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Artículo de método

Célula-célula Fusión de Líneas Celulares Editadas genoma para la Perturbación de la Estructura Celular y la Función

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DOI:

10.3791/60550

⸱

7 de diciembre de 2019

 , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2The Medical Research Council Cancer Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge, 3Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge

En este artículo

Resumen

El propósito de este protocolo es fusionar dos tipos de células diferentes para crear células híbridas. El análisis de microscopía de fluorescencia de células fusionadas se utiliza para rastrear la célula de origen de los orgánulos celulares. Este ensayo se puede utilizar para explorar cómo la estructura celular y la función responden a la perturbación por fusión celular.

Resumen

La vida se divide espacialmente dentro de las membranas lipídicas para permitir la formación aislada de estados moleculares distintos dentro de las células y orgánulos. La fusión celular es la fusión de dos o más celdas para formar una sola celda. Aquí proporcionamos un protocolo para la fusión celular de dos tipos de células diferentes. Las células híbridas fusionadas se enriquecen mediante la clasificación basada en citometría de flujo, seguida de la microscopía de fluorescencia de la estructura y función de las células híbridas. Las proteínas etiquetadas fluorescentes generadas por la edición del genoma se utilizan en el interior de las células fusionadas, lo que permite identificar las estructuras celulares en función de la emisión de fluorescencia y hacer referencia al tipo de origen de la célula. Este método robusto y general se puede aplicar a diferentes tipos de células u orgánulos de interés, para entender la estructura celular y la función a través de una gama de cuestiones biológicas fundamentales.

Introducción

El mantenimiento homeostático de la estructura celular es fundamental para la vida. Las células tienen morfologías características, números de orgánulos subcelulares y composición bioquímica interna. Entender cómo se generan estas propiedades fundamentales y cómo van mal durante la enfermedad requiere herramientas de laboratorio para perturbarlas.

La fusión celular es la fusión de dos o más celdas separadas. La fusión celular puede haber sido crítica para la aparición de la vida eucariota1. En el cuerpo humano, la fusión celular es relativamente rara, que ocurre durante circunstancias de desarrollo restringidas y tipos de tejido, como durante la fertilización o la formación de músculo, hueso y la placenta2. Este protocolo describe la inducción de la fusión célula-célula en líneas celulares de cultivo de tejido con orgánulos etiquetados fluorescentemente diferencialmente, como una herramienta para entender los mecanismos que controlan la estructura y la función celular.

La fusión in vitro de células celulares es fundamental para la producción de anticuerpos monoclonales3, una herramienta importante para la investigación biológica y el tratamiento de enfermedades. La fusión celular también se ha utilizado para hacer muchas preguntas biológicas fundamentales fundamentales sobre la dominancia del ciclo celular4, aneuploidía5,6, reprogramación celular7,8, la reparación de las neuronas dañadas9, proliferación viral10, apoptosis11, tumorigénesis12, dinámica citoesquelética13, y membrana de fusión14,15. Los métodos basados en laboratorio para inducir la fusión célula-célula16,17,18,19 inducen la carbonescencia de la membrana lipídica a través de la fusión física de dos bicapas en una. La fusión celular puede ser inducida por electricidad18, métodos virales basados17, calentamiento termoplasmónico20, expresión transgénica19, y productos químicos incluyendo polietilenglicol (PEG)16,21,22.

