Method Article

Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las bacterias intracelulares secretan factores de virulencia llamados proteínas efectoras en el citosol huésped que actúan para subvertir las proteínas huésped y/o sus vías biológicas asociadas en beneficio de la bacteria. La identificación de proteínas efectoras bacterianas putativas se ha vuelto más manejable debido a los avances en la secuenciación del genoma bacteriano y la llegada de algoritmos que permiten en silico la identificación de genes que codifican candidatos a la secreción y/o eucariotas Dominios. Sin embargo, la identificación de estos importantes factores de virulencia es sólo un paso inicial. Naturalmente, el objetivo es determinar la función molecular de las proteínas efectoras y dilucidar cómo interactúan con el huésped. En los últimos años, técnicas como la pantalla dos híbridas de levadura y las inmunoprecipitaciones a gran escala, junto con la espectrometría de masas, han ayudado a identificar interacciones proteína-proteína. Aunque la identificación de un socio de unión huésped es el primer paso crucial para dilucidar la función molecular de una proteína efector bacteriana, a veces se encuentra que la proteína huésped tiene múltiples funciones biológicas (por ejemplo, actina, clathrin, tubulina), o la proteína bacteriana puede no unir físicamente las proteínas huésped, privando al investigador de información crucial sobre la vía exacta del huésped que se está manipulando. Se ha adaptado una pantalla de toxicidad por levadura modificada junto con una pantalla supresora para identificar las vías del huésped afectadas por las proteínas efectoras bacterianas. La pantalla de toxicidad se basa en un efecto tóxico en la levadura causado por la proteína efectora que interfiere con las vías biológicas del huésped, que a menudo se manifiesta como un defecto de crecimiento. La expresión de una biblioteca genómica de levadura se utiliza para identificar factores de huésped que suprimen la toxicidad de la proteína efectora bacteriana y así identificar proteínas en la vía a la que se dirige la proteína efector. Este protocolo contiene instrucciones detalladas tanto para las pantallas de toxicidad como para las pantallas supresoras. Estas técnicas se pueden realizar en cualquier laboratorio capaz de clonación molecular y cultivo de levadura y Escherichia coli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El primer informe de procedimientos similares a los aquí presentados caracterizó al efector de la Legionella pneumophila tipo IV SidD, una deAMPylase que modifica Rab11. Se utilizaron técnicas comparables para la caracterización de varios efectores L. pneumophila 1,2,3. El ensayo fue adaptado para caracterizar una proteína efectora Coxiella burnetii tipo IV4,y recientemente la utilidad de esta técnica se amplió para la caracterización de las proteínas de membrana de inclusión de Chlamydia trachomatis 5 .

Este protocolo se puede dividir en dos partes principales: 1) la pantalla de toxicidad de la levadura, en la que la proteína del efector bacteriano de interés se expresa en la levadura y los clones se examinan para detectar un fenotipo tóxico como lo demuestra un defecto de crecimiento, y 2) la pantalla supresora de levadura , en el que el fenotipo tóxico se suprime mediante la expresión de una biblioteca genómica de levadura en la cepa tóxica. Por lo tanto, la pantalla de toxicidad es una pantalla para fenotipos tóxicos que se manifiestan como defectos de crecimiento cuando el efector bacteriano de interés está sobreexpresado. Los clones tóxicos, transformados con éxito y la expresión del efector bacteriano, se seleccionan y guardan para el siguiente paso. El segundo paso importante consiste en sobreexpresar una biblioteca genómica de levadura parcialmente digerida en el clon de levadura tóxica. Los plásmidos que componen la biblioteca genómica de levadura sugerida para su uso en este protocolo llevan inserciones de 5 a 20 kb, generalmente correspondientes a 3 x 13 marcos de lectura abierta de levadura (ORF) de un tamaño medio de gen de 1,5 kb en todos los plásmidos, representando todo el genoma de levadura cubierto cubierto aproximadamente 10veces. Esta parte del ensayo se llama la pantalla supresora, ya que el objetivo es suprimir la toxicidad de la proteína efector bacteriana. Los posibles plásmidos supresores están aislados de la levadura, secuenciados y los ORF supresores identificados. La razón que subyace a la pantalla supresora es que la proteína del efector se une, interactúa y/o abruma los componentes de la vía huésped a la que se dirige, y que proporcionar esas proteínas huésped en exceso puede rescatar el efecto tóxico en la vía y, por lo tanto, el defecto de crecimiento. Por lo tanto, los ORF identificados que suprimen la toxicidad a menudo representan a múltiples participantes de una vía huésped. A continuación, se realizan experimentos ortogonales para verificar que el efector bacteriano interactúa de hecho con la vía implicada. Esto es especialmente necesario si se ha identificado un socio de unión como clathrin o actina, ya que estas proteínas están implicadas en una multitud de procesos de huésped. Otros experimentos pueden elucidar la función fisiológica de la proteína efector durante la infección. Las pantallas de toxicidad y supresor son también potentes herramientas para descifrar la función fisiológica de las proteínas efectoras bacterianas que no unen físicamente las proteínas huésped con afinidades suficientes para detectar por inmunoprecipitación o que interactúan con la host en interacciones enzimáticas de hit-and-run que pueden no ser detectados por una pantalla híbrida de levadura dos.

