破壊法を用いた溶液分散無機ナノ粒子の短いペプチド吸着の研究

Summary

生体分子無機固相相互作用を理解する第一歩は、吸着性吸着を確立することによって評価され得る基本的な物理化学的定数を明らかにする。液相からの吸着は、運動、表面容量、pH、および競合吸着によって制限され、吸着実験を行う前に慎重に検討する必要があります。

Abstract

無機有機相互作用の基礎は、バイオテクノロジーや医学の活用に適した新しい生体インターフェースの発見と開発において極めて重要です。最近の研究では、タンパク質が限られた吸着部位を介して表面と相互作用することが示されています。アミノ酸やペプチドなどのタンパク質断片は、複雑な生体高分子と無機表面との相互作用モデリングに使用できます。過去30年間、等温滴定熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴(SPR)、水晶結晶マイクロバランス(QCM)、全内部反射蛍光(TIRF)、減衰全反射反射分析(ATR)など、これらの相互作用の物理的化学基礎を測定するために、多くの有効で敏感な方法が開発されました。

吸着測定のための最も簡単で最も手頃な方法は、溶液分散吸着剤と接触した後のソルベート濃度(枯渇)の変化が計算され、吸着されると仮定される枯渇法です。枯渇データに基づく吸着吸着吸着は、すべての基本的な物理化学的データを提供する。しかし、溶液からの吸着は、高い比表面積を有する運動制限や吸着剤により、より長い平衡時間を必要とするため、ほとんど写的な固定面面面には適用できません。さらに、溶媒の不安定性、ナノ粒子凝集体、吸着結晶性、ナノ粒子サイズ分布、溶液のpH、吸着の競合などの要因を、ペプチドの吸着を研究しながら考慮する必要があります。枯渇データの等吸い方の構造は、文字通りすべての可溶性ソルベートのための包括的な物理化学データを提供しますが、高価なセットアップを必要としないため、最もアクセス可能な方法論のままです。本稿では、無機酸化物に対するペプチド吸着の実験的研究の基礎的なプロトコルを説明し、プロセスに影響を与えるすべての重要な点をカバーする。

Introduction

無機表面とペプチドの相互作用は、材料科学と医学において重要度が高いため、過去50年間、多くの注目を集めてきました。生物医学研究は、再生医療、組織^,工学^,,11、2、3、³および移植^{24、5、6、7}に直接的な影響を及ぼすバイオ無機表面の適合性と安定性に⁴焦点^6を7当てています。⁵センサやアクチュエータなどの現代の生体応答デバイスは^,、酸化物半電界^{8、9、10、11、12、139,}に固定化された機能性タンパク質に基^{10,1112,づいています}。⁸タンパク質産生のための現代の精製の慣行は、しばしば下流の精製および分離¹⁴における生体分子相互作用特性に依存する。

複数の無機酸化物の中でも、二酸化チタンは、生物学的に関連する基質^15,16,16と組み合わせて最も利用されている。TiO₂ベースのバイオインターフェースの分野における研究は、タンパク質およびペプチドの生物学的および構造的特性を変化させることなく、強力かつ特異的な結合を確立することに集中してきました。最終的には、主な目的は、チタンベースのバイオテクノロジーおよび医療用途¹⁷の作成を進める高い安定性と機能性を有する高表面密度層である。

チタン及びその合金は、数ナノメートルの厚さの表面TiO2層が耐食性であり、生体₂内の多くの用途^{18、19、2019,20}において高レベルの生体適合性を示すため、少なくとも60¹⁸年間外科用インプラント材料として広く使用されてきた。二酸化チタンは、タンパク質およびペプチドを伴う核化および無機相成長が有望な触媒および光学特性^{21、22、23、2422,23,}を有する物質を提供²¹し得るバイオミネラライゼーションで産生される無機基質とも広く考えられている。²⁴

特に無機物質と生体分子とタンパク質TiO2相互作用との相互作用の関連性が高いことを考₂えると、TiO2上のタンパク質の吸着の操作および制御に取り組む研究が多く行われている。₂これらの研究により、この相互作用のいくつかの基本的な特性が明らかになっており、例えば吸着運動、表面被覆、および生体分子の立体構造など、生体界^55,1313のさらなる進歩を支持する。

