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Artículo de método

Microdisección de captura láser de cartílago embrionario de ratón y hueso para análisis de expresión génica

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DOI:

10.3791/60503

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18 de diciembre de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la microdisección de captura láser para el aislamiento del cartílago y el hueso de las secciones congeladas frescas del embrión del ratón. El cartílago y el hueso se pueden visualizar rápidamente mediante la tinción violeta de cresíl y se recogen con precisión para producir ARN de alta calidad para el análisis transcriptómico.

Resumen

La microdisección de captura láser (LCM) es una poderosa herramienta para aislar tipos de células específicas o regiones de interés de tejidos heterogéneos. La complejidad celular y molecular de los elementos esqueléticos aumenta con el desarrollo. La heterogeneidad tisular, como en la interfaz de elementos cartilaginosos y óseos entre sí o con los tejidos circundantes, es un obstáculo para el estudio del desarrollo del cartílago y el hueso. Nuestro protocolo proporciona un método rápido de procesamiento de tejidos y aislamiento de cartílago y hueso que produce ARN de alta calidad para el análisis de expresión génica. Los tejidos congelados frescos de embriones de ratón se seccionan y la breve tinción violeta de cresilo se utiliza para visualizar el cartílago y el hueso con colores distintos de los tejidos circundantes. Los deslizamientos se deshidratan rápidamente, y el cartílago y el hueso se aíslan posteriormente por LCM. La minimización de la exposición a soluciones acuosas durante este proceso mantiene la integridad del ARN. El cartílago de Mouse Meckel y el hueso mandibular en E16.5 se recopilaron con éxito y el análisis de la expresión génica mostró la expresión diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteocitos, osteoclastos y condrocitos. Arna de alta calidad también se aisló de una gama de tejidos y edades embrionarias. Este protocolo detalla la preparación de muestras para LCM, incluyendo crioema, seccionamiento, tinción y deshidratación de tejidos congelados frescos, y aislamiento preciso de cartílago y hueso por LCM, lo que resulta en ARN de alta calidad para análisis transcriptomic.

Introducción

El sistema musculoesquelético es un sistema multicomponente compuesto por músculo, tejido conectivo, tendón, ligamento, cartílago y hueso, invadido por los nervios y vascularizado por los vasos sanguíneos1. Los tejidos esqueléticos se desarrollan con el aumento de la heterogeneidad celular y la complejidad estructural. El cartílago y el hueso se desarrollan a partir del mismo linaje osteocondrónrogenitor y están altamente relacionados. El cartílago embrionario y el hueso se desarrollan en asociación con músculos, nervios, vasos sanguíneos y mesenquime indiferenciado. El cartílago también puede estar rodeado de hueso, como el cartílago de Meckel y el cartílago condilar dentro del hueso mandibular. Estos tejidos están anatómicamente asociados e interactúan entre sí a través de señales extracelulares durante el desarrollo. En el estudio de la expresión génica en el desarrollo de cartílago y hueso, un obstáculo es la heterogeneidad de las estructuras esqueléticas compuestas de múltiples tipos de tejido. El aislamiento preciso del tejido específico de interés es clave para un análisis transcripcional exitoso.

La microdisección de captura láser (LCM) es una poderosa herramienta para aislar tipos de células o regiones de interés dentro de tejidos heterogéneos, y es reproducible y es sensible al nivel de una sola célula2. Puede apuntar y capturar con precisión células de interés para una amplia gama de ensayos aguas abajo en transcriptomica, genómica y proteómica3,4. La calidad del ARN, ADN o proteína aisladose se puede evaluar con un bioanalizador o plataforma equivalente. Por ejemplo, la calidad del ARN se indica mediante el número de integridad del ARN (RIN)5.

Aquí, proporcionamos un protocolo para la rápida tinción y aislamiento de cartílago y hueso por LCM de los tejidos congelados frescos. Utilizamos el embrión de ratón para demostrar que este protocolo produce ARN de alta calidad para análisis transcriptomáticos posteriores, como la secuenciación de ARN (RNA-seq).

