Este protocolo adapta las mediciones del ciclo celular para su uso en una plataforma de citometría de masas. Con las capacidades multiparamétricas de la citometría de masas, la medición directa de la incorporación de yodo permite la identificación de células en fase S, mientras que los marcadores de ciclo intracelular permiten la caracterización de cada estado del ciclo celular en una variedad de condiciones experimentales.
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Artículo de método
Uso del análogo de pirimidina, 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU) con marcadores de ciclo celular para establecer fases del ciclo celular en una plataforma de citometría de masas
En este artículo
Resumen
Resumen
La regulación de la fase del ciclo celular es un aspecto importante de la proliferación celular y la homeostasis. La interrupción de los mecanismos reguladores que rigen el ciclo celular es una característica de una serie de enfermedades, incluido el cáncer. El estudio del ciclo celular requiere la capacidad de definir el número de células en cada porción de la progresión del ciclo celular, así como de delinear claramente entre cada fase del ciclo celular. El advenimiento de la citometría de masas (MCM) proporciona un enorme potencial para el análisis de células individuales de alto rendimiento a través de mediciones directas de isótopos elementales, y el desarrollo de un método para medir el estado del ciclo celular por MCM amplía aún más la utilidad de MCM. Aquí describimos un método que mide directamente la 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU), similar a la 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), en un sistema MCM. El uso de este MCM basado en IdU proporciona varias ventajas. En primer lugar, IdU se incorpora rápidamente en el ADN durante su síntesis, lo que permite una medición fiable de las células en la fase S con incubaciones tan cortas como 10-15 minutos. En segundo lugar, IdU se mide sin la necesidad de anticuerpos secundarios o la necesidad de degradación del ADN. En tercer lugar, la tinción de IdU se puede combinar fácilmente con la medición de ciclina B1, proteína de retinoblastoma fosforilada (pRb) e histona fosforilada H3 (pHH3), que colectivamente proporciona una delineación clara de las cinco fases del ciclo celular. La combinación de estos marcadores de ciclo celular con el alto número de parámetros posibles con MCM permite la combinación con muchas otras métricas.
Introducción
La citometría de masas permite la detección de aproximadamente 40 parámetros aprovechando la alta resolución y la naturaleza cuantitativa de la espectroscopia de masas. Se utilizan anticuerpos marcados con metales en lugar de anticuerpos conjugados fluoróforos que permiten un mayor número de canales y producen un derrame mínimo 1,2. MCM tiene ventajas y desventajas con respecto al análisis del ciclo celular en comparación con la citometría de flujo. Una ventaja importante de MCM es que el gran número de parámetros permite la medición simultánea del estado del ciclo celular a través de un gran número de tipos d....
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Protocolo
1. Preparación de las existencias de IdU
- Disuelva la 5-yodo-2'-desoxiuridina (IdU) en DMSO a una concentración de 50 mM. Filtro estéril, alícuota en tubos de 10-50 μL y conservar a -80 °C
- Retire la IdU del congelador y descongele a temperatura ambiente. Diluir IdU en RPMI-1640 para hacer una solución de trabajo a una concentración final de 1 mM. Pipetear hacia arriba y hacia abajo o vórtice para mezclar.
- Por lo general, diluya la IdU concentrada en el medio en el que se cultivan las células (por ejemplo, DMEM, IMDM, etc.) o la diluya en PBS para agregarla directamente a muestras de aspirado de sangre periférica o médula ósea. Este paso de pr....
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Resultados
Utilizando células HL-60 y un aspirado de médula ósea humana, es posible mostrar cómo las condiciones experimentales pueden afectar la distribución y el análisis del ciclo celular. En primer lugar, se debe establecer la estrategia de compuerta para demostrar cómo se derivan las fases del ciclo celular. En la Figura 1 mostramos el establecimiento de la puerta singlete, que es importante para separar los desechos celulares y los dobletes, estableciendo una población unicelular. Para las líneas.......
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Discusión
Los ejemplos presentados aquí demuestran cómo utilizar una plataforma MCM para analizar la distribución del ciclo celular. También se ha demostrado que el análisis del ciclo celular es sensible a condiciones experimentales como el tiempo y la temperatura, lo cual es una consideración importante que los investigadores deben tener al considerar MCM para su análisis del ciclo celular14. Las muestras almacenadas durante un corto período de tiempo, no más de una hora, tendrán una incorporación de IdU c.......
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Divulgaciones
El Dr. Behbehani recibe apoyo de viaje de Fluidigm. Fluidigm también ha comprado reactivos y materiales para uso en laboratorio.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer los esfuerzos de Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang y Justin Lyeberger por su apoyo experimental. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas Pelotonia. Todas las opiniones, hallazgos y conclusiones expresadas en este material son las del autor (s) y no reflejan necesariamente las del Programa de Becas Pelotonia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | A3059 | Componente de la |
| centrífuga | Thermo Scientific | 75-217-420 | Centrifugación |
| de muestras Cleftd-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identificación de células apoptóticas |
| Ciclina B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolución |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopconservtive |
| EQ Cuentas de calibración de cuatro elementos | Fluidigm | 201078 | Estándar de metal interno para el rendimiento de CyTOF |
| Tubo FACS con filtro de malla | Corning | 08-771-23 | Colador de células para eliminar grumos/residuos antes de la ejecución de CyTOF |
| Suero fetal bovino (FBS) | VWR | 97068-085 Suplemento de crecimiento de | cultivo celular |
| Helios | Fluidigm | Sistema/Plataforma CyTOF | |
| Heparina | Sigma | H3393 | Aditivo de tinción para prevenir tinciones inespecíficas |
| IdU (5-Iodo-2′-desoxiuridina) | Sigma | I7125 | Incorpora en fase S |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmación de G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Kit de etiquetado de metales, fija metales a los anticuerpos |
| Agitador de microplacas | Thermo Scientific | 88880023 | Mezcla de muestras durante la tinción |
| Paraformaldehído (PFA) | Servicios de Microscopía Electrónica | 15710 | Fijador |
| pentametilciclopentadienil-Ir(III)-dipiridofenazina | Fluidigm | 201192 | Identificación de células durante la adquisición de CyTOF |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detección de daños en el ADN |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | Resolución de fase M |
| Solución salina tamponada de fosfato (PBS) | Gibco | 14190-144 | Solución de lavado para cultivo celular y componente de solución fijadora |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | resolución G0/G1 |
| SmartTube Inc | PROT1 | Fijador de muestras | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 Medio de | crecimiento para cultivos |
| celulares Azida de sodio | Acros Organics | AC447810250 | componente de CSM/Tampón de anticuerpos, biocida |
Referencias
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Ornatsky, O. I., et al.
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Reimpresiones y permisos
