofílico más diapositivaBSB7028
PBSThermoFisher Scientific100-10023También disponible en otros proveedores.
Anticuerpo anti-CD3 para conejosAbcamab5690
Anticuerpo antiF4/80 para ratasBiolengend123101
Zeiss LSM 510 Meta Microscopio ConfocalZeiss
4. Para PCR
de 0,5 mmOMNI International19-645
Bead Mill HomoginizerOMNI International
Gene Specific Forward/Reverse PrimersGenomic Resources Core Facility
Espectrofotómetro Nanodrop 2000Thermo Scientific
Power SYBR Verde MastermixLife Technologies4367659
RNeasy mini kitQiagen80404
StepOnePlus Sistema de PCR en tiempo realLife Technologies
Cepillo de

Referencias

  1. Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
  2. Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
  3. Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
  4. Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14(2017).
  5. Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
  6. Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
  7. Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
  8. Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
  9. Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
  10. Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
  11. Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10(2015).
  12. Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).

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