Aunque la pantalla supresora puede ser un método potente para revelar posibles interacciones fisiológicas entre las proteínas efectoras bacterianas y las vías del huésped, la proteína efectora bacteriana debe inducir un defecto de crecimiento en la levadura, de lo contrario usarlo en el pantalla supresor será de poca utilidad. Además, el fenotipo tóxico debe resultar en al menos un déficit de 2 a 3registros 10 en crecimiento o será difícil identificar supresores. Si se configura un laboratorio para el cultivo celular, el cribado de proteínas efectoras para la toxicidad en líneas celulares comunes como HeLa a menudo puede dar una idea de si vale la pena el esfuerzo para proceder con la pantalla de toxicidad de la levadura. La expresión ectópica de la proteína efector en las células de HeLa a veces resulta en toxicidad que se correlaciona muy fuertemente con la toxicidad en la cepa de levadura utilizada para estas pantallas4. Las características notables del estrés en las células de HeLa incluyen la pérdida de fibras de tensión, el desprendimiento celular de la placa y la condensación nuclear que indica apoptosis. Cualquier indicación visual de estrés en las células de HeLa hace que la proteína de interés sea un buen candidato para inducir un defecto de crecimiento en la levadura, que se replica namucho más rápidamente y por lo tanto son más sensibles a la perturbación de las vías esenciales.

Cabe señalar que la pantalla del supresor no siempre identifica a los socios de unión de host como supresores, pero todavía puede implicar componentes críticos de la(s) vía(s) del huésped(s) objetivo(es), lo que produce una visión holística de los procesos biológicos que está secuestrando el proteína efector bacteriana. En la superficie, esto parece contraintuitivo, porque proporcionar el socio de unión de la proteína efector en exceso se espera que rescate el defecto de crecimiento. En los esfuerzos por identificar vías dirigidas por la proteína efector C. trachomatis CT229 (CpoS), que se une a al menos 10 GTPases Rab diferentes durante la infección5, ninguno de los socios de unión de Rab suprimió la toxicidad de CT229. Sin embargo, se identificaron numerosos supresores involucrados en el tráfico de vesículas recubiertas de clathrin ( CCV), lo que llevó a seguir trabajando demostrando que el CT229 subvierte específicamente el tráfico de CCV dependiente de Rab. Del mismo modo, al investigar la proteína efector C. burnetii Cbu0041 (CirA) se identificaron varias Rho GTPases que rescataron el defecto de crecimiento de la levadura, y más tarde se encontró que CirA funciona como una proteína activadora GTPase (GAP) para RhoA4.

La utilidad de la pantalla supresora de levadura para esclarecer las vías del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas no se puede exagerar, y otros investigadores que intentan caracterizar las proteínas efectoras bacterianas intracelulares pueden beneficiarse en gran medida estas técnicas. Estos ensayos son de valor si las inmunoprecipitaciones y/o las pantallas híbridas de levadura dos no han encontrado un compañero de unión y pueden dilucidar qué vías son atacadas por la proteína efectora bacteriana. Aquí, se proporcionan protocolos detallados para la toxicidad y las pantallas supresoras para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas intracelulares, así como algunos de los obstáculos comunes experimentados al usar estos ensayos y sus soluciones correspondientes.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de medios y reactivos

NOTA: Las planchas deben prepararse antes del día del ensayo y son buenas durante 1 mes. Los medios y reactivos se pueden hacer en cualquier momento y son buenos durante 1 mes.