Los centros son centros organizadores de microtúbulos que controlan la forma celular, la motilidad, la polarización y la división23. Las raíces centrosómicas son estructuras fibrosas que se extienden a partir de centrosomas que contienen la proteína rootletina24 (codificada por el gen CROCC). Recientemente usamos la fusión de células celulares para entender cómo la posición y el número de centrosomas varían dentro de heterocaryons en relación con las células parentales24. La razón de ser de este método es rastrear la célula de origen de las raíces dentro de un heterokaryon después de la fusión de células parentales etiquetadas diferencialmente fluorescentes, y así imaginar la fusión y físsion de los orgánulos. Las proteínas etiquetadas fluorescentes rootletin-meGFP o rootletin-mScarlet-I se crean mediante la edición del genoma en líneas celulares separadas que luego se fusionan mediante la fusión celular mediada por PEG. Describimos el uso de tintes celulares(Tabla de Materiales)para identificar células fusionadas por citometría de flujo y posterior identificación microscópica de fluorescencia de células centrosomasdes de origen y morfología (Figura 1). Este enfoque es un método robusto y único para estudiar cómo los cambios importantes en el estado celular incluyendo el número de organélilos afectan a la homeostasis celular.

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Protocolo

1. Etiquetado diferencial de celdas fluorescentes

  1. Etiquetado genético con CRISPR Cas9
    1. Utilice la edición del genoma CRISPR Cas9 para etiquetar la rootletina (u otros genes de interés) con las proteínas fluorescentes meGFP o mScarlet-I en líneas celulares de cáncer humano.
      NOTA: Los protocolos detallados para la edición del genoma se tratan en otros lugares24,25,26.
  2. Etiquetado de colorante fluorescente
    1. Cultivar células cancerosas humanas Cal51 en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y 100 g/ml de penicilina/estreptomicina a 37 oC y 5% deCO2 en una incubadora humidificada.
      NOTA: Es importante asegurarse de que las células se revisen regularmente para detectar la ausencia de contaminación por micoplasma, y para la identidad de la línea celular. No utilice celdas que hayan sido ampliamente pasajeras en cultivo (>15 pasajes). Las células deben estar sanas y crecer exponencialmente. Evite la confluencia excesiva o la sobreconfluencia.
    2. Seque cada tipo de celda (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I y células de Cal51 sin etiquetar parentales) de tal manera que las células de 6 x 106 estén presentes al día siguiente para cada muestra, con una confluencia del 70-90%.
      NOTA: Se trata de aproximadamente un matraz de cultivo t75 o un plato de 10 cm por tipo de célula. Las celdas parentales sin etiquetar se requieren como un control negativo más adelante en el protocolo. Este protocolo permite la producción de 20.000 celdas fusionadas, pero este número podría aumentarse mediante el escalado vertical del protocolo con un mayor número de lotes.
    3. Al día siguiente, precalentar DMEM, trippsina y 1 x solución salina con fosfato (PBS) colocándolos en un baño de agua a 37 oC.
    4. Lave las células rootletin-meGFP y rootletin-mScarlet-I 2x en PBS vertiendo o aspirando medio y reemplazándolo con 10 mL de PBS.
    5. Etiquetar células de rootletina-meGFP Cal51 añadiendo 500 nM de tinte de células violetas(Tabla de materiales)en PBS durante 1 min a temperatura ambiente (RT).
    6. Etiquete las células rootletin-mScarlet-I de Cal51 añadiendo 200 nM de tinte de células rojas lejanas(Tabla de materiales)en PBS durante 1 min en RT.
      NOTA: Mantenga las muestras protegidas de la luz siempre que sea posible después de la tinción fluorescente, para evitar el fotoblanqueo de la fluorescencia.
    7. Detenga las reacciones de etiquetado del tinte añadiendo 10 ml de DMEM durante 5 min.
    8. Retire las células Parentales Cal51 sin etiquetar de la incubadora (del paso 1.2.2).
      NOTA: Estas celdas se utilizarán más adelante como controles negativos sin etiquetar (paso 3.3.2).
    9. Lave todas las células una vez vertiendo el medio de crecimiento y reemplazándolo con 10 ml de PBS.
    10. Vierta PBS e incubar durante 5 minutos en condiciones de cultivo con 1 ml de trippsina 1x precalentada.
    11. Transfiera las células a un tubo cónico de plástico de 15 ml y centrífuga a 1000 x g durante 5 min.
    12. Retire y deseche cuidadosamente la tripsina del pellet celular con una pipeta.
    13. Resuspenda suavemente los gránulos de células etiquetadas violeta y de color rojo lejano en 1 ml de PBS.
    14. Resuspenda suavemente el pellet de células parentales (no fluorescentes) en 1 ml de DMEM y vuelva a la incubadora.
      NOTA: Esta muestra no se someterá a fusión célula-célula, pero se utilizará más adelante durante la citometría de flujo.