しかし、タンパク質の複雑さは、タンパク質の無機表面との分子レベル相互作用の完全な決定と理解にかなりの制限を加えます。生体分子が限られた部位を通じて無機表面と相互作用すると仮定すると、既知の構造とアミノ酸配列を有するタンパク質の中には、その成分-ペプチドとアミノ酸に還元されたタンパク質が別々に研究されている。これらのペプチドのいくつかは、有意な活性を示しており、以前のタンパク質分離^{25、26、27、28、29、3026,27,28,29,30}を必要とせずに吸着研究のユニークな対象となっている。²⁵

TiO2または他の無機表面上のペプチド吸₂着の定量的特徴付けは、過去数十年間生体分子に特異的に適応された物理的方法によって達成することができる。これらの方法には、等温滴定熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴(SPR)、水晶結晶マイクロバランス(QCM)、全内部反射蛍光(TIRF)、減衰された全反射率分光(ATR)が含まれており、いずれもキー熱力学データを提供して吸着強度を検出することを可能にする: 結合定数、ギブフリー、エンピロトリー、³¹

無機材料への生体分子の吸着は、2つの方法で達成することができる:1)ITCと枯渇方法は、固定された巨視的表面に結合する溶液中に分散した粒子を使用する。2) SPR、QCM、TIRF、ATRは、金被覆ガラスや金属チップ、水晶結晶、硫化亜鉛結晶、PMMAチップなどの無機材料で改変された巨視面をそれぞれ使用します。

等熱滴定熱量測定(ITC)は、溶液または異種混合物の滴定時に発生または消費される熱を測定するラベルフリーの物理的方法です。感度の高い熱量測定細胞は、100ナノジュールの小さな熱効果を検出し、ナノ粒子表面の吸着熱の測定を可能にします。連続的な加圧中のソルビントの熱挙動は、エンタルピー、結合定数、およびエントロピーを明らかにする相互作用の完全な熱力学的プロファイルを与え、所与の温度32、33、34、35、36である。^{32,33,34,35,36}

表面プラズモン共鳴(SPR)分光法は、研究した表面に近接した媒体の屈折率の測定に基づく表面感受性光学技術である。これは、可逆吸着および吸着層の厚さを監視するためのリアルタイムかつラベルフリーの方法です。結合定数は、関連付けと解離率から計算できます。異なる温度で行われる吸着実験は、活性化エネルギーの温度依存性に関する情報を提供し、逐次的に他の熱力学パラメータ^{37、38、3938,39}を提供することができる。³⁷

水晶結晶マイクロバランス(QCM)法は吸着および脱着プロセスの間に圧電結晶の振動頻度の変化を測定する。結合定数は、吸着率と脱離速度定数の比から評価してもよい。QCMは相対質量測定に使用されるため、キャリブレーション^{25、27、4027}を必要^と40しません。²⁵QCMは気体および液体からの吸着のために使用される。液体技術は、QCMを様々に修正された表面⁴¹上の沈着を記述する分析ツールとして使用することを可能にする。

全内部反射蛍光(TIRF)は、内部反射されたエバネッセント波で励起された吸着蛍光の測定に基づく、感度の高い光学的界面技術です。この方法は、数十ナノメートルの程度の厚さで表面を覆う蛍光分子の検出を可能にし、それが様々な表面^42、43,43上の高分子吸着の研究に使用される理由である。吸着および脱着時の蛍光動態の所でのモニタリングでは吸着運動薬を提供し、したがって熱力学データ^42,43,43を提供する。

減衰された全反射率(ATR)は、1,600および1,525^cm-1のリジンスペクトルバンドに基づいてリジン吸着性吸着性吸着を確立するためにロディック・ランジロッタによって使用された。_TiO2上のペプチドに対する結合定数をin situ赤外線法⁴⁴を用いて決定したのは初めてである。この技術はポリリジンペプチド⁴⁵及び酸性アミノ酸⁴⁶に対する吸着吸着を確立するのに有効であった。