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Protocolo

Los tejidos de ratones se obtuvieron de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y los protocolos de estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

1. Preparación de especímenes congelados frescos

  1. Diseccionar el embrión o tejido de interés. Incruste la muestra en un molde de incrustación desechable con un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Ajuste la orientación de la muestra con una punta o aguja.
  2. Congele rápidamente las muestras en un baño de hielo seco/metil-2 butano. Continúe con el siguiente paso o almacene a -80 oC.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

2. Criosección para microdisección de captura láser

  1. Descongelar el criostato y limpiar las superficies internas con 70% de etanol. Trate la placa antivuelco y un par de fórceps con el agente de descontaminación RNase. Ajuste el criostato a la temperatura de corte deseada (-18 a -22 oC). Preparar un recipiente tapado con hielo seco, colocando una lámina de papel de aluminio en el hielo seco para el almacenamiento temporal de los portaobjetos de muestra seccionados durante la criosección.
    PRECAUCION: El hielo seco es extremadamente frío. Siempre manipule el hielo seco con cuidado y use guantes aislados siempre que lo manipule.
  2. Transfiera el espécimen fresco congelado en un cubo de hielo seco. Coloque una capa de compuesto OCT sobre un soporte de muestra criostato e coloque inmediatamente la muestra encima del PTU con una presión suave. Cuando los OCT estén completamente congelados, apriete el soporte con la muestra en el brazo de corte del criostato.
  3. Deje la muestra en el criostato durante 15 minutos para equilibrar la temperatura de corte.
  4. Seccionar el tejido y recoger las rodajas de las guías de membrana de polietilenano naftala (PEN) a un espesor de 12 m. Alinee secciones consecutivas en la membrana. Una vez que se haya completado una diapositiva, deje que las secciones se sequen durante unos minutos y transfiera la diapositiva a la lámina en el recipiente de hielo seco hasta que se recojan todos los portaobjetos necesarios.
  5. Almacene las diapositivas a -80 oC en una caja de diapositivas.
    NOTA: El espesor de la sección se elige para maximizar la cantidad de tejido recogido mientras permite un corte eficiente del tejido, y puede variar dependiendo del tejido de interés. El protocolo se puede pausar aquí. Mantenga las diapositivas libres de contaminación por RNase. Evite los cambios de temperatura. Aunque los RIN de ARN de las diapositivas almacenadas hasta 6 meses todavía pueden indicar una alta calidad del ARN, recomendamos el uso de diapositivas tan pronto como sea posible.

3. Preparación de muestras para la microdisección de captura láser

  1. Preparar soluciones para la tinción y la deshidratación.
    1. Colocar 45 ml de 80% de etanol en cada uno de los tres tubos centrífugos de 50 ml sobre hielo. Etiquételos como #1, #2 y #3. Diluir el etanol con agua libre de RNase/DNase.
    2. Colocar 45 ml de etanol al 95% en un tubo centrífugo de 50 ml sobre hielo.
    3. Colocar 45 ml de etanol 100% en un tubo centrífugo de 50 ml sobre hielo.
    4. Colocar 45 ml de xileno en un tubo centrífugo de 50 ml a temperatura ambiente.
      PRECAUCION: El xileno debe utilizarse en una campana de humo.
  2. Descongelar una membrana PEN se desliza brevemente colocándola contra una mano enguantada, luego lavar dos veces durante 30 s cada una en 45 ml de etanol 80% (#1 y #2) con agitación en tubos centrífugos de 50 ml para extraer el PTU.
    NOTA: Es importante eliminar los PTU antes de la tinción, para evitar que los PTU se aflojen durante la tinción oscurezen las secciones. Los fórceps se pueden utilizar para facilitar la eliminación de LOS PTU que no se lavan por agitación.
  3. Poner el dedo sobre una hoja de papel de aluminio. Pipeta 0,8 ml de 0,1% de cresilo violeta en 50% etanol sobre el portaobjetos y mancha durante 30 s. Lavar el portaobjetos en 45 ml de etanol 80% (#3) para 30 s, y luego deshidratar por paso durante 30 s cada uno a través de 45 ml de etanol 95%, 100% etanol y xileno en tubos centrígenos de 50 ml.
  4. Depie los portaobjetos sobre un limpiaparabrisas de tarea delicada durante 5 minutos para drenar las secciones de xileno y secas.
    NOTA: Las diapositivas deben secarse completamente antes de LCM.

