Microdisección de captura láser de cartílago embrionario de ratón y hueso para análisis de expresión génica

Resumen

Este protocolo describe la microdisección de captura láser para el aislamiento del cartílago y el hueso de las secciones congeladas frescas del embrión del ratón. El cartílago y el hueso se pueden visualizar rápidamente mediante la tinción violeta de cresíl y se recogen con precisión para producir ARN de alta calidad para el análisis transcriptómico.

Resumen

La microdisección de captura láser (LCM) es una poderosa herramienta para aislar tipos de células específicas o regiones de interés de tejidos heterogéneos. La complejidad celular y molecular de los elementos esqueléticos aumenta con el desarrollo. La heterogeneidad tisular, como en la interfaz de elementos cartilaginosos y óseos entre sí o con los tejidos circundantes, es un obstáculo para el estudio del desarrollo del cartílago y el hueso. Nuestro protocolo proporciona un método rápido de procesamiento de tejidos y aislamiento de cartílago y hueso que produce ARN de alta calidad para el análisis de expresión génica. Los tejidos congelados frescos de embriones de ratón se seccionan y la breve tinción violeta de cresilo se utiliza para visualizar el cartílago y el hueso con colores distintos de los tejidos circundantes. Los deslizamientos se deshidratan rápidamente, y el cartílago y el hueso se aíslan posteriormente por LCM. La minimización de la exposición a soluciones acuosas durante este proceso mantiene la integridad del ARN. El cartílago de Mouse Meckel y el hueso mandibular en E16.5 se recopilaron con éxito y el análisis de la expresión génica mostró la expresión diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteocitos, osteoclastos y condrocitos. Arna de alta calidad también se aisló de una gama de tejidos y edades embrionarias. Este protocolo detalla la preparación de muestras para LCM, incluyendo crioema, seccionamiento, tinción y deshidratación de tejidos congelados frescos, y aislamiento preciso de cartílago y hueso por LCM, lo que resulta en ARN de alta calidad para análisis transcriptomic.

Introducción

El sistema musculoesquelético es un sistema multicomponente compuesto por músculo, tejido conectivo, tendón, ligamento, cartílago y hueso, invadido por los nervios y vascularizado por los vasos sanguíneos^1. Los tejidos esqueléticos se desarrollan con el aumento de la heterogeneidad celular y la complejidad estructural. El cartílago y el hueso se desarrollan a partir del mismo linaje osteocondrónrogenitor y están altamente relacionados. El cartílago embrionario y el hueso se desarrollan en asociación con músculos, nervios, vasos sanguíneos y mesenquime indiferenciado. El cartílago también puede estar rodeado de hueso, como el cartílago de Meckel....

Protocolo

Los tejidos de ratones se obtuvieron de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y los protocolos de estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

1. Preparación de especímenes congelados frescos

1. Diseccionar el embrión o tejido de interés. Incruste la muestra en un molde de incrustación desechable con un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Ajuste la orientación de la muestra con una punta o aguja.
2. Congele rápidamente las muestras en un baño de hielo seco/metil....

Resultados

Se utilizaron secciones coronales de tejidos frescos congelados de ratón en E16.5 para demostrar el aislamiento y la recolección del cartílago de Meckel (MC), cartílago cario y hueso mandibular por LCM. Los embriones de ratón en E16.5 fueron diseccionados e incrustados en moldes criogénicos con compuesto OCT. Las muestras en moldes se congelaron rápidamente en un baño de hielo seco y metil-2-butano y se almacenaron a -80 oC.

Para demostrar la tinción violeta cresilo de cartílago y hueso, se re.......

Discusión

LCM permite el aislamiento de poblaciones celulares enriquecidas u homogéneas de tejidos heterogéneos. Sus ventajas incluyen la captura rápida y precisa de las células en su contexto in vivo, mientras que las desventajas potenciales incluyen que sea lento, costosa y limitada por la necesidad de que el usuario reconozca subpoblaciones distintas dentro de una muestra especificada³⁰. Este protocolo proporciona detalles de LCM de cartílago embrionario de ratón y hueso, destacando el uso de la.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-metilbutano	Bioanalizador ThermoFisher Scientific	O3551-4
	Agilent	G2939BA
Tubo de centrífuga	ThermoFisher Scientific	339653	Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos, 50 mL
Acetato violeta de Cresyl	Sigma-Aldrich	C5042
Criostato	Leica Biosystems	CM3050 S
Limpiador de tareas delicadas	ThermoFisher Scientific	06-666
Molde de inclusión desechable	ThermoFisher Scientific	1220
Agua destilada	Invitrogen	10977-015	Etanol sin DNasa/RNasa
, absoluto (200 grados)	ThermoFisher Scientific	BP2818	Portaobjetos
	de membrana PEN de vidrio de grado de biología molecularSistema	11505158
	Microsystems Leica Microsystems	Leica LMD6500
	ThermoFisher Scientific	12-545FP
Portaobjetos de microscopio	ThermoFisher Scientific	12-550-15
OCT compuesto	Microscopía electrónica Sciences	102094-106
Tubo de PCR con tapa plana, 0,5 mL	Axygen	PCR-05-C	LCM
Medio de montaje permanente	Vector Laboratories	H-5000
Kit de aislamiento de ARN	ThermoFisher Scientific	KIT0204
Agente descontaminante de ARNasa	Sigma-Aldrich	R2020	Agente descontaminante de ARNasa para la limpieza de superficies
Xileno	Sigma-Aldrich	214736