上記の方法とは異なり、吸着パラメータをその場で測定する場合、従来の実験では、吸着した生体分子の量は、表面が溶液に接触した後の濃度変化によって測定される。吸着のケースの大半でソルビントの濃度が減衰するため、この方法は枯渇法と呼ばれます。濃度測定には、ソルベートの固有の分析特性に基^,づくか、または標識47、48、49、50またはその^47,48,49誘導体化^51、52,52に基づく検証された分析アッセイが必要です。⁵⁰

QCM、SPR、TIRF、またはATRを用いた吸着実験では、吸着試験に用いるチップとセンサの表面の特別な準備が必要です。調製された表面は、酸化物表面の必然的な水和またはソルベートの可能な化学吸着のために、吸着物を切り替えた際に一度使用する必要があり、変更が必要です。一度に 1 つのサンプルを ITC、QCM、SPR、TIRF、または ATR を使用して実行できますが、枯渇法では数十個のサンプルを実行でき、サーモスタット容量と吸着性によって量が制限されます。これは、大規模なサンプルバッチまたは生物活性分子のライブラリを処理する際に特に重要です。重要なことに、枯渇法は高価な機器を必要とせず、サーモスタットのみを必要とします。

しかし、その明らかな利点にもかかわらず、枯渇法は面倒に思えるかもしれない複雑な手続き的な機能を必要とします。本稿では、枯渇法を用いてTiO2に対するジペプチド吸着の包括的な₂物理化学的研究を行う方法を提示し、研究者が関連する実験を行う際に直面する可能性のある問題に対処する。

Protocol

1. ジペプチドストック溶液および希釈液の調製

1. 16 mMジペプチド溶液の調製
   1. 滅菌高分子試験管にジペプチド(Ile-His)の0.183 g(材料表を参照)を入れ、2倍蒸留水(DDW)で35mLに希釈し、激しい攪拌下で室温(RT)で溶解する。
      注:ジペプチドが攪拌しながらDDWに溶解しない場合は、ジペプチド溶液を超音波浴に入れ、数分間超音波処理します。
   2. 滅菌試験管内のDDWの50 mLに乾燥2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸の0.533 gを溶解することにより、2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液の50 mM溶液を調製します。N200mgの水酸化ナトリウムをDDWの100mLに溶解して、50mMの水酸化ナトリウム溶液を調製します。
   3. 16 mMのジペプチド溶液に50mM MES、または50mM水酸化ナトリウムを慎重に添加して、予備溶解ジペプチド溶液のpHを7.4に調整し、RTで攪拌し、pHメーターでpHをモニタリングします。pHを調整した後、測定シリンダーに溶液を注ぎ、試験管をすすいで、DDWから40 mLで測定シリンダーを充填して、16mMの最終濃度を作ります。
2. 16 mMストック溶液からのジペプチド希釈液の調製
   1. DDWで16 mMジペプチド溶液を希釈することにより、0.4〜12.0mMの濃度でペプチド希釈液を調製します。例えば、8 mMジペプチド溶液を調製するために、16 mMジペプチド溶液の10 mLに7 mLのDDWを加える。希釈後、ジペプチド溶液に50 mM MESまたは50 mM NaOHドロップを加えてpHを7.4に調整します(ステップ1.1.3を参照)。pHを調整した後、測定シリンダーに溶液を注ぎ、試験管をすすいで、測定シリンダーをDDWで20 mLまで満たしてジペプチド濃度を8mMにします。
      注:濃度0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0、8.0、および12.0 mMの16 mMジペプチドストック溶液の他の希釈液は、図1に従って調製される。各ジペプチド溶液pHを7.4に調整する工程1.1.3に記載されている。