  1. Preparar 1 L de la solución de glucosa (10% p/v) disolviendo 100 g de D-(+)-glucosa en 800 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 ml. Ajuste el volumen a 1 L con agua destilada. Filtrar a través de un filtro estéril de 0,2 m en una botella estéril de almacenamiento de medios de 1 L.
  2. Preparar 1 L de la solución de galactosa (10% p/v) disolviendo 100 g de galactosa D-(+) en 800 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 1 L. Ajuste el volumen a 1 ml con agua destilada y filtre a través de un filtro estéril de 0,2 m en una botella estéril de almacenamiento de medios de 1.000 ml.
  3. Preparar 1 L de dextrosa de peptona de extracto de levadura (YPD) agar disolviendo 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de glucosa, y 20 g de agar en 1.000 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en baño de agua de 56oC hasta enfriar. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  4. Preparar 1 L de caldo YPD disolviendo 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona y 20 g de glucosa en 1.000 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min.
  5. Preparar el uracilo de glucosa de deserción sintética (SD) (Ura-). Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 1,9 g de suplemento de abandono sin uracilo, y 15 g de agar en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de glucosa preparada en el paso 1.1. Mezcle bien girando suavemente o colóquelo en el plato de agitación. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  6. Preparar el uracilo de deserción sintética (SD) (Ura-) agar galactosa. Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 1,9 g de suplemento de abandono sin uracilo, y 15 g de agar en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de galactosa preparada en el paso 1.2. Mezcle bien girando suavemente o colóquelo en la placa de agitación. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  7. Preparar el caldo de glucosa (Ura-) de ser desechado sintético (SD). Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos y 1,9 g de suplemento de abandono sin uracilo en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, añadir 200 ml de la solución de glucosa preparada en el paso 1.1.
  8. Preparar el uracilo de deserción sintética (SD) (Ura-) leucina (Leu-) agar glucosa. Para 1 L, disolver 6,7 g de la base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos; 1.9 g de suplemento de abandono sin uracilo, leucina y triptófano; 15 g de agar; y 0,076 g de triptófano en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de glucosa preparada en el paso 1.1. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  9. Preparar el uracilo de abandono sintético (SD) (Ura-) leucina (Leu-) agar galactosa. Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos; 1.9 g de suplemento de abandono sin uracilo, leucina y triptófano; 15 g de agar; y 0,076 g de triptófano en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de galactosa preparada en el paso 1.2. Mezcle bien girando suavemente o colocando en un plato de agitación. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  10. Preparar el uracilo de abandono sintético (SD) (Ura-) leucina (Leu-) caldo de glucosa. Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos; 1.9 g de suplemento de abandono sin uracilo, leucina, triptófano; y 0,076 g de triptófano en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56 o 60 oC hasta que la temperatura sea de 50 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de glucosa preparada en el paso 1.1.
  11. Preparar la solución de polietilenglicol (PEG). Añadir 50% p/v de polietilenglicol 3350 en agua destilada. Esterilice mediante autoclave.
  12. Preparar 1 M de acetato de litio (LiAc) disolviendo 10,2 g de acetato de litio deshidratado en 200 ml de agua destilada. Esterilice mediante autoclave.
  13. Preparen ADN esperma arenque. Diluir el ADN esperal de 10 mg/ml de arenque a 2 mg/ml utilizando agua destilada. Calentar a 100 oC durante 5 min y colocar inmediatamente sobre hielo durante 5 min.

2. Clonación del gen de interés en el plásmido de toxicidad por levaduras pYesNTA-Kan

NOTA: Actualmente, existen vectores de toxicidad por levaduras de variedad disponibles tanto comercial como académicamente. La pantalla supresora de levadura se puede utilizar junto con muchos de estos vectores siempre que el plásmido que expresa la proteína efector de interés utiliza una selección de deserción que no sea uracilo y un marcador antibiótico distinto de BlaR. Este trabajo utilizó un vector pYesNTA modificado4,5 que incluye un casete de resistencia a la kanamicina para un cribado más fácil para posibles supresores. El esquema de clonación debe permitir que la proteína del efector esté en marcada con el promotor De y His-Tag. La proteína de membrana de inclusión de Chlamydia trachomatis CT229 se utilizó como prueba de principio para estos ensayos.

