Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Cytofast es una herramienta de visualización utilizada para analizar la salida de la agrupación en clústeres. Cytofast se puede utilizar para comparar dos métodos de agrupación en clústeres: FlowSOM y Cytosplore. Cytofast puede generar rápidamente una visión cuantitativa y cualitativa de los datos de citometría de masa y resaltar las principales diferencias entre los diferentes algoritmos de agrupación en clústeres.
La complejidad de los datos generados por la citometría masiva ha requerido nuevas herramientas para visualizar rápidamente los resultados analíticos. Los métodos de agrupación en clústeres como Cytosplore o FlowSOM se utilizan para la visualización e identificación de clústeres de celdas. Para el análisis posterior, un paquete de R recientemente desarrollado, Cytofast, puede generar una visualización rápida de los resultados de los métodos de agrupación en clústeres. Cytofast tiene en cuenta la caracterización fenotípica de los clústeres de células, calcula la abundancia del clúster de celdas y, a continuación, compara cuantitativamente los grupos. Este protocolo explica las aplicaciones de Citofast al uso de datos de citometría de masabasados en la modulación del sistema inmunitario en el microambiente tumoral (es decir, la respuesta celular del asesino natural [NK]) al desafío tumoral seguido de la inmunoterapia (bloqueo PD-L1). Se muestra la demostración de la utilidad del citorápido con FlowSOM y Cytosplore. El citorápido genera rápidamente representaciones visuales de cúmulos de células inmunitarias relacionadas con el grupo y correlaciones con la composición del sistema inmunitario. Las diferencias se observan en el análisis de agrupación en clústeres, pero la separación entre grupos es visible con ambos métodos de agrupación en clústeres. El citorápido muestra visualmente los patrones inducidos por el tratamiento PD-L1 que incluyen una mayor abundancia de subconjuntos de células NK activados, expresando una mayor intensidad de los marcadores de activación (es decir, CD54 o CD11c).
La citometría masiva (citometría por tiempo de vuelo, o CyTOF) permite la detección de una amplia gama de biomarcadores intracelulares o extracelulares en millones de células individuales. La naturaleza de alta dimensión de los datos de citometría de masas requiere ciertas herramientas de análisis, como las técnicas de agrupación de células como SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5y scaffold maps6. Además, se han desarrollado diversas técnicas basadas en la reducción de dimensionalidad (es decir, análisis de componentes principales [PCA]7,incrustación de vecino estocástico distribuido en t [t-SNE]8, incrustación jerárquica de vecinos estocásticos [HSNE]9, aproximación y proyección uniformes [UMAP]10,y mapas de difusión11) para mejorar la velocidad, interpretación y visualización de conjuntos de datos de alta dimensión.
El análisis posterior de los datos citométricos de masa y flujo de alta dimensión a menudo carece de procesos automáticos para realizar pruebas estadísticas sobre la frecuencia del clúster y los vínculos con los resultados clínicos. Anteriormente, desarrollamos un flujo de trabajo basado en R conocido como Cytofast12,que permite análisis visuales y cuantitativos posteriores de las técnicas de clustering por Cytosplore o FlowSOM.
El protocolo descrito aquí aclara el uso de Cytofast en R y muestra cómo generar mapas de calor cuantitativos y cualitativos y gráficos. Además, facilita la determinación de las conexiones entre los fenotipos inmunes observados y los resultados clínicos. Este informe también describe el análisis de un conjunto de datos de citometría de masa específico mediante dos procedimientos de agrupación en clústeres diferentes: FlowSOM y Cytosplore. Mediante el uso de citorápido con ambos métodos de agrupación en clústeres, se muestra correspondientemente que el fenotipo de activación de las células NK está influenciado por el bloqueo del punto de control inmune PD-L1.
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentos Animales de LUMC y se ejecutaron de acuerdo con las directrices de experimentación animal de la LUMC de acuerdo con las directrices de los comités holandeses y europeos.