2. チタニアゾルの調製

1. 500 mLのDDWに1.066 gのMESを溶解して、MESバッファーの10 mM溶液を調製します。pHメーターでpHを撹拌し、監視する際に乾燥水酸化ナトリウムでpHを7.4に調整します。
2. 200 mgのナノ結晶性 TiO₂をモルタルで5分以上粉砕する(材料表を参照)。
3. 地上の二酸化チタンナノ粒子の40mgを実験室フラスコに計量する。実験室のスタンドを使用して、フラスコを超音波処理浴に入れます(材料表を参照)。
4. TiO₂でフラスコに10 mM MESバッファーの20 mLを追加し、超音波浴中の超音波処理(5 L、40 kHz、120 W)20分間。

3. 混合と熱処理

1. サーモスタット (材料表を参照) を希望する温度 (例: 0.00、10.00、20.00、30.00、または 40.00 °C) に設定します。
2. マークされた吸着バイアルにTiO₂の超音波ソルの1 mLを追加します。押出ポリスチレンフォームで作られたその場しのぎの浮遊装置に対応するジペプチド希釈に対してマークされた吸着バイアルを置きます。少なくとも5分間、マーキングされたバイアルと対応するジペプチド希釈液を備えた浮遊装置をサーモスタットに入れる。
3. 各ジペプチド希釈液を対応する印付き吸着バイアルに1 mL添加し、すべての混合溶液が同じ温度であることを確認します。吸着平衡を達成するために、サーモスタット上の一連の吸着サンプルを0.00、10.00、20.00、30.00、または40.00°Cで24時間保持します。
   注:サーモスタットに入れる前に、得られた分散液のすべてのサンプルを慎重に振ってください。
4. 時折、熱硬化中に手動で振ることによってTiO₂分散液を混合する。

4. 熱式サンプルのろ過

1. 温度誘発性の再調整を避けるために、サーモスタットから一度に1つのサンプルを取り出して濾過します。
2. 注射器を用いた各ガラスバイアルから、注射針を介してジペプチド溶液のサンプルを採取する。注射器から針を取り出し、シリンジフィルター(材料表を参照)に入れて、ジペプチド溶液をガラスバイアルにフィルターします。他のサンプルと一緒にろ過を繰り返します。
3. セクション5に従って濾液を分析する。
   注:それは数分かかり、濃度平衡の変化を引き起こす可能性があるため、サンプルを遠心分離しないでください。

5. 誘導体化およびHPLC分析

1. アセトニトリルでトリフルオロ酢酸(TFA)の50 mL溶液を作ります。測定シリンダーに0.34 mLのTFAを加え、RTでアセトニトリルで溶液の体積を50 mLに調整します。
   注意:排ガス換気を伴うヒュームフードの下でTFAを使用すると、トリフルオロ酢酸は吸入すると有害であり、重度の皮膚火傷を引き起こし、低濃度⁵³でも水生生物に有毒であるため、
2. 299 μL のフェニルイソチオシアネートと 347 μL のトリエチルアミンを段階的なシリンダーに入れ、溶液の体積を 50 mL に調整して、RT でアセトニトリルで 50 mL に調整することにより、誘導体化溶液 (すなわち、エドマン試薬⁵⁴⁾を調製します。
3. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析の前に、クロマトグラフィーバイアル内のエドマン試薬でサンプルを誘導体化します。400 μL のサンプルをエドマンの試薬 400 μL と混合します。サンプルを60°Cで15分間加熱します。加熱後、TFA溶液225 μLでサンプルを中和し、数分間待ってサンプルをRTに冷却します。
4. HPLC分析(材料表を参照)を使用して、吸着前および吸着後のジペプチド溶液の濃度を決定します。分析した溶液を用いてクロマトグラフィーバイアルをHPLCオートサンプラに配置し、ソフトウェアで設定された必要な条件でサンプルの分析を開始します(材料表を参照)。
   注:移動相は、脱イオン水と純粋なアセトニトリルの0.1%TFAで構成され、アセトニトリル勾配は20〜90%から286nmで13分間、各サンプルを三重で分析します。既に確立された較正曲線を用いてジペプチド溶液濃度を測定する(図2)。クロマトグラフィーの仕様については、シュチェロコフら⁵⁵を参照してください。