2. Fusión de células celulares

  1. Mezclar 3 x 106 celdas etiquetadas violetas con 3 x 106 celdas etiquetadas de color rojo lejano en un tubo de 15 ml pipeteando suavemente 0,5 ml de cada tipo de célula utilizando una pipeta de 1 ml.
  2. Centrifugar las células no mezcladas restantes del paso 2.1 a 1.000 x g durante 5 min, luego verter PBS, resuspender el pellet en 1 ml de DMEM y volver a la incubadora.
    NOTA: Estas muestras de etiqueta única no mezcladas restantes se utilizarán más adelante como controles negativos y de compensación en la sección 3 del protocolo.
  3. Centrifugar las células mixtas del paso 2.1 a 1.000 x g durante 5 min y aspirar cuidadosamente PBS usando una pipeta de 1 ml.
  4. Añadir 0,7 ml de solución PEG al 50% 1450 de forma ligera al pellet celular (paso 2.3) utilizando una pipeta de 1 ml durante un período de 30 s.
  5. Dejar actuar durante 3,5 min en RT.
    NOTA: El tiempo de incubación con PEG puede optimizarse dependiendo del tipo de célula, aunque tenga en cuenta que el tiempo de incubación más largo aumenta la toxicidad celular.
  6. Añadir 10 ml de DMEM sin suero en sentido de gota durante 30 s y dejar en la incubadora durante 10 min.
  7. Gire hacia abajo a 1.000 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente en 1 ml de medio completo (DMEM que contiene FBS).
    NOTA: Proceda directamente a la sección 3. Hay toxicidad asociada con la exposición a PEG seguida de citometría de flujo e imágenes, así que mantenga las células en condiciones de cultivo tanto como sea posible procediendo rápidamente entre pasos.

3. Clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer las células fusionadas

  1. Prepare todas las células para la citometría de flujo pipeteando suavemente cada muestra por separado a través de un filtro de 70 m en un tubo FACS.
    NOTA: Se requieren cuatro muestras: células fusionadas, células rojas lejanas etiquetadas, células violetas etiquetadas individuales, células parentales sin etiquetar. Una vez extraídas de la capucha del cultivo de tejido estéril, las células tienen la capacidad de infectarse, por lo que minimiza el tiempo de exposición de las muestras a un entorno no estéril a partir de ahora. Las celdas se ordenan en medio DMEM completo.
  2. Utilice un citómetro capaz de ordenar una sola celda.
    1. Configure el clasificador de celdas para una ordenación aséptica. Realice el control de calidad del instrumento según la recomendación del fabricante.
    2. Dibuja una gráfica de dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral y una gráfica de discriminación de doblete.
  3. Cree puertas para identificar celdas fusionadas.
    1. Emocionar los colorantes fluorescentes a longitudes de onda de 405 nm y 635 nm. Detectar a 450 nm y 660 nm (longitudes de onda violeta y de color rojo lejano, respectivamente). Trazar longitudes de onda de color rojo versus violeta.
    2. Ejecute las células parentales sin etiquetar a través del citómetro y registre la intensidad de la fluorescencia.
      NOTA: Los valores por encima de esta línea base definen la positividad para la tinción de tinte.
    3. Ejecute células violetas etiquetadas individuales a través del catómetro. Confirme que no hay derrame de violeta en el canal rojo lejano.
    4. Ejecute celdas rojas lejanas etiquetadas a través del citómetro y confirme que no hay derrame de rojo lejano en el canal violeta.
      NOTA: Para los datos representativos mostrados, las células se clasificaron a 20 psi en una clasificadora equipada con una boquilla de 100 m.
    5. Ejecute brevemente la muestra de fusión para confirmar que las celdas fusionadas son visibles con las puertas creadas en el paso 3.3.
  4. Alinee la corriente de clasificación de forma centralizada en una placa de imágenes de 8 pozos.
  5. FacS ordenar las células fusionadas, presentes como células etiquetadas de doble color violeta positivo y de color rojo lejano directamente en una placa de imágenes de 8 pozos que contiene 100 l de medio de crecimiento.
    NOTA: El número máximo recomendado de células es de 50.000 euros por plato de 8 pozos. Garantice el estado celular durante la clasificación. La confluencia celular puede influir en la salud celular, por lo que mantener las células entre el 20 y el 90 % de la confluencia después de ordenar mediante la clasificación de un número adecuado de células para la placa de imágenes. Cada gota ordenada contiene aproximadamente 3 nL de líquido de vaina. Asegúrese de que el líquido de la vaina no diluya significativamente el medio de crecimiento durante la clasificación.
  6. Inmediatamente después de la clasificación, llevar las células de vuelta a la incubadora y dejar para >2 h o durante la noche.
    NOTA: Las células adherentes se volverán a adherir gradualmente a la capa durante este período, a partir de la clasificación, y por lo tanto su morfología cambiará con el tiempo si se lleva directamente al microscopio.

