Artículo de método

Imaging Dpp Liberación de un disco de ala Drosophila

DOI:

10.3791/60528

⸱

30 de octubre de 2019

 , 
1Department of Pediatrics, University of Colorado School of Medicine

En este artículo

Resumen

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El momento de la exposición a los ligandos puede afectar sus consecuencias en el desarrollo. Aquí mostramos cómo tomar imágenes de una proteína morfogenética ósea Drosophila (BMP) llamada Dpp de las células del disco del ala.

Resumen

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La superfamilia transformadora de Factor de Crecimiento-beta (TGF-) es esencial para el patrón embrionario temprano y el desarrollo de estructuras adultas en organismos multicelulares. La superfamilia de TGF-o incluye TGF, proteína morfogenética ósea (BMP), Activinas, Factores de Crecimiento y Diferenciación, y Nodals. Durante mucho tiempo se ha sabido que la cantidad de ligando expuesto a las células es importante por sus efectos. Se pensó que los gradientes de concentración de largo alcance establecen un patrón embrionario. Sin embargo, recientemente ha quedado claro que el momento de la exposición a estos ligandos también es importante para sus consecuencias transcripcionales posteriores. Un ligando superfamiliar TGF-o no puede tener una consecuencia de desarrollo hasta que se libera de la célula en la que se produjo. Hasta hace poco, era difícil determinar cuándo estos ligandos se liberaban de las células. Aquí mostramos cómo medir la liberación de un BMP Drosophila llamado Decapentaplegic (Dpp) de las células del primordium del ala o disco de ala. Este método podría modificarse para otros sistemas o ligandos de señalización.

Introducción

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Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son esenciales para la embriogénesis temprana y el patrón de las estructuras adultas. Los BMP se producen y secretan para afectar la transcripción de los genes diana necesarios para el crecimiento y la diferenciación celular en las células que responden. Decapentaplegic (Dpp) es un homólogo Drosophila de BMP4 que es importante para el desarrollo de estructuras embrionarias y adultas como el ala1,2,3,4. Varios grupos se han centrado en el papel de Dpp en el patrón de las alas de mosca adultas porque 1) las alas se componen de dos hojas de epitelia transparente con un patrón de venación consistente que se puede evaluar fácilmente; 2) los discos de alas también son razonablemente planos, se pueden cultivar fuera de la larva, y son fáciles de imaginar y cuantificar las diferencias en el patrón; y 3) el desarrollo del patrón de ala es sensible a Dpp de tal manera que pequeñas perturbaciones en la vía afectarán el patrón de venación del ala.

Dpp se produce en celdas situadas en el límite anterior/posterior del disco de ala5,6,7,8. Dpp se une a un complejo de tipo 1 y tipo 2 receptores de serina/threonina quinasa9,10. Tras la unión Dpp, el receptor tipo 2 fosforila el receptor tipo 1 que luego fosforila a las madres contra Dpp (Mad), un homólogo Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un co-Smad adicional (Medea), que le permite entrar al núcleo donde regula los genes diana, dando lugar a efectos aguas abajo como la proliferación o diferenciación4,11.

Recientemente, el Bates Lab ha demostrado que la liberación incorrecta de Dpp dentro del disco del ala puede conducir a una disminución en la fosforilación Mad, reducción en la expresión génica objetivo, y defectos de patrón de ala12,13. Varios canales iónicos impactan el desarrollo del ala Drosophila y las estructuras asociadas14,15. Estos canales iónicos también podrían estar involucrados en la versión Dpp. Al determinar el mecanismo de liberación de morógeno, es importante que haya un método para visualizar eventos de liberación.

Los doctores Aurelio Teleman y Stephen Cohen crearon una proteína de fusión Dpp-GFP que es capaz de rescatar la pérdida de Dpp, lo que significa que es biológicamente activa y se libera de una manera biológicamente relevante16. Aquí, describimos cómo visualizamos los eventos de lanzamiento de Dpp usando este Dpp-GFP. Esta proteína de fusión es particularmente útil porque GFP es sensible al pH de tal manera que cuando está en vesículas ácidas, la fluorescencia se afeita17. Por lo tanto, cuando una proteína etiquetada con GFP se libera de una vesícula en el entorno extracelular más neutro, la intensidad de la fluorescencia de GFP aumenta17. Aprovechamos la sensibilidad al pH de GFP para determinar si Dpp-GFP reside en vesículas ácidas. Hemos dado imágenes de discos de ala que expresan Dpp-GFP antes y después de la adición de cloruro de amonio, que neutraliza las vesículas de los compartimentos intracelulares18. Encontramos un aumento significativo en la fluorescencia de puncta después de la adición de cloruro de amonio, lo que sugiere que el Dpp-GFP intracelular se apadece antes de la adición de cloruro de amonio18. Concluimos que el Dpp-GFP intracelular reside en compartimentos ácidos ligados a la membrana, como vesículas, y no se quega al adicionar cloruro de amonio para neutralizar el pH de los compartimentos intracelulares18. Esto hace que la imagen en vivo de Dpp-GFP sea una técnica útil para visualizar la dinámica de Dpp en el disco de ala Drosophila a medida que se libera de los compartimentos ácidos en el entorno extracelular.