4. Microdisección de captura láser

NOTA: Use guantes de nitrilo sin polvo mientras realiza LCM.

  1. Encienda el microscopio, el láser y la computadora LCM. Inicie sesión en el ordenador e inicie el software. Gire la tecla a la posición "On" para poner en marcha el láser. Cuando la luz verde (Láser) está encendida, presione el botón rojo para activar el láser, y luego la luz (Láser) se vuelve roja indicando que el láser está listo para usar.
    NOTA: El láser necesita aproximadamente 10 minutos para calentarse.
  2. Configure los tubos de recogida.
    1. Inserte la tapa de un tubo de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 0,5 ml en el colector.
      NOTA: Elija el colector correspondiente para los tubos PCR deseados (0,2 o 0,5 ml).
    2. Pipeta de 50 l de tampón de extracción (proporcionado por el kit de aislamiento de ARN incluido en la Tabla de Materiales)en la tapa del tubo de recogida de 0,5 ml.
    3. Inserte el dispositivo de recogida en el microscopio.
    4. En la ventana Cambiar dispositivo recopilador, haga clic en el botón Mover al punto de referencia para mover el selector al punto de referencia (RP). Ajuste el enfoque para ver claramente el RP. Haga clic en las flechas para mover el RP al centro de la vista.
  3. Cargue los portaobjetos.
    1. Haga clic en el botón Descargar izquierdo de la barra de herramientas para bajar el portaobjetos.
    2. Coloque la corredera en el soporte, con la sección de tejido hacia abajo.
      NOTA: Esta orientación asegura que las secciones de tejido capturadas caigan en la tapa del tubo de recolección por gravedad.
    3. Vuelva a insertar el soporte en el escenario.
  4. Configure los parámetros del láser.
    1. Seleccione la opción Control del menú Láser o haga clic en el icono Láser.
    2. Ajuste estos parámetros como desee: Potencia,la potencia del láser; Apertura, la anchura del láser; y Velocidad, la velocidad de corte en el modo Dibujar y Cortar.
      NOTA: Pruebe el láser en un área fuera de interés. Una mayor potencia o una apertura más grande hace que sea más fácil de cortar, pero causa más daño a las células. Ajuste la combinación de potencia, apertura y velocidad para obtener un corte eficiente y un daño mínimo del tejido. Por ejemplo, Potencia 40, Apertura 5 y Velocidad 7 para el tejido del cartílago en una sección de 12 m.
  5. Seleccione y corte áreas de interés.
    1. Comience con el objetivo 5x y encuentre las áreas de interés, y luego cambie al objetivo (5x, 10x, o 40x) que mejor muestre el área de interés.
      NOTA: Después de la tinción violeta cresilo, los cartílagos son magenta manchados y los tejidos mineralizados aparecen marrones o negros, distinguibles de otros tejidos. Las imágenes se pueden guardar mediante Guardar imagen como en el menú Archivo.
    2. Elija el tubo para la colección (A, B, C, D) haciendo clic en la marca en el colector.
    3. Seleccione Mover y cortar o Cortar y cortar. En el modo Mover y cortar, la muestra se corta manualmente, utilizando el ratón o el lápiz de pantalla táctil para dibujar formas a mano alzada. En el modo Dibujar y Cortar, las formas se pueden dibujar a mano alzada con el ratón o el lápiz de pantalla táctil para el corte posterior. Haga clic en el botón Iniciar corte para iniciar el corte por láser.
    4. Una vez completado el corte, el tejido diana con membrana PEN cae en la tapa del tubo de recolección por gravedad. Repita 4.5 para agrupar varias áreas de interés si es necesario.
      NOTA: Puede ser necesario repetir cortes o aumentar la potencia o la apertura si el tejido no cae en la tapa del tubo de recogida debido al corte incompleto. El hueso mineralizado (marrón o negro) no se puede cortar directamente con láser.
  6. Descargue el colector y cierre cuidadosamente el tubo PCR. Coloque los tejidos microdiseccionados en hielo seco. Continúe con el siguiente paso o almacene a -80 oC.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Repita 4.2 a 4.6 para la siguiente muestra.