4. Tinción inmunofluorescente e imágenes de fusiones de células celulares

NOTA: Las células fusionadas se pueden crear imágenes en vivo o después de la fijación y una mayor tinción fluorescente (o ambas), dependiendo de los experimentos y las mediciones requeridas.

  1. Imágenes de células vivas
    1. Reemplace el medio de crecimiento por un medio de imagen sin rojo fenol(Tabla de materiales)y proceda directamente a la toma de imágenes.
  2. Fijación y tinción
    1. Preparar paraformaldehida (PFA) fresco al 4% en PBS.
    2. Fije las células incubando en 100 s de 4% PFA durante 15 minutos en RT. Retire PFA después de 15 min.
      PRECAUCION: La PFA es tóxica cuando se inhala, por lo que este paso debe realizarse en una campana de humos con el equipo de protección personal adecuado.
      NOTA: Después de la fijación, el experimento se puede pausar y reiniciar más tarde si es necesario. Almacene la muestra a 4 oC protegida de la luz si es necesario.
    3. Lavar las células 3 veces en 200 ml de PBS a RT.
    4. Permeabilizar las células durante 10 min a RT en 200 l de tensioactivo no iónico al 0,1%(Tabla de materiales)y 0,1% detergente no iónico(Tabla de materiales)diluido en PBS.
    5. Bloquear en 200 l de albúmina sérica bovina al 3% en PBS durante 30 min a RT.
    6. Incubar con anticuerpos en 150 ml de PBS que contengan 3% de albúmina sérica bovina y un tensioactivo no iónico al 0,1% y un detergente no iónico al 0,05% durante 1 h a RT.
      NOTA: Los anticuerpos primarios utilizados para generar los resultados representativos son el nanobody anti-GFP conjugado fluorescentemente (utilizado en la dilución 1:400), y el anti-mScarlet-I nanobody conjugado fluorescentemente (utilizado en 1:500 dilución). Estos mejoran la señal de las proteínas ya fluorescentes.
    7. Lavar 2 veces durante 5 min en 300 éL de PBS y luego dejar en 200 éL de PBS.
      NOTA: Las muestras se muestran en PBS. Las muestras se pueden almacenar a 4 oC protegidas de la luz.
  3. Adquisición de imágenes
    1. Adquiera imágenes con un microscopio de fluorescencia adecuado capaz de crear imágenes de cuatro colores (por ejemplo, iluminación confocal, de campo ancho y estructurada).
    2. Emocione los canales meGFP y mScarlet-I con láseres de longitud de onda de 488 nm y 561 nm, respectivamente. Ajuste los detectores para que detecten a 505 a 550 nm y a 590 a 650 nm. Emocione los canales de tinte violeta y rojo lejano con láseres de 405 nm y 633 nm, respectivamente. Ajuste los detectores para que detecten a 430 a 500 nm y a 660 a 750 nm.
    3. Determinar empíricamente la intensidad del láser de tal manera que no se produzca un fotoblanqueo significativo y que las células permanezcan sanas (si las imágenes de células vivas).
    4. Determinar empíricamente la ganancia de tal manera que la señal se obtiene sin saturar o recortar artificialmente los valores de píxel.
    5. Recopile datos de la pila Z, de modo que las imágenes sean tridimensionales, cubriendo un rango de 20 a 60 m con un tamaño de paso de 500 m.
      NOTA: Las imágenes mostradas en los datos representativos fueron adquiridas por confocal(Figura 2B),Airyscan(Figura 2C)o microscopía de iluminación estructurada(Figura 2D). Cada célula es un heterokaryon de buena fe si contiene colorantes violetas y rojos lejanos que se superponen en el citoplasma.

