El propósito de este protocolo es fusionar dos tipos de células diferentes para crear células híbridas. El análisis de microscopía de fluorescencia de células fusionadas se utiliza para rastrear la célula de origen de los orgánulos celulares. Este ensayo se puede utilizar para explorar cómo la estructura celular y la función responden a la perturbación por fusión celular.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Célula-célula Fusión de Líneas Celulares Editadas genoma para la Perturbación de la Estructura Celular y la Función
En este artículo
Resumen
Resumen
La vida se divide espacialmente dentro de las membranas lipídicas para permitir la formación aislada de estados moleculares distintos dentro de las células y orgánulos. La fusión celular es la fusión de dos o más celdas para formar una sola celda. Aquí proporcionamos un protocolo para la fusión celular de dos tipos de células diferentes. Las células híbridas fusionadas se enriquecen mediante la clasificación basada en citometría de flujo, seguida de la microscopía de fluorescencia de la estructura y función de las células híbridas. Las proteínas etiquetadas fluorescentes generadas por la edición del genoma se utilizan en el interior de las células fusionadas, lo que permite identificar las estructuras celulares en función de la emisión de fluorescencia y hacer referencia al tipo de origen de la célula. Este método robusto y general se puede aplicar a diferentes tipos de células u orgánulos de interés, para entender la estructura celular y la función a través de una gama de cuestiones biológicas fundamentales.
Introducción
El mantenimiento homeostático de la estructura celular es fundamental para la vida. Las células tienen morfologías características, números de orgánulos subcelulares y composición bioquímica interna. Entender cómo se generan estas propiedades fundamentales y cómo van mal durante la enfermedad requiere herramientas de laboratorio para perturbarlas.
La fusión celular es la fusión de dos o más celdas separadas. La fusión celular puede haber sido crítica para la aparición de la vida eucariota1. En el cuerpo humano, la fusión celular es relativamente rara, que ocurre durante circunstancias de desarrollo restringidas y tip....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Etiquetado diferencial de celdas fluorescentes
- Etiquetado genético con CRISPR Cas9
- Utilice la edición del genoma CRISPR Cas9 para etiquetar la rootletina (u otros genes de interés) con las proteínas fluorescentes meGFP o mScarlet-I en líneas celulares de cáncer humano.
NOTA: Los protocolos detallados para la edición del genoma se tratan en otros lugares24,25,26.
- Utilice la edición del genoma CRISPR Cas9 para etiquetar la rootletina (u otros genes de interés) con las proteínas fluorescentes meGFP o mScarlet-I en líneas celulares de cáncer humano.
- Etiquetado de colorante fluorescente
- Cultivar células cancerosas humanas Cal51 en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Las células etiquetadas adecuadamente son visibles durante la citometría de flujo por señal de fluorescencia superior a las células de control no etiquetadas(Figura 2A). Las puertas están configuradas para la clasificación de células dobles positivas, enriqueciendo a esta población directamente en platos de imágenes para análisis microscópicos adicionales. Las células fundidas son detectables como células dobles fluorescentes positivas distin.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Demostramos un protocolo fácil y rentable para fusionar células y visualizar la arquitectura posterior de los híbridos celulares con microscopía, tardando aproximadamente dos días de principio a fin. Las partes críticas de este protocolo son el enriquecimiento de células fusionadas por clasificación celular (sección 3 del protocolo), y la validación cuidadosa de las células fusionadas por microscopía (sección 4 del protocolo). Estas secciones aseguran que las células fusionadas se obtengan fácilmente y sean heterocaryone.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una beca Wellcome Trust Henry Wellcome a R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant número 100090/12/Z). El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Ashok Venkitaraman y Paul French por su asesoramiento y orientación crítica sobre el proyecto. Agradecemos a Chiara Cossetti y Gabriela Grondys-Kotarba en las instalaciones de citometría Cambridge Institute for Medical Research Flow por su excelente apoyo. Agradecemos a Liam Cassiday, Thomas Miller y Gianmarco Contino por revisar el manuscrito.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de 15 mL | Sarstedt | 62554502 | |
| solución de formaldehído al 37% | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Microscopio Airyscan confocal de barrido | Carl Zeiss | ||
| 8 pocillos | Ibidi | 80826 | |
| Alpaca Anti-GFP Booster GFP nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Clasificador de células | BD Biosciences | ||
| Sigma-Aldrich | A7906 | ||
| Filtros celulares (70 μ m) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Rojo lejano | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violeta | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido de glucosa, GlutaMAX, piruvato | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Suero fetal bovino | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 medio de imagen independiente | Sigma-Aldrich 21083027 | ||
| Penicilina/estreptomicina | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| DMEM sin rojo fenol, alta glucosa | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) | 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O hasta 1 L | ||
| Polietilenglicol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Tubos de polipropileno | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReactivos | BP151 | tensioactivo no iónico |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | detergente no iónico |
Referencias
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