Aquí, describimos el método que usamos para visualizar eventos de lanzamiento de Dpp mediante Dpp-GFP. Dpp-GFP se puede expresar en su patrón nativo en discos de ala Drosophila utilizando el sistema UAS-GAL419. Este es el método que se utilizó para determinar que los canales Irk afectan a la versión18de Dpp. Validamos el método mediante pilas z de imágenes en vivo. No vemos Dpp-GFP puncta moviéndose dentro del plano de enfoque en series temporales si adquirimos en un plano de enfoque. Tampoco vemos el movimiento de Dpp-GFP puncta si pusimos una imagen en una pila z. Concluimos que el Puncta Dpp-GFP visto usando este método son eventos de liberación en lugar de movimiento de vesículas intracelularmente. Este método de imagen en vivo de Dpp-GFP podría utilizarse potencialmente para probar otros modificadores putativos de la liberación de Dpp para su impacto en la dinámica de Dpp o podría ser modificado para mirar la dinámica de otros ligandos

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Protocolo

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1. Recolectar Huevos para Generar Larvas para la Disección

  1. Cross 30-40 virgen hembra Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu vuela a 10-15 macho Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
    NOTA: Los dos genotipos que contengan Dpp-GAL4 y UAS-Dpp-GFP podrán utilizarse siempre que los equilibradores tengan marcadores larvarios que permitan seleccionar la progenie adecuada durante la etapa larval.
  2. Para recoger los huevos, voltee las moscas cruzadas en un vial fresco de alimentos y déjelos poner durante 3-4 horas antes de retirarlos del vial. Para fomentar la puesta de huevos, se puede añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura hecha de levadura granulada mezclada con una pequeña cantidad de agua en la parte superior de los alimentos antes de que las moscas se introduzcan en el vial. El mismo conjunto de moscas cruzadas se puede mantener y utilizar hasta 7 días de colecciones de huevos.
    NOTA: Cualquier receta estándar de alimentos de harina de maíz Drosophila debe ser aceptable. Se utiliza aquí la receta de alimentos descrita por Hazegh y Reis20.
  3. Mantener los viales de recogida de óvulos a 25 oC durante aproximadamente 144 h hasta que las larvas se encuentren en la tercera etapa instar (wandering).
  4. Para seleccionar las larvas apropiadas para la disección (aquellas que expresan Dpp-GAL4 y UAS-Dpp-GFP) primero elija las larvas que no son Tb. Estas larvas tendrán una longitud normal en lugar de cortas y grasas.
  5. Entre las larvas no-Tb habrá larvas que expresan CyO-GFP y larvas que expresan Dpp-GFP. Para seleccionar el Dpp-GFP que expresa larvas, verlos bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Mientras que tanto Dpp-GFP como CyO-GFP express ingre distienen algo de fluorescencia de GFP, las larvas que expresan Dpp-GFP pueden distinguirse en que el GFP está restringido a los discos de las alas y la fluorescencia es mucho menos brillante que las larvas que expresan CyO-GFP. Seleccione estas larvas menos brillantes para la disección.

2. Preparación de la solución para imágenes y disección larvales

  1. Para imágenes en vivo de discos de alas, prepare medios HL3 modificados21 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2 dishidrato, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM de trehalosa dyhidrato, 115 mM de sacarosa, 5 mM HEPES). Este medio permite que el disco del ala se mantenga vivo para la toma de imágenes21.
  2. Ajuste el pH a 7.1 usando HEPES y filtre con un filtro de 0,22 m. Utilice este medio tanto para las disecciones de disco de ala como para el medio de montaje para imágenes en directo.

3. Preparación de diapositivas para montaje en disco de ala

  1. Coloque dos piezas de cinta incolora de doble cara en anchura a través de una diapositiva del microscopio, dejando un espacio de aproximadamente 5 mm entre ellas. Los trozos de cinta deben ser lo suficientemente largos como para que los extremos de la cinta se encuentren al ras con los bordes de la diapositiva del microscopio.
  2. Utilice un borde plano (como el extremo del mango de un par de fórceps de disección) para presionar la cinta firmemente a la diapositiva para que ningún medio pueda seep debajo de ella.
  3. Coloque 25 s de medios HL3 modificados entre las dos piezas de cinta. El disco del ala se montará en esta gota de soporte entre trozos de cinta para que la cinta impida que el cubreobjetos aplaste el disco(Figura 1A).

