Cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides

Resumen

El protocolo presentado utiliza citometría de flujo para cuantificar el número de células muertas y proliferantes en enteroides de ratón cultivados. Este método es útil para evaluar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación y supervivencia de los organoides.

Resumen

El epitelio intestinal actúa como una barrera que impide que el contenido luminal, como la microbiota patógena y las toxinas, entre en el resto del cuerpo. La función de barrera epitelial requiere la integridad de las células epiteliales intestinales. Mientras que la proliferación de células epiteliales mantiene una capa continua de células que forma una barrera, daño epitelial conduce a la disfunción de barrera. Como resultado, el contenido luminal puede atravesar la barrera intestinal a través de una vía sin restricciones. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con muchas enfermedades intestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal. Las criptas intestinales aisladas del ratón se pueden cultivar y mantener como estructuras similares a la cripta, que se denominan organoides intestinales o "enteroides". Los enteroides son ideales para estudiar la proliferación y muerte celular de las células epiteliales intestinales in vitro. En este protocolo, describimos un método simple para cuantificar el número de células proliferativas y muertas en enteroides cultivados. 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU) y yoduro de propidium se utilizan para etiquetar células proliferantes y muertas en enteroides, y la proporción de células muertas y proliferantes se analizan por citometría de flujo. Esta es una herramienta útil para probar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación de células epiteliales intestinales y la supervivencia celular.

Introducción

Una función fundamental de las células epiteliales intestinales es proteger la entrada de contenidos luminales como bacterias patógenas y toxinas^1,2. Para realizar tal función, las células madre intestinales proliferan y diferencian continuamente en una variedad de células epiteliales, incluyendo enterocitos y células secretoras, que forman una barrera mediante la formación de conexiones estrechas^3. La rápida renovación de las células epiteliales intestinales requiere una estricta coordinación de la proliferación celular, la diferenciación celular y la muerte celular^4,....

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Recursos Genómicos de Cambridge-Suda (CAM-SU) de la Universidad de Soochow.

1. Aislamiento y cultivo organoides intestinales

1. Aislamiento de criptas intestinales y cultura enteroide
   1. Eutanasia un ratón de tipo salvaje de 8 semanas de edad con inhalación de_CO2. Use fórceps tisulares y tijeras de iris finas para diseccionar aproximadamente 8 cm de íleon.
   2. Enjuague con una jeringa con aguja de alimentación de gavage con aproximadamente 40 ml de salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco en frío, luego corte longitudinal....

Resultados

Pequeñas criptas intestinales fueron aisladas y cultivadas como enteroides en la matriz de membrana del sótano. Enteroids comenzó a formar brotes 2 días después del aislamiento. En el día 6, los enteroides tenían muchos cogollos con muchos desechos (células muertas) en el lumen. Los enteroides estaban listos para ser repasados en esta etapa(Figura 3).

Numerosos estudios han demostrado que las citoquinas inflamatorias son esenciales para el mantenimiento de la home.......

Discusión

Este protocolo detalla los pasos necesarios para el cultivo de enteroides in vitro y la cuantificación de células EdU y PI-positivas en los enteroides por citometría de flujo. Hay varias ventajas de esta estrategia. En primer lugar, el etiquetado EdU se utiliza para detectar células que proliferan en enteroides. En comparación con el ensayo tradicional de BrdU, el método de etiquetado EdU es más rápido, más sensible y más preciso. EdU es muy similar a la timina (T), que reemplaza la timina en la síntesis de ADN durante l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de centrífuga de 15 ml	Corning	430791
aguja de sonda nasogástrica de 22 g	VWR	20068-608
Placa de 24 pocillos	Nunc	142475
40 mm filtro de células estériles	BD	352340
Tubo de centrífuga de 50 ml	Corning	430829
70 mm filtro de células estériles	BD	352350
Citómetro de enfoque acústico avanzado DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT	Invitrogen	A24863
B-27 Suplemento	GIBCO	17504044
Tampón 1			2 mM EDTA en DPBS
Tampón 2			54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sacarosa en
ratones	DPBS C57/B6Instituto de Investigación Biomédica de Nanjing de la Universidad
Enzimas de disociación celular (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrífuga	Eppendorf	5424
Centrífuga	Eppendorf	5424R
Centrífuga	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Kit de imágenes	Life tecnologías	C10639
incubadora de CO2	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR medios			Medios miniintestino, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-espondina
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	10270-106
Tijeras de iris finas	Tansoole	2037454
Microscopio de fluorescencia	Olympus	FV1000
GlutaMAX Suplemento	GIBCO	35050-061
Suero de cabra	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
	Matrigel Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 unidades/ml), 10 mM Hepes, suplemento de N2 (1:100), suplemento de B27 (1:50)
Suplemento de N2	R& D	AR009
Surfactante no iónico (Triton X)		BBI TB0198-500ML
Tijera de operación (12,5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehído (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Microscopio de contraste de fase	Nikon	TS1000
Yoduro de propidio	Sigma	P4170-25MG
EGF Recombinante	PeproTech	315-09
Ratón Recombinante Noggin	PeproTech	250-38
Ratón Recombinante R-Spondin 1	R& D	3474-RS-050
Recombinante Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sacarosa	BBI	SB0498
Pinzas de tejido	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049

de Nanjing 14190144