5. Lisis de los tejidos microdiseccionados y el aislamiento del ARN

  1. Descongelar los tejidos microdiseccionados a temperatura ambiente. Centrifugar brevemente e incubar las muestras durante 30 min a 42oC.
  2. Después de la incubación, gire el tampón de lisis hacia abajo en el tubo PCR de 0,5 ml. Realice el tratamiento con DNase y la extracción de ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante.

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Resultados

Se utilizaron secciones coronales de tejidos frescos congelados de ratón en E16.5 para demostrar el aislamiento y la recolección del cartílago de Meckel (MC), cartílago cario y hueso mandibular por LCM. Los embriones de ratón en E16.5 fueron diseccionados e incrustados en moldes criogénicos con compuesto OCT. Las muestras en moldes se congelaron rápidamente en un baño de hielo seco y metil-2-butano y se almacenaron a -80 oC.

Para demostrar la tinción violeta cresilo de cartílago y hueso, se re...

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Discusión

LCM permite el aislamiento de poblaciones celulares enriquecidas u homogéneas de tejidos heterogéneos. Sus ventajas incluyen la captura rápida y precisa de las células en su contexto in vivo, mientras que las desventajas potenciales incluyen que sea lento, costosa y limitada por la necesidad de que el usuario reconozca subpoblaciones distintas dentro de una muestra especificada30. Este protocolo proporciona detalles de LCM de cartílago embrionario de ratón y hueso, destacando el uso de la...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (R01DE022988) y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver (P01HD078233). Los autores agradecen al Biorepositorio y Al Núcleo de Patología por el acceso a la plataforma Leica LMD 6500 en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-metilbutanoBioanalizador ThermoFisher ScientificO3551-4
AgilentG2939BA
Tubo de centrífugaThermoFisher Scientific339653Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos, 50 mL
Acetato violeta de CresylSigma-AldrichC5042
CriostatoLeica BiosystemsCM3050 S
Limpiador de tareas delicadasThermoFisher Scientific06-666
Molde de inclusión desechableThermoFisher Scientific1220
Agua destiladaInvitrogen10977-015Etanol sin DNasa/RNasa
, absoluto (200 grados)ThermoFisher ScientificBP2818Portaobjetos
de membrana PEN de vidrio de grado de biología molecularSistema11505158
Microsystems Leica MicrosystemsLeica LMD6500
ThermoFisher Scientific12-545FP
Portaobjetos de microscopioThermoFisher Scientific12-550-15
OCT compuestoMicroscopía electrónica Sciences102094-106
Tubo de PCR con tapa plana, 0,5 mLAxygenPCR-05-CLCM
Medio de montaje permanenteVector LaboratoriesH-5000
Kit de aislamiento de ARNThermoFisher ScientificKIT0204
Agente descontaminante de ARNasaSigma-AldrichR2020Agente descontaminante de ARNasa para la limpieza de superficies
XilenoSigma-Aldrich214736
LCM Leica Cubierta de microscopio Tubos de recolección

Referencias

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