Representative Results

ナノ結晶性二酸化チタンに対するジペプチドの吸着を、0−40°Cの温度範囲で生体適合条件で研究した。二酸化チタン表面上の実験的ジペプチド吸着(A,mmol/g)を、次のように評価した。

ここでC₀およびC_eは、それぞれミリモルにおけるジペプチドの開始および平衡濃度である。Vは、リットル中のジペプチド溶液の体積です。m は、グラム単位の吸着剤の重量です。

ジペプチド吸着の測定値は、ヘンリーモデルを用いて処理されたデータであった。このisothermモデルは、吸着表面上で互いに分離されたソルベート分子と比較的低い濃度での吸着を前提としており、実験データを記述するのに適している(図3)。ただし、このモデルは可逆吸着の場合にのみ適用でき、これも確認する必要があります。IR-分光法は、複数回リンスされた材料のこの目的に適している。TiO₂および溶液上で得られた平衡ペプチド量は、線形方程式に従って関連しています。

ここでK_Hはヘンリーの吸着定数である。

平衡結合定数_KHはジペプチド平衡濃度(C_e)上のジペプチド吸着(A)の依存性の傾きから得た。各温度Tの標準ギブス自由エネルギー(ΔG、kJ/mol)は、Van't Hoff方程式を通じて決定されました。ΔG

ここでRはJ/mol*Kの理想的なガス定数であり、Tはケルビンの吸着プロセスの温度である。

ジペプチドギブス遊離エネルギーは各温度で決定される(図4)軸を用いた線形回帰の傍受としてエンタルピー(ΔH)を開示した。回帰変数、プロセスのエントロピー(ΔS)は、基本的な方程式から導き出されました。

平衡結合定数_(KH)、標準Gibbsエネルギー(ΔG)、エンタルピー(ΔH)、およびエントロピー(ΔS)の計算値を表1に示す。

図1:16mMジペプチドストック溶液の希釈。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:異なるジペプチド濃度での較正曲線。ジペプチド濃度は0.4〜16.0 mMの間であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:各温度についてヘンリーモデルによって計算されたジペプチド吸着吸着ジペプチド吸着は、それぞれ(A)0°C(B)10°C(C)20°C(D)30°C、および(E)40°Cで吸着する。ABCD計算された相関係数^(R2)は、得られたヘンリーモデルの全ての方の範囲0.96-0.99に落ちました。誤差範囲は、三重で測定された各サンプル濃度の95%信頼区間を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:温度に対するジペプチド吸着の標準的なギブス自由エネルギーの依存。誤差範囲は、ヘンリー モデルに基づく間接測定として、ギブス自由エネルギーの 95% 信頼区間を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

T、 K	KH	ΔG00、kJ/モル	ΔH00、kJ/モル	ΔS00、kJ/モルK
273.15	0.32 ± 0.01	2.6 ± 0.0	- 41 ± 9	- 0.16 ± 0.03
283.15	0.25 ± 0.01	3.2 ± 0.1
293.15	0.17 ± 0.06	4.3 ± 0.9
303.15	0.050 ± 0.002	7.6 ± 0.1
313.15	0.037 ± 0.002	8.3 ± 0.1

表1:ジペプチド吸着の熱力学的パラメータ。

Discussion

アイザム構造のソリューションからの吸着は、高い比表面積を有する運動制限および吸着剤による平衡化に長い時間を要する。また、アミノ酸を吸着しながら、ゾルの不安定性、ナノ粒子凝集体、結晶性、ナノ粒子サイズ分布、溶液のpH、吸着の競争を考慮する必要があります。しかし、枯渇法を用いた吸着アイソマ構造は、高価なセットアップを必要としないため、最も利用可能な方法論であり続け、しかも文字通りすべての可溶性ソルベートに対して徹底的な物理化学データを提供する。

結晶性材料を吸着剤として使用する場合、吸着モード(すなわち、溶液分散粒子または固定面上)の間で区別を行う必要があります。マクロ的に平らな表面と粒子上の結晶顔の分布に大きな違いがあると予想すべきです。ナノ粒子上のペプチドの吸着から決定される熱力学パラメータは、マクロ的に平坦な表面へのペプチド吸着の熱力学的パラメータに対応しない場合がある。

