El momento de la exposición a los ligandos puede afectar sus consecuencias en el desarrollo. Aquí mostramos cómo tomar imágenes de una proteína morfogenética ósea Drosophila (BMP) llamada Dpp de las células del disco del ala.
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Artículo de método
Imaging Dpp Liberación de un disco de ala Drosophila
En este artículo
Resumen
Resumen
La superfamilia transformadora de Factor de Crecimiento-beta (TGF-) es esencial para el patrón embrionario temprano y el desarrollo de estructuras adultas en organismos multicelulares. La superfamilia de TGF-o incluye TGF, proteína morfogenética ósea (BMP), Activinas, Factores de Crecimiento y Diferenciación, y Nodals. Durante mucho tiempo se ha sabido que la cantidad de ligando expuesto a las células es importante por sus efectos. Se pensó que los gradientes de concentración de largo alcance establecen un patrón embrionario. Sin embargo, recientemente ha quedado claro que el momento de la exposición a estos ligandos también es importante para sus consecuencias transcripcionales posteriores. Un ligando superfamiliar TGF-o no puede tener una consecuencia de desarrollo hasta que se libera de la célula en la que se produjo. Hasta hace poco, era difícil determinar cuándo estos ligandos se liberaban de las células. Aquí mostramos cómo medir la liberación de un BMP Drosophila llamado Decapentaplegic (Dpp) de las células del primordium del ala o disco de ala. Este método podría modificarse para otros sistemas o ligandos de señalización.
Introducción
Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son esenciales para la embriogénesis temprana y el patrón de las estructuras adultas. Los BMP se producen y secretan para afectar la transcripción de los genes diana necesarios para el crecimiento y la diferenciación celular en las células que responden. Decapentaplegic (Dpp) es un homólogo Drosophila de BMP4 que es importante para el desarrollo de estructuras embrionarias y adultas como el ala1,2,3,4. Varios grupos se han centrado en el papel de Dpp en el patrón de las alas de mosca adultas ....
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Protocolo
1. Recolectar Huevos para Generar Larvas para la Disección
- Cross 30-40 virgen hembra Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu vuela a 10-15 macho Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
NOTA: Los dos genotipos que contengan Dpp-GAL4 y UAS-Dpp-GFP podrán utilizarse siempre que los equilibradores tengan marcadores larvarios que permitan seleccionar la progenie adecuada durante la etapa larval. - Para recoger los huevos, voltee las moscas cruzadas en un vial fresco de alimentos y déjelos poner durante 3-4 horas antes de retirarlos del vial. Para fomentar la puesta de huevos, se puede añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura hecha de levadura granulada ....
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Resultados
La Figura 2 muestra los resultados representativos de las imágenes en vivo de este protocolo. Cuando el protocolo es exitoso, Dpp-GFP se puede ver como una franja en el centro del disco de ala con núcleos visibles como círculos no fluorescentes dentro de la región Dpp-GFP(Figura 2). La liberación de Dpp-GFP es visible como puncta fluorescente que aparecen y desaparecen. Hemos observado fluorescencia Dpp-GFP apareciendo y desapareciendo en los cuerpos celulares y.......
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Discusión
Los BMP como Dpp tienen un impacto significativo cuando se unen a un complejo de receptores unidos a la membrana para causar una cascada de señalización intracelular en células vecinas o aparentemente distantes. El laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha demostrado que las células que producen las células de contacto de señal Dpp que reciben la señal utilizando estructuras delgadas de filapodia basadas en actina llamadas citonmes15,24,.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Sarala Pradhan por trabajar en una versión anterior de este protocolo. Nos gustaría agradecer a NSF-IOS 1354282 por la financiación mientras desarrollamos este protocolo. Nos gustaría agradecer a NIH-NIDCR RO1DE025311 por financiar nuestro laboratorio actualmente.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Levadura de panadería | Red Star | ||
| CaCl2 dihidrato | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cubreobjetos | VWR | 484-457 | |
| Cinta adhesiva de doble cara | Agar | ||
| Tipo II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | Este stock pronto estará disponible en Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | Esta culata pronto estará disponible en Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Pinzas Dumont #5 | World Precision Instruments | Pinzas 500233 para diseccionar | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Jarabe de maíz ligero | Karo | ||
| Extracto de malta | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| portaobjetos Sigma | Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Esmalte de uñas | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Ácido propiónico | VWR | U330-09 | |
| Harina de soja | ADM Ingredientes especiales | 062-100 | |
| Sacarosa | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sacarosa | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalosa dihidratada | Chem-Impex Internacional, Inc. | 00766 | |
| Harina de maíz amarillo | Quaker | ||
| Microscopio confocal Zeiss LSM 780 | Zeiss | para imagen en vivo | |
| Microscopio Zeiss SteREO Discovery.V8 Microscopio | Zeiss | para disecciones |
Referencias
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V.
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Reimpresiones y permisos
