Describimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.
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Artículo de método
Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell
En este artículo
Resumen
Resumen
La matriz extracelular (ECM) desempeña un papel central en la regulación de la homeostasis tisular, participando en la conversación cruzada con las células y regulando múltiples aspectos de la función celular. El ECM desempeña un papel particularmente importante en la función del tejido adiposo en la obesidad, y las alteraciones en la deposición y composición del ECM del tejido adiposo se asocian con enfermedades metabólicas en ratones y humanos. Los modelos in vitro tractables que permiten la disección de las funciones del ECM y las células para contribuir al fenotipo tisular global son escasos. Describimos un novedoso modelo 3D in vitro del cultivo humano ECM-adipocyte que permite estudiar las funciones específicas del ECM y los adipocitos en la regulación del fenotipo metabólico del tejido adiposo. El tejido adiposo humano se descelulariza para aislar la ECM, que posteriormente se repobla con preadipocitos que luego se diferencian dentro del ECM en adipocitos maduros. Este método crea construcciones ECM-adipocitos que son metabólicamente activas y retienen características de los tejidos y pacientes de los que se derivan. Hemos utilizado este sistema para demostrar la conversación cruzada ECM-adipocyte específica de la enfermedad en el tejido adiposo humano. Este modelo de cultivo proporciona una herramienta para disección de las funciones de la ECM y los adipocitos en la contribución al fenotipo metabólico del tejido adiposo global y permite el estudio del papel del ECM en la regulación de la homeostasis del tejido adiposo.
Introducción
La matriz extracelular (ECM) no sólo proporciona un andamio mecánico para los tejidos, sino que también se involucra en una compleja conversación cruzada con las células que residen dentro de ella, regulando diversos procesos necesarios para la homeostasis tisular, incluida la proliferación celular, diferenciación, señalización y metabolismo1. Mientras que el ECM sano desempeña un papel esencial el mantenimiento de la función normal del tejido, ECM disfuncional se ha implicado en múltiples enfermedades2.
El tejido adiposo desempeña un papel importante en la patogénesis de la enfermedad metaból....
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Protocolo
Los tejidos adiposos se obtienen de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica electiva bajo la aprobación de la junta de revisión institucional.
1. Aislamiento de preadipocitos y preparación de reactivos de cultivo
- Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS). Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.
- Preparar la colagenasa tipo II: 2 mg/ml en 2% de BSA en 1x PBS. Prepárese inmediatamente antes de usar.
- Preparar red blood cell (RBC) Lysing Solution: 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodium EDTA in deionized EDTA (DI/H2O). Conser....
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Resultados
La preparación de ECM de tejido adiposo, la sembración con preadipocitos y la diferenciación in vitro en adipocitos maduros dan lugar a claros cambios morfológicos secuenciales en el tejido que permiten la evaluación visual del progreso a lo largo del protocolo(Figura 1) . Los preadipocitos utilizados para la semilla del ECM se aíslan mediante la digestión de la colagenasa de muestras de IVA separadas(Figura 2). La microscopía el.......
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Discusión
El modelo de cultivo de ECM-adipocitos proporciona una herramienta valiosa para disección de las funciones individuales de ECM y células en dictar fenotipo de tejido final. El protocolo de aislamiento ECM es bastante reproducible, pero se puede observar la variabilidad en el proceso de descelularización. El paso de deslipidación del Día 3 es un punto crítico en el protocolo. Al finalizar la extracción durante la noche, la solución de disolvente polar debe evidenciar la deslipidación de la matriz que se vuelve amarilla, m.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses contradictorios.
Agradecimientos
Agradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa y Retha Geiss por su ayuda en la coordinación del estudio. SeM fue realizado por University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este proyecto fue apoyado por niH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) Administración de Veteranos VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopía electrónica de escaneo realizada por la Universidad de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Resear....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25 % de tripsina-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU | Cat#25200056 | |
| Tubo criovial de 1,5 | mL Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#02-682-557 | |
| 10% Formalina tamponada neutra | VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU | Cat#89370-094 | |
| 100 µ m filtro de malla de nylon | Corning Inc., Corning, NY, EE. UU | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucosa | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. | UU. Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironina sal de sodio (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#T6397 | |
| Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos | VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU | Cat#10861-700 | |
| 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#I5879 | |
| Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos | VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU. | Cat#10861-666 | |
| Solución antibiótica-antimicótica (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU | Cat#15240062 | |
| Biotina | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#B4639 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU | Cat#A8806 | |
| Tampón RLT | Qiagen, Hilden, Alemania | Cat#79216 | |
| Ciglitizona | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#C3974 | |
| Desoxi-D-glucosa, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU | Cat#NET328A250UC | |
| Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino, tipo II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#D4513 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#D4902 | |
| Dimetilsulfóxido Fisher | Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#BP231 | Inflamable, cáustico |
| EDTA disódico | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#BP118 | |
| Sal hemicálcica de ácido D-pantoténico | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#21210 | |
| Dulbecco' s Medio Eagle modificado: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., Rey de Prusia, PA, EE. UU | Cat#DSP-MD.43 | células EVE inflamables |
| , NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU. | Cat#10027-446 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU. | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehído | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU. | Cat#G5882 | |
| Hexametildisalizana | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#440191 | inflamable y cáustica |
| Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#I9278 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU. | Cat#A415 | |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU | Cat#I5627 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. San Luis, MO, EE. UU. | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. San Luis, MO, EE. UU. | Cat#P5655 | |
| Lipasa de páncreas porcino, tipo VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. San Luis, MO, EE. UU. | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#A661 | |
| Corte óptimo temperatura (OCT) compuesto | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Reino Unido | Aceite de AGR1180 | |
| # Solución Red-O (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU | Cat#O1391 | |
| American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, EE. UU. | Cat#KTORO-G | ||
| Tetróxido de osmio | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#201030 | Cáustico |
| Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#93482 | |
| Solución salina tamponada con fosfato cáustico (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#SH3025601 | |
| Ribonucleasa A del páncreas bovino, tipo III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibroso Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Alemania | Cat#74704 | |
| Fluido de centelleo | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#SX18 | |
| Contador de centelleo Tijeras | |||
| , pinzas, estéril | |||
| Tampón de fosfato de Sorensen | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| Matraz de cultivo T-150 | VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU. | Cat#10062-864 | |
| Mezcla maestra de expresión génica TaqMan | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU | Cat#4369016 | |
| Agitador | |||
| controlada Homogeneizador de tejidos, BeadBug Homogeneizador de microtubos | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrina | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU. | Cat#T3309 | |
| Kit de determinación de triglicéridos | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU | Cat#TR0100 | |
| Tinción azul de tripano, 0,4 % | VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU | Cat#10027-446 | |
| Colagenasa tipo II | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU | Cat#17101015 | |
| Papel de filtro Whatman Reeve Angel, Grado 201, 150 mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU | Cat#WHA5201150 |
Referencias
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P.
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Reimpresiones y permisos
