Modelo de dolor crónico post-ischemia para el síndrome de dolor regional complejo tipo I en ratas

Resumen

Aquí se proporciona un protocolo que detalla los pasos para establecer un modelo animal de dolor crónico post-isquemia (CPIP). Este es un modelo bien reconocido que imita el síndrome de dolor regional complejo humano tipo I. Se evalúan más a fondo las hipersensibilidades mecánicas y térmicas, así como los comportamientos nocifensos inducidos por la capsaicina observados en el modelo de rata CPIP.

Resumen

El síndrome de dolor regional complejo tipo I (CRPS-I) es una enfermedad neurológica que causa dolor intenso entre los pacientes y sigue siendo una condición médica no resuelta. Sin embargo, los mecanismos subyacentes del CRPS-I aún no se han revelado. Se sabe que la isquemia/reperfusión es uno de los principales factores que causa CRPS-I. Mediante la isquemia prolongada y la reperfusión de la extremidad posterior, se ha establecido el modelo de dolor post-isquemia crónico de rata (CPIP) para imitar el CRPS-I. El modelo CPIP se ha convertido en un modelo animal bien reconocido para estudiar los mecanismos de CRPS-I. Este protocolo describe los procedimientos detallados involucrados en el establecimiento del modelo de rata de CPIP, incluida la anestesia, seguido de la isquemia/reperfusión de la extremidad posterior. Las características del modelo CPIP de rata se evalúan además midiendo las hipersensibilidades mecánicas y térmicas de la extremidad posterior, así como las respuestas nocifensivas a la inyección de capsaicina aguda. El modelo CPIP de rata exhibe varias manifestaciones CRPS-I-como, incluyendo edema en las extremidades posteriores e hiperemia en la etapa temprana después del establecimiento, hipersensibilidades térmicas y mecánicas persistentes, y el aumento de las respuestas nocifensivas a la inyección aguda de capsaicina. Estas características lo convierten en un modelo animal adecuado para una investigación ulterior de los mecanismos involucrados en el CRPS-I.

Introducción

El síndrome de dolor regional complejo (CRPS) retrata los síntomas de dolor complejo y crónico resultantes de fracturas, traumatismos, cirugía, isquemia o lesión nerviosa^1,2,3. CRPS se clasifica en 2 subcategorías: CRPS tipo-I y tipo II (CRPS-I y CRPS-II)⁴. Los estudios epidemiológicos revelaron que la prevalencia de CRPS fue de aproximadamente 1:2000⁵. CRPS-I, que no muestra ningún daño nervioso obvio, puede resultar en dolor crónico y afecta dramáticamente la calidad de vida de los pacientes. Los tratamientos disponibles actuales muestran efectos terapéuticos inadecuados. Por lo tanto, crPS-I sigue siendo un problema clínico importante y desafiante que debe abordarse.

Establecer un modelo animal preclínico que imite CRPS-I es crucial para explorar los mecanismos subyacentes a CRPS-I. Para abordar esta cuestión, Coderre et al. diseñaron un modelo de rata aplicando isquemia prolongada y reperfusión a la extremidad posterior para recapitular CRPS-I⁶. Se sabe que la isquemia/lesión por reperfusión es una de las principales causas de CRPS-I^7. El modelo CPIP de rata presenta muchos síntomas similares a CRPS-I, que incluyen edema en las extremidades posteriores e hiperemia en la etapa temprana después del establecimiento del modelo, seguido con hipersensibilidades térmicas y mecánicas persistentes⁶. Con la ayuda de este modelo, se propone que la sensibilización central del dolor, la activación periférica del canal TRPA1 y la generación reactiva de especies de oxígeno, etc. contribuyan a CRPS-I^8,9,10. Recientemente establecimos con éxito el modelo de rata CPIP y realizamos la secuenciación de ARN de los ganglios de raíz dorsal (DRG) que inervan la pata trasera afectada¹¹. Descubrimos algunos mecanismos potenciales que posiblemente están involucrados en la mediación de las hipersensibilidades del dolor de CRPS-I¹¹. Además, identificamos el canal vanilloide potencial del receptor transitorio 1 (TRPV1) en las neuronas DRG como un importante contribuyente a las hipersensibilidades mecánicas y térmicas de CRPS-I^12.

En este estudio, describimos los procedimientos detallados involucrados en el establecimiento del modelo de ratas del CPIP. Evaluamos aún más el modelo CPIP de rata midiendo las hipersensibilidades mecánicas y térmicas, así como su capacidad de respuesta al desafío de la capsaicina aguda. Proponemos que el modelo CPIP de rata pueda ser un modelo animal fiable para una investigación ulterior de los mecanismos involucrados en el CRPS-I.

Protocolo

Los protocolos de los animales fueron aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad Médica China de Zhejiang.

1. Animales

1. Obtener ratas macho Sprague-Dawley (SD) (280–320 g, 8-10 semanas de edad) de Shanghai Laboratory Animal Center. Casa de los animales en Zhejiang Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica China. Tenga en cuenta que las condiciones de reproducción deben incluir ciclos de luz/oscuridad de 12 h/ 2h y mantener la temperatura constante a 24 oC. Proporcionar agua y alimentos ad libitum. Tenga en cuenta que un total de 48 ratas se utilizan en este estudio. Una nota, en este modelo, tenemos que observar la respuesta del dolor durante todo el proceso. Si se aplican analgésicos, entonces no podemos establecer con éxito el modelo de dolor. Después de los experimentos, las ratas son sacrificadas.