  1. Utilice PCR para amplificar CT229 de C. trachomatis GENómico DNA siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando las imprimaciones CT229 +1 Kpn F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) y CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTACGGGATGCC). Utilice las siguientes condiciones de PCR: (1) 98 oC durante 30 s; (2) 98 oC para 10 s, 55 oC para 30 s, 72 oC durante 2 min; (3) repita el paso 2 para un total de 25x; (4) 72 oC durante 10 min; y (5) 4 oC de retención.
  2. Analizar 5 l del producto PCR en un gel de agarosa del 1%(Figura 1).
  3. Purificar los 45 s de ADN restantes utilizando un kit de purificación de PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Digerir los 50 s de inserto de PCR purificado y pYesNTA-Kan(Figura 2) durante 1 h a 37 oC en un baño de agua utilizando KpnI-HF y XhoI-HF.
    NOTA: Para pYesNTA-Kan, digerir 5 g de plásmido utilizando 5 ml de KpnI-HF, 5 ml de XhoI-HF y 6 l de tampón en un volumen total de 60 l. Para la plaquita, digerir la totalidad de 50 ml del producto PCR purificado utilizando 2 ml de KpnI-HF, 2 ml de XhoI-HF y 6 ml de tampón.
  5. Ejecuta todo el digerido plásmido en un gel de agarosa del 1%. Realizar la purificación del plásmido digerido utilizando un kit de extracción de gel siguiendo las instrucciones del fabricante.
  6. Purificar el inserto de PCR digerido usando un kit de purificación de PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
  7. Clonar la plaquita en pYesNTA-Kan utilizando 2 l de pYesNTA-Kan (paso 2.5), 2 ml de tampón de ligadosa de ADN, 1 l de ligatasa T4 y 15 ml de inserción (paso 2.6). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  8. Añadir toda la reacción de clonación a 50 s de células competentes de E. coli y realizar la reacción de transformación.
  9. Placar toda la reacción de transformación en una placa LB que contiene 100 g/ml de carbenicilina.
  10. Inocular 10 ml de la LB que contiene 100 g/ml de carbenicilina con tres colonias individuales. Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 150 rpm.
  11. Aísle el plásmido utilizando un kit miniprep plásmido siguiendo las instrucciones del fabricante.
  12. Secuenciar los plásmidos aislados utilizando imprimaciones específicas de genes (paso 2.1).

3. Probar la proteína de interés para la toxicidad en la levadura

  1. Racha Saccharomyces cerevisiae W303 en el agar YPD (paso 1.3) para obtener colonias aisladas. Incubar a 30oC durante 24 h.
  2. Inocular 10 ml de caldo YPD (paso 1.4) con una sola colonia de la placa de agar (paso 3.1). Incubar a 30oC con agitación a 150 rpm durante la noche.
  3. Añadir 0,5 ml del cultivo nocturno a 10 ml de caldo YPD (paso 1.4) e incubar a 30oC con agitación a 150 rpm durante 4 h.
    1. Pellet los 10 ml de cultivo a 3.000 x g durante 10 min a 4oC.
    2. Resuspenda el pellet en 1 ml de agua estéril, transfiera al tubo de microcentrífuga y el pellet a 3.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
    3. Resuspenda el pellet en 1 ml de acetato de litio de 1 mM (LiAc) y pellet a 3.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
    4. Repita el LiAc wash 2x.
    5. Retire el lavado. Resuspender el pellet en 2,4 ml de 50% PEG 3350. Añadir 360 ml de 1M de LiAc, 500 ml de 2 mg/ml de ADN espermés de arenque y 400 l de agua estéril.
      NOTA: Esto es suficiente para 20 transformaciones.
    6. Añadir 180 l de la mezcla de transformación del paso 3.3.5 a un tubo de microcentrífuga que contenga 5 ml de ADN plásmido pYesNTA-Kan CT229 (100-500 ng) del paso 2.12.
    7. Incubar en un baño de agua a 30oC durante 30 min.
    8. Incubar en un baño de agua a 42oC durante 30 min.
    9. Pellet a 3.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
    10. Retire la mezcla de transformación con la pipeta. Resuspenda el gránulo en 100 ml de agua estéril. Placa de la transformación en SD Ura- agar con glucosa (paso 1.5).
    11. Incubar placas a 30oC durante 48 h.
  4. Inocular 5 ml de SD Ura- caldo que contiene glucosa (paso 1.7) con una sola colonia de la placa. Incubar durante la noche a 30oC con agitación a 150 rpm. Incluir levadura transformada con el vector solo como un control negativo.
    1. Añadir 180 l de agua estéril a 5 pocillos de una placa de 96 pocillos (A2-A6).
    2. Vortex el cultivo de la noche para mezclar.
    3. Añadir 180 l de levadura al primer pozo (A1). Diluir en serie 1:10 (seis muestras en total, incluidas las sin diluir).
    4. Usando una pipeta multicanal, detecte 5 ml de cada dilución en las placas de agar SD Ura- glucosa (paso 1.5) y Ura- galactosa (paso 1.6). Incubar a 30oC durante 48 h.
  5. Evaluar la toxicidad comparando el crecimiento de la levadura expresando la proteína efector de interés cultivada en los medios que contienen galactosa con el crecimiento de la levadura expresando el vector solo.
  6. Confirme la expresión de la proteína de fusión His-tag por western blotting.