NOTA: Para la configuración experimental, los ratones C57BL/6 fueron inoculados por vía subcutánea en el flanco derecho con el tumor de colon murino MC38 a una concentración de 0,3 x 106 células/200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de 10 días, cuando los tumores eran palpables, los ratones fueron tratados con anticuerpos de bloqueo PD-L1 (clon MIH-5, 200 g/ratón, inyección intraperitoneal) o fueron tratados simuladamente. Los tumores fueron resecados 3 días después de la inyección de PD-L1, procesados ex vivo, y analizados por citometría de masas CyTOF utilizando 38 marcadores13.
1. Equipo y software para el análisis de datos
NOTA: Utilice un ordenador (Windows 7 o posterior) y el procesador I5 a 2,4 GHz o equivalente, memoria instalada RAM 6 GB y 10 GB de espacio libre en el disco duro. El paquete R Cytofast utiliza funciones existentes: principalmente flowCore, pheatmapy ggplot. Las líneas de comando que se ejecutarán en R se incluyen en el protocolo. El recurso para las instrucciones de R se puede encontrar en https://education.rstudio.com/.
2. Creación de clústeres
NOTA: Para mostrar los dos métodos de agrupación cytosplore y FlowSOM con citorápido,se analizan las células NK (CD161+) en el microambiente tumoral 3 días después del tratamiento con PD-L1.
3. Visualización: Análisis de clustering posterior al procesamiento
NOTA: Este paso es un método que es común a ambos métodos de agrupación en clústeres. Por lo tanto, se puede realizar después de la agrupación en clústeres con FlowSOM o Cytosplore.
El flujo de trabajo Citofast (Figura 1) está destinado a proporcionar una visión cuantitativa y cualitativa de los datos agrupados originalmente por software de análisis (es decir, FlowSOM o Cytosplore). Cytofast ejecuta varias salidas posibles, incluido el mapa de calor de todos los clústeres identificados en el análisis y basado según la expresión de marcador(Figura 2 y Figura 3). El dendrograma en la parte superior representa la similitud jerárquica entre los clústeres identificados. El panel superior muestra otro mapa de calor que muestra la cantidad relativa de subconjuntos correspondientes en cada muestra. El dendrograma de la derecha muestra la similitud entre las muestras y se basa en el clustering jerárquico realizado en las distancias euclidianas entre las muestras. Los mapas de calor combinados se muestran para FlowSOM seguido de Citofast en la Figura 2 y para Cytosplore seguidos de Cytofast en la Figura 3. Cytofast también se puede utilizar para presentar los datos cuantitativamente y mostrar los resultados en diagramas de caja (mediante la función cytoBoxplots), como se muestra en la Figura 4 y la Figura 5.
Se encontraron grupos similares entre los dos métodos diferentes (por ejemplo, el cluster 8 de Cytosplore corresponde al cluster 10 de FlowSOM),y la co-expresión de algunos marcadores inhibitorios como PD-1 y LAG-3 seguían siendo visibles en ambos métodos). Ambos métodos de agrupación en clústeres permitieron la discriminación entre PD-L1 vs. Ratones tratados con PBS. Por el contrario, se pueden resaltar algunas diferencias entre ambos métodos. FlowSOM identifica 2 clústeres (MHC-II+), mientras que Cytosplore muestra solo un clúster (MHC-II+dim). Esto se debe a la estrategia de gating inicial en la que las células NK se encerradon manualmente en las células CD161+, luego procesadas por FlowSOM. Sin embargo, Cytosplore agarredó automáticamente las células del CD45+ población en el primer nivel HSNE, que luego se agruparon en un nivel jerárquico más alto. Por lo tanto, Cytosplore definió los subconjuntos de celdas NK con mayor precisión que cómo se centraba el gating manual en CD161. Sin embargo, se conservó el clustering jerárquico de las muestras, como se muestra en el dendrograma de la derecha, lo que indica que la segregación entre los dos grupos (PD-L1 y PBS) no dependía del método de agrupación en clústeres elegido.
El número de clústeres se puede definir manualmente utilizando ambos métodos. Cytofast permite al usuario evaluar la heterogeneidad de sus datos y puede proporcionar información sobre cómo elegir el número de clústeres en los que se deben dividir los datos. Otras características se incluyen en el paquete Cytofast, como la función msiPlot (paso 3.4.2), que muestra la gráfica de intensidad de señal mediana (MSI) de cada marcador por grupo(Figura 6 y Figura 7). Esta función permite la detección de cambios globales, como aumentos en la expresión de CD54 o CD11c en celdas NK del grupo tratado con PD-L1. Las características opcionales se pueden incorporar en el paquete Cytofast, como mostrar datos en gráficos de barras y otros métodos de representación de datos. Este último requiere la adición de herramientas ggplot, que pueden ser generadas por R.