無機表面に吸着するペプチドの平均量は極めて低い。室温では、この値は平方メートル²⁸あたり数百マイクログラム程度です。この少量の吸色物は、よく発達した表面を用いて正確な測定方法と固体を必要とします。したがって、大きな比表面(数百平方メートル)を有する小粒子物質は、吸着実験^{43、56、57、58、59、6056,57,58,59,60}に使用されるべきである。⁴³

ペプチドは、タンパク質のように不安定であり、狭い範囲の条件で機能を保持します。吸着実験は、正常で機能する生物と同様の、生体適合温度0°C-40°C(273.15K-313.15K)でナノ結晶性二酸化チタンに対して行った。高い温度または低い温度での吸着は無関係であり、実験のために考慮されるべきではありません。

多機能生物学的活性化合物はまた、表面電荷に影響を及ぼすため、電荷を有する官能基^61、62、63の間のクーロン相互作用に⁶¹影響を及ぼすため^、培地のpHに対して高い感受性^を63示す。また、酸化物材料の吸着電荷は、水和面⁶⁴での活性プロトン交換によるpH依存性もある。吸着平衡用のpH安定条件を確立するためには、緩衝液の使用が必要である。本研究では、MES緩衝液は非配位性⁶⁵に使用され、リン酸緩衝液⁶⁶とは異なり、金属酸化物表面への吸着にペプチドと競合しない。

この最近のアミノ酸吸着の試験は、ナノ粒子上の主要な結合部位が表面欠陥⁵⁵であることを示している。表面上の欠陥分布はナノ結晶性基質の最も制御が少ない特徴の1つであり、吸着研究で一貫性を保つために、同じバッチからの吸着剤を使用する必要があります。

QCM、プラズモン共鳴、およびITCは、分光法の組み合わせで表面との相互作用中に吸湿の構造的特殊性を明らかにする微妙な感度を持つ本物の方法です。しかし、彼らは運動制限を克服せず、吸着平衡を達成するためにかなりの時間を必要とします。さらに、一度に 1 つのサンプルしか処理できないので、バッチサンプルの分析は困難です。一方、提示される枯渇法は単純でサーモスタット容量のみに限定され、多数のサンプルの処理が可能になります。

温度誘発性の再調整を避けるために、サーモ記載のサンプルはサーモスタットから取り除かれるとすぐに濾過する必要があります。新しい温度での平衡化には数時間かかる場合がありますが、吸着サンプルを別の温度に保つ必要があります。上清分離のためのサンプルの遠心分離も、それは数分かかると濃度平衡の変化を引き起こす可能性があるため、推奨されません。フィルター材料の選択は、ソルベートの性質に依存し、最大の回復のための可能なフィルタ結合を減らす必要があります。特定のフィルターを選択する際には、ベンダーの指示と推奨事項に従うことをお勧めします。

さらに、吸着研究における濃度変化は、質量分析、電波分光法、またはUV可視分光法を用いた検証済みの定量法を用いて監視する必要があることを念頭に置く必要があります。吸着物が分光活性であれば分析が容易であり、それ以外の場合は吸着物の追加の標識化または誘導体化が必要である。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid	TCI Chemicals	4432-31-9	MES, >98%
Acetonitrile	Panreac AppliChem		HPLC grade
Chromatography vials			glass
Dipeptide Ile-His	Bachem	4000894
Double-distilled water			DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD"	J.P. Selecta	3000865	5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector	Shimadzu, LC-20 Prominence		HPLC
Isopropanol	Sigma-Aldrich (Merck)	67-63-0	99.70%
LabSolutions Lite	Shimadzu	223-60410	Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2			Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate	Acros Organics	103-72-0	PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column	ZORBAX LC		150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter	Vladfilter		25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube			polypropylene
Thermostat TC-502	Brookfield		Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine	Sigma-Aldrich (Merck)	121-44-8	TEA; 99%
Trifluoroacetic acid	Panreac AppliChem	163317	TFA, 99%