4. Transformar la levadura tóxica con la biblioteca genómica de levaduras

  1. Inocular 100 ml de SD Ura- caldo de glucosa (paso 1.7) utilizando 1 ml del stock del paso 3.4. Incubar durante 16 x 24 h a 30oC con agitación a 150 rpm. Colocar 900 ml de SD Ura- caldo de glucosa a 30 oC durante la noche para precalentar los medios.
  2. Agregue los 100 ml completos del cultivo nocturno al matraz de 1 L precalentado. Incubar durante 4 x 5 h a 30oC con agitación a 150 rpm.
    1. Pellet el cultivo a 6.000 x g durante 10 min a 4oC.
    2. Descarta el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 250 ml de agua estéril. Pellet el cultivo a 6.000 x g durante 5 min a 4oC.
    3. Descarta el sobrenadante. Resuspender el pellet en 250 ml de 1 mM de LiAc. Pellet el cultivo a 6.000 x g durante 5 min a 4oC.
    4. Retire El LiAc y resuspenda el pellet en 9,6 ml de 50% PEG 3350. Añadir 1,44 ml de 1M LiAc, 2 ml de ADN esperequino de arenque de 2 mg/ml, 50 g de la biblioteca genómica pYep13 (ATCC 37323). Ajuste el volumen a 15 ml con agua estéril. Mezclar suavemente por inversión.
    5. Incubar en un baño de agua a 30oC durante 30 min.
    6. Añadir 750 l de dimetil sulfóxido (DMSO) para mejorar la eficiencia de transformación. Incubar en un baño de agua a 42oC durante 30 min. Mezclar por inversión suave cada 10 min.
    7. Pellet la levadura a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de agua estéril. Pellet a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    9. Resuspender el pellet en 8 ml de agua estéril.
    10. Para determinar la eficiencia de transformación, diluir 1:10 y placa 100 l de cada dilución en SD Ura- Leu- agar glucosa (paso 1.8).
    11. Placa 200 l de la muestra en placas SD Ura- Leu- agar galactosa (paso 1.9). Utilice 50 placas en total.
    12. Incubar a 30oC durante 48 o 96 h o hasta que aparezcan las colonias.
      NOTA: Las colonias generalmente aparecen en placas de agar glucosa a 48-72 h y placas de agar galactosa a 72-96 h.
  3. Colonias de parches (posibles rescates) en SD Ura- Leu- agar galactosa (paso 1.9) para expandir y hacer stock. Incubar a 30oC durante 24oC 48h.
  4. Inocular 5 ml de SD Ura- Leu- caldo de glucosa (paso 1.10) utilizando la parte del parche. Incubar durante la noche a 26oC con agitación a 150 rpm.
    1. Añadir 180 l de agua estéril a 5 pocillos de una placa de 96 pocillos (A2-A6).
    2. Vortex el cultivo de la noche para mezclar.
    3. Añadir 180 l de levadura al primer pozo (A1). Diluir en serie 1:10 (seis muestras en total, incluidas las sin diluir).
    4. Usando una pipeta multicanal, detecte 5 ml de cada dilución en SD Ura- glucosa y SD Ura- placas de agar galactosa. Incluya el efector tóxico solo como control.
    5. Incubar a 30oC durante 48 h.
  5. Compare el crecimiento de la levadura expresando el efector tóxico solo con la levadura que contiene los supresores potenciales. Proceder únicamente con supresores potenciales que tienen toxicidad disminuida en comparación con la levadura que expresa el efector solo.