Figura 1: Flujo de trabajo del paquete Cytofast. Los datos fueron generados por citometría de masas de un tumor 3 días después del tratamiento con inmunoterapia o sin tratar. Se compararon dos técnicas de agrupación en clústeres diferentes: Cytosplore y FlowSOM. El citorápido se utilizó para visualizar las diferencias entre las dos técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visión general del clúster y abundancia de clústeres por grupo analizado por Cytofast siguiendo Cytosplore. Mapa térmico de todos los cúmulos de células NK (CD161+ células definidas automáticamente por Cytosplore),que se identificaron 3 días después de la inmunoterapia (PD-L1). Los datos mostrados se basan en la agrupación en clústeres de Cytosplore y se agrupan a partir de los grupos no tratados y tratados con PD-L1. Los niveles del marcador de expresión transformado en ArcSinh5 se muestran en una escala de arco iris. En el panel inferior, la abundancia relativa de cada muestra se representa mediante la escala de verde a púrpura. El dendrograma de la derecha representa la similitud entre las muestras en función de las frecuencias de subconjunto. La escala de frecuencia representa la dispersión de la media. Una frecuencia baja o alta se representa mediante un color verde o púrpura, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visión general del clúster y abundancia de clústeres por grupo analizado por Cytofast después de FlowSOM. Mapa de calor de todos los cúmulos de células NK (pre-cerrado en CD161+ eventos), que fueron identificados 3 días después de la inmunoterapia (PD-L1). Los datos mostrados se basan en la agrupación en clústeres de FlowSOM y se agrupan a partir de los grupos tratados no tratados y PD-L1. Los niveles del marcador de expresión transformado en ArcSinh5 se muestran en una escala de arco iris. En el panel inferior, la abundancia relativa de cada muestra se representa mediante la escala de verde a púrpura. El dendrograma de la derecha representa la similitud entre las muestras en función de las frecuencias de subconjunto. La escala de frecuencia representa la dispersión de la media. Una frecuencia baja o alta se representa mediante un color verde o púrpura, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representación de citorrápida con diagramas de caja de los clústeres definidos por Cytosplore. La frecuencia de cada clúster se representa en una gráfica de caja, separada en los dos grupos (PBS y PD-L1). Un punto individual corresponde a un ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Representación de citovelocidad con diagramas de caja de los clústeres definidos por FlowSOM. La frecuencia de cada clúster se representa en una gráfica de caja, separada en los dos grupos (PBS y PD-L1). Un punto individual corresponde a un ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Distribución de las gráficas de intensidad de señal de las células NK cerradas automáticamente por Cytosplore. La distribución de las intensidades de la señal se muestra en un histograma para tres marcadores específicos: CD45, CD11c y CD54. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Distribución de las gráficas de intensidad de señal de las células NK silenciadas automáticamente por FlowSOM. La distribución de las intensidades de la señal se muestra en un histograma para tres marcadores específicos: CD45, CD11c y CD54, segregados por los grupos PBS y PD-L1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivos Suplementarios 1.1–1.8. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivos Suplementarios 2.1–2.10. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo Suplementario 3. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivos Suplementarios 4.1–4.8. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo Suplementario 5. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Los autores no tienen nada que revelar.
Cytofast es una herramienta de visualización utilizada para analizar la salida de la agrupación en clústeres. Cytofast se puede utilizar para comparar dos métodos de agrupación en clústeres: FlowSOM y Cytosplore. Cytofast puede generar rápidamente una visión cuantitativa y cualitativa de los datos de citometría de masa y resaltar las principales diferencias entre los diferentes algoritmos de agrupación en clústeres.
Reconocemos la financiación de la Comisión Europea de un premio H2020 MSCA con el número de propuesta 675743 (ISPIC). Agradecemos a Tetje van der Sluis e Iris Pardieck por probar el protocolo.
| Computadora | Dell | NA | NA |