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Resultados

Las células etiquetadas adecuadamente son visibles durante la citometría de flujo por señal de fluorescencia superior a las células de control no etiquetadas(Figura 2A). Las puertas están configuradas para la clasificación de células dobles positivas, enriqueciendo a esta población directamente en platos de imágenes para análisis microscópicos adicionales. Las células fundidas son detectables como células dobles fluorescentes positivas distin...

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Discusión

Demostramos un protocolo fácil y rentable para fusionar células y visualizar la arquitectura posterior de los híbridos celulares con microscopía, tardando aproximadamente dos días de principio a fin. Las partes críticas de este protocolo son el enriquecimiento de células fusionadas por clasificación celular (sección 3 del protocolo), y la validación cuidadosa de las células fusionadas por microscopía (sección 4 del protocolo). Estas secciones aseguran que las células fusionadas se obtengan fácilmente y sean heterocaryone...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una beca Wellcome Trust Henry Wellcome a R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant número 100090/12/Z). El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Ashok Venkitaraman y Paul French por su asesoramiento y orientación crítica sobre el proyecto. Agradecemos a Chiara Cossetti y Gabriela Grondys-Kotarba en las instalaciones de citometría Cambridge Institute for Medical Research Flow por su excelente apoyo. Agradecemos a Liam Cassiday, Thomas Miller y Gianmarco Contino por revisar el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 15 mLSarstedt62554502
solución de formaldehído al 37%Sigma-AldrichF8875
880 Microscopio Airyscan confocal de barridoCarl Zeiss
8 pocillosIbidi80826
Alpaca Anti-GFP Booster GFP nanobodyChromotekgba-488
BD Influx Clasificador de célulasBD Biosciences
Sigma-AldrichA7906
Filtros celulares (70 μ m)BiofilCSS010070
CellTrace Rojo lejanoThermoFisher ScientificC34572
CellTrace VioletaThermoFisher ScientificC34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido de glucosa, GlutaMAX, piruvatoThermoFisher Scientific31966021
Suero fetal bovinoSigma-Aldrich10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobodyNanoTag BiotechnologiesN1302-At565
L15 CO2 medio de imagen independienteSigma-Aldrich 21083027
Penicilina/estreptomicinaSigma-Aldrich15140122
DMEM sin rojo fenol, alta glucosaThermoFisher Scientific21063029
Solución salina tamponada con fosfato (1x PBS)8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O hasta 1 L
Polietilenglicol Hybri-Max 1450Sigma-AldrichP7181
Tubos de polipropilenoBD Falcon352063
Triton X-100Fisher BioReactivosBP151tensioactivo no iónico
TripsinaSigma-AldrichT4049
Tween 20Fisher BioReagentsBP337detergente no iónico
láser Placas de imagen de Albúmina sérica bovina

Referencias

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