5. Identificar y confirmar los supresores

  1. Inocular 5 ml de SD Ura- Leu- caldo de glucosa (paso 1.10) con 100 ml de levadura del paso 4.4 e incubar durante la noche a 30oC con agitación a 150 rpm.
    1. Pellet la levadura a 3.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Deseche suavemente el sobrenadante con una pipeta.
    2. Aísle el plásmido con un kit miniprep de plásmido de levadura siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Transforme el plásmido aislado en las células competentes de E. coli y placa toda la transformación en el agar LB con 100 g/ml de carbenicilina. Incubar a 37oC durante 24 h.
  3. Inocular 10 ml de caldo LB que contenga 100 g/ml de carbenicilina, con tres colonias de la placa e incubar a 37oC durante la noche con agitación a 150 rpm.
    1. Cultivos de pellets a 3.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Aísle el plásmido utilizando un kit miniprep siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Retransforme la levadura tóxica con los plásmidos aislados del paso 5.3.1 siguiendo los pasos de la parte 3 del protocolo.
    1. Inocular 5 mL de SD Ura- Leu- caldo de glucosa con una colonia de la placa de transformación. Incubar durante la noche a 30oC con agitación a 150 rpm.
    2. Spot on Ura- Leu- agar glucosa y galactosa para confirmar la supresión de la toxicidad.
  5. Secuencia utilizando imprimaciones pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) y pYep13 R (TGATGCCCCCCACGATGC) para identificar ORFs de levadura.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antes de que se pueda realizar la pantalla supresora de levadura real, la proteína efector de interés debe ser probada para la toxicidad en la levadura. Esto se logra expresando la proteína de interés en la levadura bajo el control de un promotor inducible de galactosa. El crecimiento de la glucosa (condiciones no inductivas) debe compararse primero para garantizar que la toxicidad se deba específicamente a la expresión de la proteína de interés y no sea un defecto general. Como se muestra en la Figu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe los procedimientos paso a paso para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas utilizando una pantalla de toxicidad y supresor de levadura modificada. La cepa de levadura utilizada, S. cerevisiae W303, es auxotravófica tanto para uracilo como para leucina. La auxotrofia Uracil de la cepa se utiliza para seleccionar levaduras portadoras de la proteína de interés en el vector pYesNTA-Kan, mientras que la auxotrofia de leucina se utiliza par...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Shelby Andersen, Abby McCullough y Laurel Woods por su ayuda con estas técnicas. Este estudio fue financiado con fondos de startups del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Iowa a Mary M. Weber.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFisher Scientific BP2641500
Millipore de GalactosaSigmaG0750-1KG
extracción de gel GeneJetThermoFisher ScientificK0691
Kit de purificación de PCR GeneFisherScientificK0701
Kit de minipreparación de plásmidos GeneJetThermoK0503
GlucosaMilliporeSigmaG8270-1KG
ADN de esperma de arenquePromegaD1811
KpnI-HFNew England BiolabsR3142S
Acetato de litio dihidratadoMilliporeSigmaL6883-250G
PeptonaFisher Scientific
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidadNew England BiolabsM0530
Poli(etilenglicol) 3350MilliporeSigma1546547-1G
pYep13ATCC37323
T4 ADN ligasaNew England BiolabsM0202S
TriptófanoMilliporeSigma470031-1G
XhoI-HFNew England BiolabsR0146S Extracto de
levaduraFisher ScientificBP1422-500
Kit de minipreparación de levaduraZymoD2001
Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidosMilliporeSigmaY0626-250G
Suplementos de Medio Drop-out Sintético de LevaduraMilliporeSigmaY1501-20Gsin uracilo
Suplementos de Medio Drop-out Sintético de LevaduraMilliporeSigmaY1771-20Gsin uracilo, leucina, triptófano
Kit de

References

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