4. Dissecting y montaje de discos de ala para imágenes

  1. Diseccionar larvas en el medio HL3 modificado preparado26.
  2. Rasgar suavemente las larvas por la mitad usando dos pares de fórceps y desechar la mitad posterior de la larva.
  3. Agarre la mitad anterior de la larva con un par de fórceps y use otro par de fórceps cerrados para empujar los ganchos bucales de nuevo en la larva hasta que la larva esté completamente invertida.
  4. Los discos de las alas se pueden encontrar más fácilmente buscando las curvas afiladas en las dos ramas primarias de color más oscuro de la tráquea que corren por ambos lados de las larvas. Los discos de las alas se encuentran directamente debajo de estas curvas en las tráqueas en una larva invertida.
  5. Retire suavemente los discos de las alas y transfieralos a los 25 ml de medios HL3 de la corredera del microscopio preparada. Es importante asegurarse de que no queden trozos de tráquea unidos a los discos de ala diseccionados, ya que esto puede hacer que los discos floten, lo que dificulta la imagen.
  6. Coloque el disco del ala para que el lado peripodial de la bolsa del ala esté orientado hacia arriba lejos de la diapositiva del microscopio con el disco acostado (ver Figura 1A,B).
  7. Cubra el disco de ala y la cinta con un cubreobjetos y cierre la cubierta con esmalte de uñas. Una vez que el esmalte esté seco, proceda inmediatamente a los pasos de imagen a continuación.

5. Versión de Dpp por imágenes

  1. Imagen del disco de ala montado utilizando un microscopio de escaneo láser confocal con un objetivo de aceite de 40x y láser de 488 nm. El Dpp-GFP debe aparecer como una franja de fluorescencia GFP por el centro del disco del ala con una pequeña puncta de Dpp-GFP que se libera de esta franja central de células.
  2. Recopile imágenes a una velocidad de 2 Hz durante 2 minutos para visualizar la liberación de Dpp. Para obtener los mejores resultados, establezca el láser en un entorno lo suficientemente fuerte como para obtener una imagen clara de las células liberadoras de Dpp para evitar el exceso de blanqueo durante la recolección de imágenes. Las imágenes se pueden recopilar como una serie temporal que luego se puede exportar como archivos AVI (sin compresión, 3 fotogramas / s) para obtener archivos de vídeo de la versión Dpp.

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Resultados

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La Figura 2 muestra los resultados representativos de las imágenes en vivo de este protocolo. Cuando el protocolo es exitoso, Dpp-GFP se puede ver como una franja en el centro del disco de ala con núcleos visibles como círculos no fluorescentes dentro de la región Dpp-GFP(Figura 2). La liberación de Dpp-GFP es visible como puncta fluorescente que aparecen y desaparecen. Hemos observado fluorescencia Dpp-GFP apareciendo y desapareciendo en los cuerpos celulares y...

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Discusión

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Los BMP como Dpp tienen un impacto significativo cuando se unen a un complejo de receptores unidos a la membrana para causar una cascada de señalización intracelular en células vecinas o aparentemente distantes. El laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha demostrado que las células que producen las células de contacto de señal Dpp que reciben la señal utilizando estructuras delgadas de filapodia basadas en actina llamadas citonmes15,24,...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Sarala Pradhan por trabajar en una versión anterior de este protocolo. Nos gustaría agradecer a NSF-IOS 1354282 por la financiación mientras desarrollamos este protocolo. Nos gustaría agradecer a NIH-NIDCR RO1DE025311 por financiar nuestro laboratorio actualmente.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Levadura de panaderíaRed Star   
CaCl2 dihidratoFisher ScientificC79-500
CubreobjetosVWR484-457
Cinta adhesiva de doble caraAgar
Tipo IIApex66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb HuEste stock pronto estará disponible en Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb HuEsta culata pronto estará disponible en Bloomington Drosophila Stock Center
Pinzas Dumont #5World Precision InstrumentsPinzas 500233 para diseccionar
HEPESSigma AldrichH3375
KClFisher ScientificAC193780010
Jarabe de maíz ligeroKaro
Extracto de maltaBreiss
MgCl2Fisher ScientificAC223210010
portaobjetos SigmaAldrichS8400
NaClFisher ScientificS271-500
NaHCO3RPIS22060-1000.0
Esmalte de uñasElectron Micsroscopy Sciences72180
Ácido propiónicoVWRU330-09
Harina de sojaADM Ingredientes especiales062-100
SacarosaFisher ScientificS5-3
SacarosaFisherS512
TegoseptGenesee Scientific20-259
Trehalosa dihidratadaChem-Impex Internacional, Inc.00766
Harina de maíz amarilloQuaker
Microscopio confocal Zeiss LSM 780Zeisspara imagen en vivo
Microscopio Zeiss SteREO Discovery.V8 MicroscopioZeisspara disecciones
Drosophila Escocés Microscopio

Referencias

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  1. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
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  6. Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
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