2. Establecimiento de modelos CPIP

1. Anestetizar todas las ratas (incluidos los grupos de modelos falsos y CPIP) con fenobarbital sódico (50 mg/kg, inyección intraperitoneal [i.p.]). Mantenga la anestesia con hasta 20 mg/kg/h fenobarbital [i.p.], si es necesario. Compruebe los reflejos de cada animal pellizcando su pata trasera o la punta de la cola usando fórceps. Asegúrese de que las ratas no son sensibles antes del establecimiento del modelo. Coloque pomada de veterinario en los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento. Colocar las ratas anestesiadas sobre una almohadilla calentada mantenida a 37oC para el siguiente procedimiento.
2. Isquemia y reperfusión de la pata trasera
   1. Lubricar la pata trasera derecha y el tobillo con glicerol una vez anestesiada.
   2. Deslice una placa tórica de nitrilo 70 durómetro con un diámetro interno de 7/32" (5,5 mm) en el lado más grande de un tubo Eppendorf de 1,5 ml (con la tapa a presión cortada antes de su uso). Inserte cuidadosamente la pata trasera en el tubo hueco de Eppendorf hasta llegar a la parte inferior.
   3. Deslice gradualmente la junta tórica desde el tubo hasta la extremidad posterior derecha cerca de la articulación del tobillo y colóquela durante 3 h. Aplicar el mismo tratamiento a un grupo falso de ratas, excepto que una junta tórica rota, que se corta y no debe inducir isquemia, debe colocarse alrededor del tobillo.
   4. Cortar la tórtela 3 h después del paso de isquemia. Vigila cuidadosamente a la rata hasta que recupere suficiente conciencia para mantener la recumbencia esternal. Tenga en cuenta que la rata que recibió anestesia no debe ser colocada de nuevo a la compañía de otras ratas hasta que se recupere por completo.

3. Pruebas de comportamiento nocifensivas

1. Coloque la rata en una cámara transparente de plexiglás que esté sentada sobre un suelo de malla. Habitua rrata durante 0,5 horas antes de cualquier prueba de comportamiento.
2. Alodinia mecánica
   1. Utilice filamentos von Frey (filamentos de 0,4, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8.0, 15,0 y 26,0 g) para la prueba. Comience la prueba desde el filamento medio (4,0 g). Aplicar verticalmente los filamentos a la superficie plantar media de la pata trasera. Aplique ligeramente una fuerza adecuada para doblar el filamento durante un máximo de 5 s. Una retracción repentina de la pata trasera en respuesta a los estímulos se considera un comportamiento nocifensivo. Realizar la prueba de alodynia mecánica en los días -3, -2, -1, y cada dos días hasta el día 13.
   2. Aplique el método de prueba descendente para probar el umbral. Aplicar el método Dixon para calcular el umbral de retirada de pata del 50% (PWT)^13,14,15.
3. Hiperalgesia térmica
   1. Utilice el método de Hargreaves para examinar la hiperalgesia térmica. Apunte directamente el haz de luz emitido desde una bombilla (50 W) a la pata trasera para medir la latencia de retirada de la pata (PWL). Establecer 20 s como umbral de corte para evitar lesiones excesivas de la calefacción.
   2. Repita cada prueba 3 veces en intervalos de 5 minutos para cada pata trasera. Tome el promedio de estas tres pruebas como el PWL de cada rata¹⁶. Realizar la prueba de hiperalgesia térmica en los días -3, -2, -1, y cada dos días hasta el día 13.
4. Comportamiento nocifensivo agudo inducido por la capsaicina
   1. Preparar la solución de stock de capsaicina (200 mM) utilizando dimetil sulfóxido (DMSO) y diluir aún más a 1:1000 en solución salina estéril con fosfato (PBS) para la inyección de pata trasera. La concentración final de DMSO en PBS es del 0,1% (el vehículo contiene 0,1% dmso solo en PBS). Inyectar capsaicina o vehículo en la pata trasera (inyección intraplantar) a un volumen de 50 ml utilizando una aguja de 30 G unida a la jeringa de 1 ml.
   2. Registre el comportamiento nocifensivo (es decir, lamer, morder o estremecer la pata inyectada) utilizando una cámara de vídeo durante 10 minutos justo después de la inyección y cuantificado posteriormente como se describió anteriormente^17,18,19.
5. Evaluación del edema de pata trasera: Evalúe el edema de pata trasera midiendo el aumento del diámetro de la pata. Mida con una pinza digital y calcule la diferencia entre el valor basal y el valor de prueba observado en diferentes puntos de tiempo. Evaluar los cambios en el espesor de la pata a 15 min, 24 h, 48 h, y 72 h después del establecimiento del modelo.

Resultados

Después de colocar la tela tórica en el tobillo, la piel ipsilateral de la pata trasera mostró cianosis, una indicación de hipoxia tisular(Figura 1A). Después de cortar la tela tórica, la pata trasera ipsilateral comenzó a llenarse de sangre y mostró hinchazón robusta, lo que demostró un intenso signo de hiperemia(Figura 1A). La hinchazón de la pata disminuyó gradualmente y volvió a la normalidad 48 h después del procedimiento i...

Discusión

Este protocolo describe los métodos detallados para establecer un modelo CPIP de rata mediante la aplicación de isquemia/reperfusión a las extremidades posteriores de las ratas. Implica la evaluación de la apariencia de las extremidades posteriores, edema, hipersensibilidades mecánicas / térmicas, y comportamientos nocifensos agudos en respuesta a la inyección de capsaicina.

La isquemia/reperfusión de extremidades es un factor común que contribuye a CRPS-I en pacientes humanos

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Eppendorf	22431021
DMSO	Sigma-Aldrich	D1435
Capsaicina	APEXBIO	A3278
digital	Meinaite	NA
Junta tórica	Juntas tóricas	Nitrilo Oeste 70 Durómetro	7/32 pulg. diámetro interno
Aparato de prueba plantar	UGO Basile, Italia	37370
filamentos von Frey	UGO Basile, Italia	NC12775

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